Введение к работе
Актуальность проблемы. Нейтрофильные лейкоциты оснащены мощной системой микробицидных факторов и как эффекторные клетки острого воспаления формируют первую линию защиты организма от инфицирующих микроорганизмов [Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989]. Наряду с уничтожением фагоцитированных микроорганизмов эти клетки способны поражать микробы и в околоклеточном пространстве путем секреции (экзоцитоза) биоцидных факторов. Экстрацеллю-лярные факторы лейкоцитов могут вновь захватываться клетками (ней-трофилами и макрофагами) и использоваться для усиления антимикробного действия последних, то есть их "довооружения" (arming) [Heifetz е.а., 1980; Zabucchi е.а., 1989; Klebanoff, 1992]. Этот феномен впервые открыт в России и получил название "резорбтивной резистентности фагоцитов" [Пигаревский В.Е., 1978]. С другой стороны, наличие биоцидных факторов нейтрофилов в экстрацеллюлярном пространстве является основной причиной повреждения собственных тканей организма в очаге воспаления [Маянский Д.Н., 1991]. Ключевая роль в уничтожении поглощенных микроорганизмов, в инактивации микробов во внеклеточной среде очага воспаления, а также при сопутствующем повреждении тканей нейтрофилами принадлежит миелоперокси-дазе (МПО) — ферменту, продуцирующему наиболее разрушительные формы "активного кислорода" (АФК) [Weiss, 1983]. Основным механизмом, ограничивающим повреждающее действие МПО в очаге воспаления, признана система антиоксидантнои защиты организма [Halliwell, 1994]. Физиологические ингибиторы МПО-катализа до настоящего времени не известны. В условиях исчерпания ресурса анти-оксидантов в очаге воспаления, генерируемые ферментом АФК приобретают собственное патогенетическое значение при многих заболеваниях [Halliwell, 1992]. Сведения о наличии других механизмов, подавляющих негативный эффект экстрацеллюлярной МПО, отсутствуют. Мы предположили, что один из способов ограничения повреждающего действия МПО в очаге воспаления может быть сопряжен с механизмо-м резорбтивной резистентностью фагоцитов и опосредован захватом клетками фермента из внешней среды. Однако на поверхности лейкоцитов отсутствуют специфические рецепторы к МПО (в отличие от ряда других факторов нейтрофилов), а белки-переносчики этого фермента к
фагоцитам неизвестны. В рамках феномена "резорбтивной резистентности" наиболее рациональным путем поражения микроба представляется одновременный захват клеткой объекта фагоцитоза и МПО. Поэтому при поиске белков-возможных переносчиков фермента фагоцитам представляло интерес исследовать в первую очередь возможность взаимодействия МПО с белками плазмы крови, выполняющими функции опсонинов, то есть с белками, способными связываться с объектом фагоцитоза и рецепторами лейкоцитов. В качестве основных объектов исследования были выбраны белки, играющие ключевую роль при осуществлении фагоцитарной реакции — фибронектин (ФН) и иммуноглобулины.
Наличие сродства опсонинов к МПО могло бы иметь важное значение в рамках антимикробной и антиоксидантной систем защиты организма. Во-первых, это концентрирование экстрацеллюлярной МПО вблизи патогена в околоклеточном пространстве, что перенацеливало бы общее биоцидное действие фермента преимущественно в микроби-цидное. Во-вторых, захват клеткой МПО в комплексе с патогеном обеспечил бы поражение последнего уже в фагосоме лейкоцита, что могло бы иметь особое значение для уничтожения микроорганизмов, предотвращающих слияние фагосомы с гранулами фагоцита, содержащими бактерицидные факторы. Наконец, сродство МПО к опсонинам выполняло бы роль механизма для удаления МПО из околоклеточного пространства и уменьшения ее повреждающего действия на окружающие ткани.
Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы состояла в изучении возможности взаимодействия МПО с опсонинами и в выяснении общих закономерностей такого взаимодействия. При наличии данного эффекта (как базисного для усиления микробицидно-го потенциала фагоцитов и подавления повреждающего действия МПО) на основе выявленных закономерностей предполагалось наметить пути для конструирования новых подходов в антиоксидантной терапии и способов коррекции функционирования микробицидных систем.
Непосредственными задачами работы являлись:
-
Определение количества молекул МПО в нейтрофиле и в МПО-содержащих гранулах, а также концентрации фермента в последних.
-
Исследование влияния экстрацеллюлярной МПО на функциональную активность нейтрофилов.
-
Определение возможности комплексообразования МПО с ФН, IgG, IgM.
-
Оценка параметров комплексообразования МПО с опсонинами.
-
Изучение влияния лигандов ФН на взаимодействие ФН с МПО.
-
Определение способности ФН ассоциировать белки, модифицированные продуктом МПО-катализа — гипохлоритом.
-
Сравнительная оценка устойчивости супероксиддисмутазы (СОД) и ее пролонгированных форм к действию лейкоцитарных АФК.
Научное значение и новизна работы.
-
В ходе работы определено ранее неизвестное количество молекул МПО в нейтрофиле и в пероксидазосомах клетки, а также концентрация фермента в этих органеллах.
-
Впервые установлено модулирующее действие экстрацеллюляр-ной МПО в отношении нейтрофилов: стимуляция фагоцитоза и подавление продукции супероксидных радикалов в присутствии компонентов плазмы крови.
-
Выявлена способность МПО образовывать комплексы с ключевыми опсонинами плазмы крови: ФН, IgM и IgG. Определены равновесные кинетические параметры комплексообразования МПО с ФН и IgG (Kd и mt), а также термодинамические параметры взаимодействия МПО с ФН (AG0, АН и AS0). Установлено, что "движущей силой" комплексообразования МПО с ФН является энтропийная составляющая свободной энергии (-TAS).
-
Установлено, что опсонины, кооперируя друг с другом (ФН и IgG) по механизму комплексообразования, образуют новые МПО-свя-зывающие участки с резко усиленным сродством к ферменту.
-
Дополнен спектр естественных лигандов ФН: показано, что к их числу следует отнести МПО и окислительно модифицированные гипохлоритом (продуктом МПО-катализа) белки.
-
Установлена способность ФН ингибировать секрецию нейтро-филами МПО.
-
Расширено представление об организации системы антиоксидан-тной защиты, куда включены механизмы, лимитирующие образование АФК в процессе утилизации молекулярного кислорода; механизмы, ингибирующие специализированные генераторы АФК; а также новый каталитический механизм, нацеленный на уничтожение наиболее реакционных АФК (метионилсульфоксидредуктазный цикл). Данный ре-докс-цикл потенциально способен как участвовать в редокс-регулятор-
ных процессах, так и контролировать уровень протеолитической деструкции.
-
Обосновано наличие каталитического механизма продукции син-глетного кислорода, опосредованного МПО, снимающее противоречие между регистрируемым уровнем генерации этого агента фагоцитирующими нейтрофилами и мощностью известных некаталитических механизмов образования данного оксиданта.
-
Предложен механизм сочетанной продукции миелопероксидазой синглетного кислорода и гипохлорита, объясняющий причину сложной структурной организации этого фермента и необходимость редокс-взаимодействия между его субъединицами, а также генерацию сходных количеств обоих оксидантов фагоцитирующими нейтрофилами.
10. Расширены представления о механизмах гуморально-клеточной
кооперации при воспалении за счет обоснования наличия у белков-
участников защитных реакций не только "профессиональных" эффек-
торных, но и регуляторных функций. Приведена аргументация в пользу
сигнальной роли АФК лейкоцитов как модуляторов функций защит
ных клеток.
Научно-методическое значение работы.
-
Разработан комбинированный аффиннохроматографический метод одновременного выделения высокоочищенных препаратов ФН и плазминогена (ПГ), позволяющий получать более гомогенные и стабильные препараты ФН, чем лучшие зарубежные аналоги.
-
Разработан универсальный метод получения высокоочищенной МПО (метод апробирован при использовании в качестве сырья лейкоцитарной массы периферической крови человека и свиньи, а также свежезаготовленного и криоконсервированного костного мозга).
-
Модифицированы традиционные методы очистки IgG и IgM путем включения этапов, позволяющих удалить электрофоретически не-регистрируемые примеси.
-
Разработан метод прямой иммобилизации ФН на матрицу носителя.
-
Разработан метод получения иммобилизованного ФН с единообразной ориентацией em молекул на поверхности сорбента путем использования в качестве спейсера одного из лигандов этого белка.
-
Модифицирован метод реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) для выявления связывающей способности поливалентных белков.
Практическое значение работы. Работа носит в основном экспериментально-теоретический характер. Результатом проведенных исследований явилось объяснение многих неясных аспектов кооперации гуморальных факторов с лейкоцитами и лейкоцитарными факторами. Получены также результаты, характеризующиеся практической направленностью для биотехнологии и медицины:
-
Предложенный нами метод одновременной очистки ФН и ПГ легко поддается масштабированию и может быть использован в качестве первого этапа в производствах препаратов крови без нарушения их технологических схем. Данный метод не влияет на качество исходного сырья, истощая его (плазму крови) лишь от целевых для этого метода белков: ФН и ПГ.
-
Разработан более адекватный критерий оценки устойчивости различных препаратов СОД для антиоксидантної! терапии, чем базирующиеся на оценке рН- и термостабильности фермента, и учитывающий реальную окислительно-деструктивную обстановку в очаге воспаления: степень чувствительности фермента к повреждающему действию НгОг, НО' и гипохлорита (субстрата и продуктов МПО-катали-за).
-
Разработан экспресс-метод оценки биосовместимости гемокон-тактных материалов для эфферентной терапии, а также индивидуальной чувствительности пациента к таким материалам. Метод основан на определении интенсивности продукции АФК лейкоцитами крови.
-
Разработан способ повышения биосовместимости гемоконтакт-ных материалов, предусматривающий использование антиоксидантов в гемоперфузионных методах лечения.
-
Предложен новый подход для антиоксидантної! терапии, потенциально обеспечивающий концентрирование СОД в патологических участках и одновременное подавление активности генераторов АФК.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Данные о количестве молекул МПО в нейтрофилах и их перок-сидазосомах — основа для реальной оценки биоцидного потенциала этих клеток и их ресурса как источника МПО, выделяемой в околоклеточное пространство.
-
Субъединичная организация молекулы МПО обеспечивает соче-танную каталитическую продукцию синглетного кислорода и гипохлорита, определяет уникальные ферментативные и биоцидные свойства этой пероксидазы.
-
Взаимодействие экстрацеллкйярной МПО с опсонинами плазмы крови — потенциальный механизм довооружения клеток этим ферментом, обеспечивающий снижение повреждающего действия МПО в очаге воспаления.
-
Система антиоксидантной защиты организма включает не только традиционные молекулы-антиоксидангы, но и факторы, ингибиру-ющие и элиминирующие специализированные и неспециализированные генераторы АФК, а также филогенетически сформированные механизмы утилизации молекулярного кислорода без образования его токсических форм.
-
Белки-участники защитных реакций, наряду с их "профессиональными" эффекторными функциями, способны выполнять роль молекул-сигнализаторов, а также выступать в качестве предшественников биологически активных пептидов. Эти их свойства могут использоваться в механизмах сопряжения гуморальных и клеточных реакций при развитии воспаления.
Апробация работы. Материалы, использованные в диссертационной работе, докладывались и представлялись на конференции "Механизмы интеграции биологических систем", Ленинград, 1977; на Всесоюзном симпозиуме "Окислительные ферменты животной клетки", Горький, 1978; на 3-м Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзи-мологии, Астрахань, 1979; на 1-м Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; на конференции "Вопросы эволюционной физиологии", Ленинград, 1982; на 6-м Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов", Рига, 1983; на конференции "Механизмы нервной интеграции", Ленинград, 1984; на Всесоюзном симпозиуме "Система мозговых и внемозговых пептидов", Ленинград, 1984; на Всесоюзной конференции "Создание и внедрение малоотходной технологии производства антибиотиков", Москва, 1984; на 3-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции лизосом", Тбилиси, 1986; на заседании Ленинградского отделения Всесоюзного общества иммунологов, Ленинград, 1988; на Юбилейной сессии кафедры биохимии Ленинградского ун-та, Ленинград, 1989; на Международной конференции "Medical Biotechnology, Immunization and AIDS", St.Petersburg, 1991; на 1-м Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992; на конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии", С.-Петербург, 1993; на Международной конференции "Biotechnology St.Petersburg'94", С.-Петербург, 1994; на Международной конференции "19th European Cystic Fibrosis Conference",
France, Paris, 1994; на заседании секции С.-Петербургского биохимического общества, С.-Петербург, 1994; на 3-й Международной конференции "AIDS, Cancer and Related Problems", St.Petersburg, 1995; на конференции "Актуальные вопросы военноморской и клинической медицины", С.-Петербург, 1995; на Международном конгрессе "Intern. Congr. on Free Radicals in Health and Disease", Turkey, Istanbul, 1995; на ежегодном собрании международного общества по кислороду "Oxygen'95", USA, Pasadena, 1995; на 8-м международном двухгодичном собрании "VIII Bienial Meet. Int. Soc. Free Radical Res.", Spain, Barcelona, 1996; на 3-м Съезде трансфузиологов России, С.-Петербург, 1996; на 2-м Биохимическом съезде, Москва, 1997. Тезисы сообщений опубликованы в материалах съездов, конференций и симпозиумов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 66 печатных работ (включая 9 проблемно-теоретических статей и 1 главу монографии).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 265 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (описания материалов и методов исследования, результатов собственных иследований и их обсуждения), проблемно-теоретической части, заключения, выводов и списка цитированной литературы (433 источника). Материал диссертации проиллюстрирован 14 таблицами и 32 рисунками.
