Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1 Использование различных типов переносчиков для адресной доставки и создания пролонгировнных форм препаратов 8
1.1.1. Адъюванты 8
1.1.2. Моноклональные антитела 9
1.1.3. Макромолекулярные переносчики 10
1.1.4. Липосомы и другие микрокапсулы 11
1.1.5. Липосомалъная форма митоксантрона 15
1.1.6. Изменение концентрации митоксантрона в плазме после
введения липосомального или свободного митоксантрона in vivo 16
1.1.7. Эритроциты как переносчики лекарственных препаратов 18
1.1.8. Примеры использования эритроцитов в качестве переносчиков лекарственных репаратов 19
1.2. Способы получения эритроцитов, нагруженных лекарственными препаратами 22
1.3. Сведения о лекарственных препаратах, использованных
в данной работе 25
1.3.1. Митоксантрон 25
1.3.2. Фактор IXсистемы свертывания крови 26
Постановка задачи 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы 32
2.1 Материалы 32
2.2. Методы 33
2.2.1. Получение эритроцитов нагруженных митоксантроном 33
2.2.2. Приготовление лизатов эритроцитов 33
2.2.3. Приготовление хлороформных экстрактов проб 33
2.2.4. Измерение концентрации свободного гемоглобина ЪА
2.2.5. Измерение выхода митоксантрона из загруженных эритроцитов 34
2.2.6. Измерение распределения эритроцитов по плотностям в суспензиях с различной концентрацией митоксантрона 34
2.2.7. Биотинилирование препарата фактора IX 35
2.2.8. Определение степени биотинилирования фактора IX 35
2.2.9. Включение биотинилированного фактора IXв эритроциты 36
2.2.10. Изучение фармакокинетики биотинилированного препарата фактора IX 37
2.2.11. Измерение концентрации биотинилированного препарата фактора IX в плазме и внутри эритроцитов 37
ГЛАВА 3. Результаты 40
3.1. Загрузка митоксантрона в эритроциты 40
3.2. Влияние температуры на кинетику загрузки эритроцитов митоксантроном 40
3.3. Влияние гематокрита суспензии на эффективность загрузки митоксантрона в эритроциты 41
3.4. Выход депонированного митоксантрона из эритроцитов 42
3.5. Влияние присутствия митоксантрона на сохранность эритроцитов 44
3.5.1. Влияние температуры инкубации и концентрации митоксантрона на скорость гемолиза нагруженных эритроцитов 44
3.5.2. Влияние митоксантрона на распределение эритроцитов по плотностям 45
3.6. Включение биотинилированного фактора IX в эритроциты 47
3.7. Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного фактора IX, введенного внутривенно в виде раствора 48
3.8. Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного фактора IX, включенного в эритроциты 49
3.9. Расчет времени полувыведения фактора включенного в эритроциты 49
ГЛАВА 4. Обсуяодение 54
4.1. Создание новой лекарственной формы антрациклинового антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов-носителей 54
4.2. Антигемофильный фактор IX, включенный в эритроциты 56
Заключение 58
Выводы 59
Список литературы
- Использование различных типов переносчиков для адресной доставки и создания пролонгировнных форм препаратов
- Получение эритроцитов нагруженных митоксантроном
- Влияние температуры на кинетику загрузки эритроцитов митоксантроном
- Создание новой лекарственной формы антрациклинового антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов-носителей
Введение к работе
В современной фармакологии все более отчетливо проявляются две ведущие тенденции: 1- создание методов направленной («адресной») доставки фармакологических препаратов; 2 - разработка новых лекарственных форм для создания в организме человека депо фармакологических препаратов, обеспечивающих постепенное высвобождение препарата, получение пролонгированного эффекта, повышение терапевтической эффективности препарата, а также снижение его токсичности.
Определяющую роль в решении этих задач играют переносчики лекарственных средств. Они позволяют не только создать депонированную форму введенного соединения, но и защитить лекарство от преждевременного разрушения и инактивации ретикулоэндотелиальной системой организма; предотвратить или уменьшить иммунные и аллергические реакции организма на введенный препарат; осуществлять его направленный транспорт в органы и ткани-мишени.
Одной из важнейших предпосылок для успешного применения различных лекарственных препаратов, фармакологически или физиологически активных веществ (ФАВ) является специфичность их действия. Однако большая часть этих лекарственных соединений взаимодействует также и со значительным числом неспецифических мишеней. Это обстоятельство было наглядно продемонстрировано на примере химиотерапии онкологических заболеваний. Медленный прогресс в этой области является следствием неспособности практически всех цитотоксических веществ действовать исключительно на злокачественные клетки [2]. Низкая избирательность лекарственного препарата требует повышения дозы вводимого вещества, чтобы обеспечить его терапевтическую эффективность. Это приводит к усилению общего токсического действия препарата на организм и часто сопровождается развитием лекарственной устойчивости опухолевых или патологически измененных клеток к стандартным формам препарата. Включение лекарства в несущие микрокапсулы или аутологичные клетки-носители снижает пиковые концентрации свободного препарата в крови в момент введения, что понижает его токсическое действие, а также способствует снижению иммунного ответа организма на препарат, т.е. препятствует быстрому развитию устойчивости по отношению к введенному лекарству.
Переносчики лекарственных препаратов должны удовлетворять всем требованиям, которые предъявляются к любым веществам, вводимым в организм. Они должны быть нетоксичны, не иметь, или иметь минимальные побочные эффекты и быть способными к биодеградации - разложению и выведению продуктов переработки переносчика системами организма. В этом отношении одними из самых перспективных переносчиков являются собственные клетки организма, и, в первую очередь, эритроциты. Они легко могут быть вьщелены из крови, где присутствуют в больших количествах, обладают достаточно длительным временем жизни и, по мере старения, подвергаются в организме естественному процессу биодеградации. Таким образом, эритроциты являются перспективными носителями лекарственных препаратов, которые, в зависимости от поставленных задач, могут обеспечить пролонгированное действия лекарства, снижение его токсичности или иммунного ответа организма на введенный препарат. Все это делает задачу разработки новых лекарственных форм на основе эритроцитов-носителей очень перспективной и актуальной.
Цель работы
Цель работы - создание на основе эритроцитов-носителей новых лекарственных форм противоопухолевого антрациклинового антибиотика митоксантрона (Мтн), а также антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови.
Задачи исследования
1. Разработка оптимальных методов введения данных препаратов в эритроциты.
2. Изучение эффективности загрузки и скорости освобождения Мтн из эритроцитов-носителей (фармакоцитов).
3. Изучение повреждающего воздействия загрузки Мтн на эритроциты-носители.
4. Сравнительное исследование фармакокинетики препарата фактора IX, введенного в организм стандартным способом (в виде внутривенной инъекции раствора свободного фактора) и внутри эритроцитов-носителей.
Научная новизна
В результате работы впервые были созданы новые лекарственные формы двух, совершенно различных по химической природе препаратов - противоопухолевого антибиотика митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови. Оба препарата были успешно включены в эритроциты.
Разработаны методы, позволяющие в каждом из данных случаев получать фармакоциты, обладающие достаточно продолжительным временем жизни, которые освобождают лекарственный препарат в кровоток постепенно, обеспечивая, таким образом, его пролонгированное действие.
Исследование сравнительной фармакокинетики традиционной и новой лекарственных форм препарата фактора IX показало, что время циркуляции этого фактора в кровяном русле увеличивается при включении препарата в эритроциты в 5-10 раз.
В случае антибиотика митоксантрона в фармакоциты может быть включена доза лекарства, превышающая одноразовую дозу, которую вводят обычно при стандартном способе введения препарата. При этом фармакоциты обладают достаточным временем жизни, а препарат освобождается их клеток-носителей постепенно, удается не только получить пролонгированную форму лекарства, но и снизить его кардиотоксичность, которая возникает обычно за счет высокой пиковой концентрации препарата в момент введения [52].
Практическая ценность работы
Разработанные новые лекарственные формы синтетического антибиотика митоксантрона и антигемофильного фактора IX системы свертывания крови на основе эритроцитов-носителей позволяют сильно пролонгировать действие этих лекарственных препаратов по сравнению с введением аналогичной дозы стандартного лекарственного препарата. В случае митоксантрона возможно также повысить дозу вводимого вещества с . одновременным снижением его кардиотоксичности. Это позволяет использовать данный препарат у пациентов с выраженными сердечными или почечными нарушениями, что невозможно для стандартной лекарственной формы препарата. Уменьшение количества и : частоты инъекций, необходимых для поддержания терапевтического уровня концентраций лекарственного препарата в крови, снижает общий расход лекарства, необходимого для проведения курса терапии, и улучшает качество жизни пациентов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Разработаны методы включения в эритроциты синтетического аналога антибиотиков антрациклинового ряда - митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX.
2. Загруженный в эритроциты митоксантрон способен постепенно освобождаться из эритроцитов-носителей, что позволяет создать на их основе пролонгированную форму лекарства.
3. Включение терапевтической дозы митоксантрона в эритроциты практически не повреждает клетки-носители. При концентрациях препарата в клетках в 10 раз превышающих ту, что возникает при загрузке единичной терапевтической дозы, повреждающее воздействие антибиотика на клетки все еще остается достаточно слабым. 4. На основе изучения фармакокинетики свободной и загруженной в эритроциты формы биотинилированного фактора DC показано, что при включении препарата в эритроциты-носители срок его жизни в кровотоке увеличивается в 5-10 раз.
Использование различных типов переносчиков для адресной доставки и создания пролонгировнных форм препаратов
К настоящему времени существует несколько подходов к решению задачи создания в организме человека долговременных депо лекарственных препаратов и ФАВ и их направленного транспорта:
Один из подходов, наиболее широко применяемых в иммунологии, использование так называемых адъювантов, вспомогательных средств, вводимых в организм вместе с иммуногеном (например, вакциной) для неспецифической стимуляции и усиления иммунного ответа. В качестве адъювантов используются химические вещества различной природы, нерастворимые или плохо растворимые в воде, как-то: гидроокись алюминия, желатина, минеральные масла, эфиры жирных кислот, синтетические полимеры разного состава [34, 94]. Механизм действия адъюванта состоит, главным образом, в депонировании антигена в месте введения и, соответственно, его более медленной доставке к иммунокомпетентным клеткам, что усиливает действие антигенного стимула. Некоторые адъюванты, например адъювант Фрейнда, состоящий из ланолина, вазелинового масла и клеток ослабленных микобактерий, способны, кроме того, интенсифицировать продукцию антител и усиливать клеточный иммунитет [93, 105, 108]. Сложные адъюванты часто применяются на животных при изготовлении иммунных сывороток, особенно при слабой выраженности иммуногенных свойств интересующего материала [18, 55]. Адъюванты в виде нерастворимых в воде неорганических соединений могут вноситься в вакцины медицинского назначения. Так, например, большинство вакцин против гепатита В и инактивированные вакцины против гепатита А вводятся в смеси с гидроокисью алюминия [34].
Хотя адъюванты зарекомендовали себя в качестве веществ, неспецифически усиливающих иммунный ответ, однако их клиническое применение имеет ряд ограничений.
Во-первых, адъюванты сами по себе являются провокаторами воспаления. Это неспецифически стимулирует иммунитет, что важно при вакцинации, но является совершенно ненужным побочным эффектом на фоне применения практически любых лекарственных препаратов и ФАВ [34].
Во-вторых, депо антигена, создаваемое в месте введения при применении адъюванта, является в значительной степени условным. Его эффективность определяется, в основном, местной активностью макрофагов и лимфоцитов, а также техникой введения препарата. При этом использование адъюванта предусматривает, что препарат, будучи введен в водонерастворимой фазе (липиды, жирные кислоты) в подкожно-жировую клетчатку, практически не попадает в общий кровоток, откуда он незамедлительно выводится [34].
В-третьих, чрезвычайно важным обстоятельством, является невозможность введения с их помощью терапевтически значимых доз препаратов [34].
Таким образом, применение адъювантов для создания депо лекарственных препаратов, иммуногенов и ФАВ на их основе представляется в настоящее время бесперспективным.
Появление гибридомной технологии и возможность получения в препаративных количествах моноклональных антител стимулировало многочисленные попытки создания переносчика нового типа, который сочетал бы в себе преимущества депо и возможности направленной доставки препарата. Наибольшее внимание при этом было уделено . противоопухолевым препаратам, как обладающим наименьшей специфичностью, с одной стороны, и большой клинической и социальной значимостью, с другой.
Противоопухолевые препараты в комплексе с антителами показали большую цитотоксичность для злокачественных клеток, обладающих антигенами, соответствующими переносчикам-иммуноглобулинам [51., 86]. Однако, несмотря на свою привлекательность, применение переносчиков-антител связано с рядом трудностей, среди которых наиболее важные - выделение антигенов и получение их в фармакологически необходимых количествах.
Одним из подходов к созданию долговременных депо препаратов в организме является использование макромолекулярных переносчиков, в частности -десиалированных гликопротеинов. В условиях in vitro некоторые из них оказались тройными к клеткам паренхимы печени [19].
В одной из работ модифицированный белок фетуин - гликопротеин плазмы плода -был ковалентно сшит с белками человека - лизоцимом и альбумином. Этот комплекс успешно захватывался клетками печени [19]. Еще в одной подобной работе авторы использовали агалактогликопротеины и агексозаминогликопротеины, обладающие тропностью к клеткам печени и почек, соответственно [8].
В качестве потенциально перспективных макромолекул - кандидатов в переносчики рассматривались, некоторые гормоны роста, лектины и некоторые лизосомальные ферменты [54]. Многие из этих веществ относительно легко доступны, однако, в отличие от иммуноглобулинов, их специфичность крайне невысока.
Для направленной доставки препаратов предпринимались попытки использовать способность некоторых типов клеток (фагоцитов и клеток некоторых злокачественных опухолей) к активному эндоцитозу специфических макромолекул. По этому механизму работает полимер-связанный доксорубицин. Этот препарат представляет собой полимерную молекулу НРМА (N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide), содержащую около 8,5% доксорубицина — широко применяемого, но весьма токсичного противоопухолевого антибиотика. Данная лекарственная форма показала высокую противоопухолевую активность в опытах на животных (мыши) [39].
В качестве переносчика лекарственных препаратов была использована также ДНК [100], с которой удалось связать такие цитотоксические мощные противоопухолевые препараты, как дауномицин (рубомицин) и доксорубицин. Эксперименты на животных с такими ДНК-связанными препаратами показали, что сниженная токсичность связанного препарата и повышенное поглощение комплекса ДНК-антибиотик клетками опухоли достоверно увеличивают эффективность терапии [100]. Попытки применения такого препарата в клинике показали, что кардиотоксичность антрациклиновых антибиотиков на таком носителе была снижена по сравнению со стандартной формой препарата, однако для доксорубицина побочные эффекты были сравнимы с таковыми у стандартной формы лекарства [26, 101].
Получение эритроцитов нагруженных митоксантроном
Распределение эритроцитов по плотностям измеряли фталатным методом Данон и Мариковского [28]. Для этого готовили 7 смесей диметил- и дибутилфталата в различных пропорциях с точно известными значениями удельной плотности в интервале от 1.066 до 1.144 г/мл. Каплю каждой смеси набирали в отдельный гематокритный капилляр (высота жидкости в капилляре при этом составляла 5-7 мм). После этого заполняли капилляры суспензией исследуемых эритроцитов (гематокрит 40 %), запаивали и центрифугировали в гематокритной центрифуге при 12000 g в течение 6 минут. Измеряя отношение длины верхней части столбика эритроцитов (над каплей фталатной смеси) к общей длине столбика, рассчитывали % клеток, имеющих плотность ниже, чем у смеси фталатов в данном капилляре. Таким образом, используя серию смесей фталатов с разными плотностями для исследования одной и той же суспензии эритроцитов, получали в итоге распределение эритроцитов по плотностям для данного образца эритроцитов. Все измерения были дублированы. Данные параллельных измерений усреднялись.
Распределение эритроцитов по плотностям были измерены для исходных ненагруженных клеток, прошедших процедуру 3-х часовой инкубации в PBS при 37С без препарата (контроль), а также для эритроцитов инкубированных аналогичным образом в PBS, содержащем Мтн в концентрации 0.06 мг/мл (концентрация соответствующая терапевтической дозе) или 0.6 мг/мл.
Биотинилирование проводили согласно методике фирмы Pierce. ("33, 53]. При этом содержимое 5 флаконов препарата "AIMAFIX D.I. 500 I.U." растворяли в 5 мл деионизованной. воды. Для удаления избыточных солей раствор подвергали диализу против PBS (12 часов при +4С, с трехкратной сменой внешнего буфера и при его постоянном перемешивании). Концентрацию белка в полученном растворе доводили с помощью PBS до 2 мг/мл, после чего добавляли по 10 мкл/мл раствора белка N-гидроксисукцинимидобиотина в диметилформамиде (исходная концентрация 10 мг/мл). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа (раствор N-гидроксисукцинимидобиотина готовили ex tempore). Затем не связавшийся модифицированный биотин удаляли с помощью диализа против PBS (12 часов при +4С) с трёхкратной сменой буфера. Полученный белок сначала концентрировали с помощью центрифугирования в присутствии непроницаемой для белка мембраны, а затем стерилизовали, пропуская через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Объем раствора препарата после диализа и стерилизации составил около 3 мл, а концентрация белка в нем, измеренная методом Lowry, была равна 5.8 мг/мл.
Количество молекул биотина, связанных с одной молекулой белка в составе биотинилированного препарата фактора IX, определяли по методике фирмы Pierce [33, 53]. В основу методики положен процесс вытеснения биотином 4-гидроксиазобензен-2-карбоксиловой кислоты (НАВА) из ее комплекса с авидином [46].
Для приготовления рабочего комплекса НАВА4-авидин сначала растворяли 2.4 мг НАВА в 1 мл 20 мМ NaOH, приготовленного на деионизованной воде. Затем к 530 мкл приготовленного щелочного раствора НАВА добавляли 440 мкл PBS и 30 мкл раствора авидина в деионизованной воде (исходная концентрация 10 мг/мл). В результате образовывался ярко-желтый раствор комплекса, концентрация авидина в котором составляла 8 мкМ. Раствор хранили при +4 С не более 2 недель.
Раститровку стандартного раствора D-биотина в PBS (7.8 мкг/мл или 32 мкг/мл) и всех исследуемых образцов, содержащих биотин, производили в стандартном 96-луночном планшете. Измеряли концентрацию комплекса НАВАд-авидин спектрофотометрически на планшетном инструменте Microplate Reader Benchmark, Bio-Rad ( п,!1х=500 nm, Esoonm=34000 M cm"l). Концентрацию биотина в образцах (в мкМ) определяли, пользуясь калибровочной кривой, построенной с использованием данных титрования биотина.
Степень биотинилирования (отношение количества молекул белка к количеству молекул связанного с ним биотина) рассчитывали как отношение молярных концентраций белка и биотина. Расчет проводили, пересчитывая весь белок на фактор IX. Молекулярный вес фактора принимали равным 55000 Da.
Степень биотинилирования белка в составе препарата фактора IX составила 1:4, т.е. на одну молекулу белка связывалось примерно 4 молекулы биотина. Включение биотинилированного фактора IX в эритроциты Включение препарата фактора IX в эритроциты проводили методом ступенчатого диализа [13, 91] в полностью стерильных условиях. Для выделения эритроцитов кровь, забранную из локтевой вены в раствор 3.8% цитрата натрия (соотношение кровь: цитрат=9:1) центрифугировали, эритроциты отмывали затем 3 раза стерильным физиологическим раствором. В предварительно замоченный на 4 часа в растворе PBS с добавлением 5 мМ глюкозы диализный мешок помещали 2 мл отмытой эритромассы (с гематокритом 88%) и 0.8 мл разбавленного в том же буфере раствора биотинилированного препарата фактора IX (5.8 мг/мл). Мешок помещали в стакан с мешалкой, содержащий 200 мл охлажденного до +4С гипоосмотического буфера (рН 7.45), содержащего 12.5 мМ КН2РО4, 5 мМ MgCb, 12.5 мМ глюкозы и 3.75 мМ аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Для доведения рН был использован раствор гидроксида калия. Диализ проводили при +4С. После 20 мин диализа в стакан с буфером было добавлено 60 мл стерильной дистиллированной воды и диализ продолжали еще 20 мин. Процесс повторяли. На каждой ступени диализный мешок с эритроцитарной массой выдерживали при определенной концентрации внешнего буфера в течение 20 минут. Суммарно делали 5 добавлений дистиллированной воды, после чего объем диализующего буфера стал равным 500 мл, т.е. концентрации всех составляющих буфера уменьшились в 2.5 раза.
После этого проводили "запечатывание" эритроцитов с фактором IX внутри. Для этого диализный мешок переносили в 200 мл предварительно нагретого изоосмотического буфера (рН 7.45) и инкубировали 1 час при 37С. В состав изоосмотического буфера входили 10 мМ КН2Р04/КОН, 2мМ MgCl2, 145 мМ NaCl, 10 мМ глюкозы и 5 мМ аденозина. Полученные эритроциты-носители переносили в стерильную пробирку, отделяли от супернатанта, а потом отмывали 3-4 раза стерильным физиологическим раствором путем центрифугирования (10 минут, 1250g) до полного отсутствия следов гемоглобина в супернатанте.
Влияние температуры на кинетику загрузки эритроцитов митоксантроном
Влияние митоксантрона на распределение эритроцитов по плотностям Эксперименты по изучению влияния Мтн на распределение эритроцитов по плотностям проводили на эритроцитах, проинкубированных в суспензии с гематокритом 40% в течение 3 часов при температуре 37С. Исходные концентрации Мтн в среде составляли 0.06 мг/мл, что соответствует концентрации при загрузке одной терапевтической дозы препарата (см. «Обсуждение») или 0.6 мг/мл (т.е. концентрация в 10 раз превышающая концентрацию при загрузке одной терапевтической дозы). В качестве контроля использовали клетки, проинкубированные без препарата. Полученные результаты представлены на рис. 11.
Рис. 11. Дифференциальное распределение нагруженных Мтн эритроцитов по плотностям. Концентрации Мтн в суспензии при загрузке эритроцитов составляли: D - 0 мг/мл суспензии (контроль); - 0,06 мг/мл суспензии; А -0,6 мг/мл суспензии. Суспензия клеток с Ht 40% была проинкубирована 3 час при 37С (п=6). Пунктиром указан уровень плотности, соответствующий критическому увеличению объема эритроцитов (30-35%), после которого клетка подвергается гемолизу.
Видно, что распределение клеток в суспензии с терапевтической дозой препарата практически не отличается от распределения эритроцитов в контрольной суспензии, тогда как при 10-кратном увеличении концентрации антибиотика наблюдается смещение распределения в область меньших плотностей. Это говорит о том, что при концентрации Мтн в суспензии 0.6 мг/мл в эритроциты начинает входить вода. При этом объем эритроцитов увеличивается, а их удельная плотность уменьшается.
Биотинилированный препарат фактора IX («Aimafix D.U. 500 I.U.») был включен в эритроциты 5 различных доноров добровольцев (таблица 2). В результате включения объем получившихся загруженных эритроцитов (в % от объема исходной эритроцитной массы) составил в среднем 55.0+10.0%, при этом концентрация препарата в лизате готовых фармакоцитов составляла в среднем 24.3±10.5% от концентрации исходного белка в среде при инкубации. Приведены средние величины ± среднеквадратичные отклонения.
Для сравнения фармакокинетики биотинилированного фактора IX (фактор ІХЬІОІ), включенного в эритроциты, и раствора фактора ІХЬІОІ, сначала была изучена фармакокинетика свободного препарата, который был введен внутривенно 2 добровольцам (контроль). При этом добровольцы получили 1080 и 1160 мкг биотинилированного белка в 0.4 мл физиологического раствора (контроли 1 и 2, соответственно). Измерение концентраций фактора ІХЬІОІ В плазме из проб крови, отобранных у пациентов через различные промежутки времени после введения препарата, позволило получить фармакокинетические кривые выведения данной формы фактора IX.
На рис.12 А представлены кривые изменения концентрации фактора 1Хыог в плазме добровольцев контрольной группы после введения им фактора ІХПІ0І В виде раствора. Концентрации выражены в процентах от максимальной концентрации, наблюдаемой для каждого из участников экспериментов в ходе опыта. В обоих случаях концентрация определяемого фактора IXbiot в плазме резко повышается сразу после введения препарата, а затем начинает падать. Снижение содержания препарата достаточно хорошо описываются одной экспоненциальной кривой. Для расчета времени полувыведения фактора IXbiot были построены прямые в полулогарифмических координатах, приведенные на рис. 12 Б. Рассчитанная из этих данных усредненная величина tm составила 8.8±5.б часа.
Фармакокинетика включенного в эритроциты фактора IXbiot была изучена у четырех добровольцев, каждый из которых дал информированное согласие на проведение эксперимента. Полученные в полностью стерильных условиях фармакоциты, приготовленные из собственных эритроцитов каждого испытуемого, были введены внутривенно (объем перелитой суспензии составлял 1.5-2.4 мл, гематокрит был доведен до 50% стерильным физиологическим раствором). Суммарное количество введенного фактора при этом составляло от 210 до 400 мкг. Концентрацию биотинилированного фактора IX измеряли в эритроцитах и плазме добровольцев в разное время после введения фармакоцитов.
Полученные результаты представлены на рис. 13 и 14. Величины концентраций представлены в % от максимальных концентраций биотинилированного фактора IX наблюдаемых в каждом опыте.
На рис. 15 приведены полулогарифмические зависимости концентраций фактора IXbiot в лизатах эритроцитов добровольцев от времени. Как видно из графиков, во всех случаях снижение концентрации фактора IXbiot, включенного в эритроциты, достаточно хорошо описывается одной экспоненциальной кривой. Снижение концентрации фактора IXbiot в плазме добровольцев не подчинялось уравнению первого порядка. При этом в ряде случаев концентрация фактора удерживалась на постоянном уровне на протяжении примерно 6 суток, после чего начинала убывать (рис. 14). Концентрации фактора IXbiot в плазмах оставались достаточно высоки даже в момент окончания экспериментов (см. таблицу 4)
Создание новой лекарственной формы антрациклинового антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов-носителей
Полученные в работе результаты показывают, что биотинилированный фактор IX достаточно эффективно и стабильно включается в эритроциты методом щадящего ступенчатого диализа (таблица 2). Такие эритроциты сохраняют хорошую жизнеспособность и продолжают циркулировать в русле крови достаточно долгое (более 15 суток) время (рис.12). Выведение нагруженных эритроцитов из организма происходит по уравнению первого порядка, о чем свидетельствуют линейные зависимости от времени логарифма концентрации загруженного фактора в лизатах эритроцитов добровольцев (рис. 14). Среднее время полувыведения фактора IXbiot из эритроцитов составило 73.9+16.0 часов (интервал от 94.2 до 55.2 часов) (см. таблицу 3).
Измеренное в настоящей работе среднее время полувыведения фактора IXbiot из плазмы добровольцев, которым этот фактор был введен в виде раствора, составило 8.8±5.б часов (рис. 11). Это время существенно ниже цитируемых в литературе данных (Ua 18-24 час) [87]. Мы предполагаем, что это связано с тем, что исследованный в нашей работе фактор IX был биотинилирован. Однако это не мешает сравнить времена полувыведения препарата? введенного в виде свободного раствора или включенного в эритроциты, т.к. в обоих случаях в работе использован биотинилированный фактор IX. Данное сравнение показало, что время полувыведения фактора IXbiot введенного внутри суспензии эритроцитов более чем в 8 раз превышает аналогичное время при введении свободного раствора фактора.
Естественное постоянное разрушение части фармакоцитов в русле крови позволяет поддерживать в плазме достаточно существенные концентрации фактора IXbiot на протяжении всего времени измерения фармакокинетических кривых (рис. 13). Средние максимальные концентрации фактора ГХьюів плазме участвовавших в опыте добровольцев составляли 24.7±10.6% от уровня максимальных концентраций данного фактора в аутологичных лизатах эритроцитов. Даже на 15 сутки концентрации фактора в плазме не опускались ниже 12-14% от максимально наблюдаемых в ходе экспериментов (таблица 4). В отличие от кинетики выведения фактора из загруженных препаратом фармакоцитов, снижение концентрации введенного биотинилированного фактора в плазме добровольцев не описывается уравнением первого порядка. В половине случаев наблюдалось отсутствие падения этой концентрации на протяжении первых 6 суток. Это, по-видимому, связано с тем, что концентрация препарата в данном случае зависит не только от скорости его выведения из плазмы, но и от той скорости, с которой фактор появляется в плазме в результате постепенного разрушения в русле введенных фармакоцитов.
Суммируя полученные результаты, можно сказать, что время присутствия в кровотоке фармакоцитарной формы препарата фактора IX, полученной методом ступенчатого диализа, сильно пролонгировано по сравнению со свободной формой препарата. Это делает данную лекарственную форму перспективной для применения в клинике.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработаны две новые лекарственные формы на основе эритроцитов-носителей. Низкомолекулярный синтетический аналог антрациклиновых антибиотиков — митоксантрон, был включен в эритроциты методом прямой инкубации суспензии клеток в среде, содержащей препарат. Для включения белкового препарата антигемофильного фактора IX использовали метод ступенчатого диализа. В обоих случаях препараты были успешно включены в эритроциты. Созданные лекарственные формы обладают рядом преимуществ перед используемыми в клинике стандартными способами введения данных лекарств.
В случае противоопухолевого антибиотика Мтн появляется возможность создания пролонгированной формы и существенного повышения дозы введенного препарата без увеличения его токсичности. Это очень важно для клинического применения данного лекарства, т.к., несмотря на его высокую противоопухолевую активность, применять его в достаточно высоких дозах невозможно из-за сильной кардио- и нефротоксичности.
Инкапсуляция антигемофильного фактора IX в эритроциты также, позволяет создать пролонгированную форму лекарства. Время жизни этого препарата в крови при введении его в эритроцитах-носителях увеличивается примерно в 5-10 раз. При этом большую часть времени препарат находится внутри собственных клеток хозяина, т.е. не вызывает сильного иммунного ответа организма на введение постороннего белка. Можно надеяться, что данная форма лекарства не будет сильно провоцировать, появление ингибиторов к вводимому фактору.
Для успешного клинического использования разработанных форм препаратов необходимы дополнительные исследования. Однако уже полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что новые лекарственные формы разных по природе фармакологических препаратов на основе эритроцитов-носителей, безусловно, являются очень перспективными с точки зрения возможности повышения вводимых доз препаратов, создания их депонированных форм, защиты препаратов от разрушения и вывода иммунной системой организма, увеличения сроков жизни препарата. Все это позволит улучшить терапевтический эффект вводимого препарата, уменьшить количество необходимых для введения инъекции и, таким образом, улучшить качество жизни пациентов.
