Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Сериновые протеазы. Механизм действия сериновых протеаз 8
1.2. Контактный путь активации свертывания 11
1.2.1. Активация фактора XII 11
1.2.2. Физиологическая роль фXII 14
1.2.3. Роль контактной активации в патологии 17
1.3. Ингибиторы контактной активации 18
1.3.1. Плазменные ингибиторы фXIIa 18
1.3.2. Белковые ингибиторы фXIIa неплазменного происхождения 20
1.3.3. Стандартный механизм ингибирования сериновых протеаз 22
1.4. Ингибитор трипсина из кукурузы 26
Постановка задачи 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 30
2.1. Используемые реактивы 30
2.2. Подбор праймеров, полимеразная цепная реакция и сайт-направленный мутагенез 34
2.3. Трансформация клеток штамма-продуцента плазмидными конструкциями 35
2.4. Экспрессия и детекция рекомбинантных ингибиторов 36
2.5. Очистка рекомбинантных ингибиторов 37
2.6. Измерение ингибирующей активности 38
2.7. Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга 40
2.8. Молекулярная динамика 41
2.9. Подготовка модельной структуры фактора XIIa на основе гомологии з
2.10. Белок-белковый докинг 43
2.11. Статистический анализ 44
ГЛАВА 3. Результаты 45
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного CHFI 45
3.2. Измерение ингибирующей активности 51
3.3. Моделирование взаимодействия протеаза-связывающей петли CHFI с ингибируемыми протеазами 56
3.3.1. Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга 56
3.3.2. Моделирование структуры фXIIa. Докинг 59
ГЛАВА 4. Обсуждение 67
Выводы 73
Благодарности 74
Список литературы 75q
- Активация фактора XII
- Белковые ингибиторы фXIIa неплазменного происхождения
- Экспрессия и детекция рекомбинантных ингибиторов
- Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга
Активация фактора XII
Образовавшийся в результате активности альфа-фXIIa активный фактор XI (фXIa) опосредует активацию следующих протеаз в каскаде плазменного свертывания (фактор IX, фактор X и тромбин [24,25]), начиная с фактора IX (фIX) (рис. 4). Тромбин расщепляет растворимый плазменный белок фибриноген с образованием фибрина и переводит в активную форму фактор XIII (фXIII). Фибрин полимеризуется с образованием длинных белковых нитей - фибрилл, которые ковалентными сшивками соединяются в сеть активным фXIII. Благодаря формированию пространственной сети фибриновых фибрилл и образуется гелеобразный сгусток [26].
Тем не менее, при повреждении кровеносного сосуда, т.е. в «физиологических» условиях, активация плазменного свертывания происходит по пути тканевого фактора (ТФ) (рис. 4, справа). ТФ или тромбопластин – это трансмембранный гликопротеин, который присутствует на поверхности всех клеток, за исключением клеток крови и эндотелиальных клеток. Таким образом, при повреждении сосуда кровь приходит в контакт с ТФ. Образуется комплекс внешней теназы - ТФ-активный фактор VII (фактор VII (фVII) автоактивируется при взаимодействии с ТФ), который далее активирует факторы IX и X, в результате чего в месте повреждения сосуда формируется фибриновый сгусток [27,28]. Рисунок 4. Схема каскада плазменного свертывания. Слева путь контактной активации (желтые стрелки), справа – путь тканевого фактора (оливковые стрелки), общая часть каскада (зеленые стрелки) по [29] с небольшими изменениями.
Связь между двумя путями запуска плазменного свертывания (контактным путем и путем тканевого фактора) осуществляется через способность альфа- и бета-формы фXIIа активировать фVII [30,31]. При физиологических температурах (около 37 С) такая активация предотвращается плазменным С1-ингибитором (C1INH), который теряет активность вблизи 0 С. Это объясняет эффект «холодовой» активации свертывания при пониженных температурах. Еще одна физиологическая роль фXIIa заключается в его влиянии на плотность сгустка. Альфа-фXIIa может изменять структуру фибринового сгустка, связываясь с фибрином своей тяжелой цепью, что приводит к образованию более плотного сгустка, защищенного от фибринолиза [32]. Кроме того, фXIIa опосредованно принимает участие в фибринолизе – процессе деградации фибринового сгустка. Обе (альфа и бета) формы активного фXII способны активировать плазминоген с образованием плазмина – ключевого фермента системы фибринолиза. Плазминоген протеолитически расщепляет фибриновые нити сгустка, что приводит его к деградации [33].
ФXII также вовлечен в ангиогенез – процесс образования новых сосудов. N-концевой домен фXII и альфа-фXIIа может связываться с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), что приводит к его активации и, как следствие, к стимуляции роста эндотелиальных клеток [20].
Вклад контактной активации в поддержании плазменного гемостаза до сих пор не вполне ясен. Дефицит фXII впервые был обнаружен Ратноффом и Колопи в 1955 г в крови Джона Хагемана (в честь которого фXII также называют фактором Хагемана), которая не сворачивалась в стеклянной пробирке [34]. Однако, дефицит фXII не оказывает заметного влияния на гемостаз, а пациенты и экспериментальные животные с дефицитом фXII не страдают от кровотечений [7,35]. 1.2.3. Роль контактной активации в патологии
Если участие фXII в поддержании гемостаза на сегодняшний день не вполне ясна, то его участие в патологическом тромбообразовании было показано экспериментально на животных моделях FeCl3-индуцированного тромбоза [7], коллаген-индуцированной тромбоэмболии легочной артерии, лигирования аорты [7,8] и острого ишемического инсульта [9]. Мыши с дефицитом фXII (нок-аут по соответствующему гену или животные дикого типа после введения ингибитора фXII) по результатам ногтевого и хвостового кровотечения не отличались от контрольных животных дикого типа, что говорит об отсутствии нарушений гемостаза. В то же время в экспериментах с индуцированным тромбозом мыши, дефицитные по фXII, были частично защищены от развития тромбоза: размер тромба, объем ткани, поврежденной вследствие тромбоза, и смертность были значительно ниже, чем у животных контрольной группы. Повышение концентрации фXII в плазме экспериментальных животных до типичных значений приводило к развитию обширного тромбоза [7]. Выше описанные эксперименты позволяют говорить об участии фXII в патологическом формировании тромбов при гиперкоагуляционных состояниях системы гемостаза [4]. 1.3. Ингибиторы контактной активации 1.3.1. Плазменные ингибиторы фXIIa
Контактная активация свертывания в кровеносном русле блокируется рядом ингибиторов. К ним относятся С1-ингибитор (C1INH) [23,36], антитромбин (AT), 2-антитромбин, 2-макроглобулин [37] и гистидин-богатый гликопротеин [38,39].
Антитромбин и C1-ингибитор представляют собой серпины, относящиеся к семейству I04.001 -1- ингибиторов протеаз [40]. Ингибирование сериновых протеаз серпинами необратимо и происходит с изменением конформации как ингибитора, так и протеазы. N-концевая петля ингибитора заходит в активный сайт протеазы. Далее происходит протеолитический гидролиз пептидной связи в петле ингибитора, что вызывает резкое изменение конформации ингибитора. Такое конформационное изменение приводит к изменению структуры активного центра протеазы, как следствие, гидролиз ацил-фермента не происходит, а ингибитор с протеазой остаются ковалентно связанными [41]. В отличие от C1INH антитромбину для ингибирования фXIIa требуется присутствие кофактора – гепарина [22]. Гепарин - отрицательно заряженный сульфатированный глюкозаминогликан, имеющий специфические АТ-связывающие сайты [42]. Несвязанный с антитромбином гепарин напротив – провоцирует автоактивацию фXII [43]. В экспериментах было показано, C1INH подавляет активность фXIIa при т.н. поверхностной активации каолином или стеклом [44]. Если фXII связывается с поверхностью активированных тромбоцитов (что также вызывает его автоактивацию) или клетками эндотелия, это защищает фXII от ингибирования С1-ингибитором, но не антитромбином [45].
Белковые ингибиторы фXIIa неплазменного происхождения
Штамм-продуцент E. coli Rosetta-Gami 2 DE3 был использован для экспрессии рекомбинантных ингибиторов. Трансформацию проводили методом теплового шока [80] с незначительными модификациями. Химически компетентные клетки инкубировали на льду в течении 20 мин, затем в стерильных условиях к клеткам добавляли 5 мкл лигазной смеси, содержащей соответствующий экспрессионный вектор и инкубировали на льду 30 мин. Тепловой шок проводили в водяной бане при температуре 40 С в течение 20 с. После теплового шока клетки немедленно переносили на лед. На следующем этапе каждую аликвоту клеток переносили в 0,5 мл питательной среды SOC. Инкубировали при 37 С в течение 1 ч со встряхиванием на шейкере. Далее проводили селекцию трансформантов на твердой агаризованной среде, содержащей 25 мг/мл канамицина, в чашках Петри. Потенциальных продуценты отбирались по результатам пробной индукции в 4 мл питательной среды LB; экспрессию инициировали добавлением 1мМ ИПТГ. Наработку белка проводили в течение 2,5 ч при 37 С.
Наличие вставки целевого гена у положительных трансформантов подтверждали секвенированием. В качестве сиквенсовых праймеров использовались, комплиментарные к вектору pET28a, стандартные Т7 праймеры прямой Рекомбинантные ингибиторы производили путем индукции экспрессии целевого белка в соответствующем штамме-продуценте. Клетки штамма-продуцента E. coli Rosetta-Gami 2 DE3 каждого ингибитора рассевали из музея на твердую агаризованную питательную среду, содержащую 25 мг/мл канамицина, в чашки Петри для получения единичных колоний.
Единичную колонию клеток использовали для инокуляции 4 мл жидкой питательной среды LB, содержащей 25 мг/мл канамицина, и культивировали в течение ночи при 37 C. Полученную культуру использовали в качестве инокулята (инокулят разводили в 50 раз) для 1,5 л жидкой среды LB, содержащей 25 мг/мл канамицина. Клетки культивировали при 37 C до достижения оптической плотности культуры 0,6-0,7 на длине волны 600 нм. Экспрессию индуцировали добавлением ИПТГ в питательную среду до достижения конечной концентрации 0,02 мМ, после чего культивирование продолжали при 25 C в течение 20 ч.
Образцы культуры центрифугировали при 3000g, надосадочную жидкость декантировали, а клеточный осадок ресуспензировали в буфере В и инкубировали 10 мин при 95 C. Затем наличие целевого белка в клеточном лизате проверяли методом денатурирующего электрофореза в 12% акриламидном геле по Лэммли в камере «MiniProteanTetra» (BioRad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Прописи использованных растворов приведены в разделе «2.1. Используемые реактивы».
Окрашивание гелей проводили в Кумасси R-250. 2.5. Очистка рекомбинантных ингибиторов
Все рекомбинантные белки были клонированы так, что на N- и/или С- конце несли гексагистидиновый таг для очистки, что позволило использовать для очистки ингибиторов никель-афинную хроматографию.
Биомассу продуцентов после индукции получали в виде осадка клеток
центрифугированием культуры в течение 20 мин при 5000 g при температуре 4 C. Затем клетки лизировали в буфере Л в течение 30 мин на льду с последующим разрушением клеток ультразвуком при помощи погружного соникатора. Клеточный дебрис удаляли из лизатов центрифугированием в течение 40 мин при 10000 g при температуре 4 C. Полученные супернатанты пропускали через 0,2-мкм фильтр с ацетат-целлюлозной мембраной (EMD Millipore) и проводили очистку на Ni2+-агарозной колонке (Qiagen). Колонку промывали пятикратным объемом буфера К. Элюцию ингибиторов проводили в буфере Э. Концентрацию белка в элюатах определяли спектрофотометрически: по поглощению на длине волны 280 нм. Коэффициент экстинкции для рекомбинантных ингибиторов был рассчитан по аминокислотной последовательности при помощи программы Vector NTI Advance (Invitrogen). Для расчета концентрации использовали формулу (1): С= А280/КЭ, (1) где С – концентрация в молях, А280 – поглощение на длине волны 280 нм, КЭ – коэффициент экстинкции; оптический путь 1см. 2.6. Измерение ингибирующей активности Рекомбинантные ингибиторы перед исследованием ингибирующей активности перевели из буфера Э в буфер Х. Замену буфера проводили на 3-кДa центрифужных фильтрах (Amicon Ultra 15 3kDa), согласно рекомендациям производителя (Millipore).
Хромогенные тесты проводили в соответствии с рекомендациями производителя субстрата (Chromogenix, США) с незначительными изменениями. В качестве отрицательного контроля ингибирования во всех хромогенных тестах использовался рекомбинантный EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), полученный в тех же условиях, что и рекомбинантные ингибиторы (вектор, штамм-продуцент, протокол очистки). В тесте ингибирования фXIIa использовался хромогенный субстрат S2302, в тесте ингибирования фXIa - S2366, а в тесте ингибирования трипсина - S2765.
Измерение активности (скорости расщепления соответствующего хромогенного субстрата) в тестах ингибирования фXIIa, фXIa и трипсина проводили при 37 С в буфере ХТ в 96-луночном планшете с плоским дном (Corning Inc., США). Скорость расщепления хромогенного субстрата измеряли на спектрофотометре «Sunrise microplate spectrophotometer» (Tecan Group AG, Австрия) на длине волны 405 нм. Конечная концентрация ферментов в реакционной смеси составляла 1 нМ для фXIIa, 200 пM для фXIa и 1 нМ для трипсина, а все хромогенные субстраты использовались в концентрации 500 мкМ. Эксперименты проводили в трехкратной повторности.
Экспрессия и детекция рекомбинантных ингибиторов
В данной работе мы показали, что при образовании комплекса CHFI-фXIIa взаимодействия между участками белков, не относящимися к протеаза связывающей петле и каталитическому центру, возможно, вносят вклад в специфичность и силу связывания. Таким образом, CHFI, вероятно, первый канонический ингибитор, протеаза-связывающей петли которого не достаточно для ингибирования целевой протеазы: по нашим данным, циклический пептид CHFI-2 не проявляет ингибирующей активности в отношении фXIIa. Более того, результаты докинга CHFI-2 и фXIIa показали, что пептид, вероятно, связывается не с активным сайтом протеазы. Это неожиданный результат для канонического ингибитора, т.к. известно, что изолированные протеаза-связывающие петли таких ингибиторов действуют как независимые структурные элементы и обуславливают взаимодействие с ингибируемой протеазой. Например, циклический пептид, представляющий собой изолированную протеаза-связывающую петлю SFTI-1 не только сохраняет ингибирующую активность в отношении трипсина (Ki=0,5 нМ), но и превосходит по активности полноразмерный ингибитор (Ki=19 нМ) [102].
CHFI-2 (изолированная протеаза-связывающая петля CHFI) богата пролином и, поэтому обладает жесткой конформацией. Нашей начальной гипотезой было то, что несмотря на наличие трех пролинов, изолированная петля могла бы оказаться излишне гибкой, по сравнению с соответствующим участком полноразмерного ингибитора. Подобная конформационная подвижность могла бы отразиться на взаимодействии с фXIIa (более тесном, т.к. Ki=1,1 ± 0,2 нМ) и, предположительно, должна была бы меньше повлиять на слабое взаимодействие с фXIa (5,4 ± 0,2 мкМ). Поэтому нами была проверена ингибирующая активность CHFI-2 в отношении протеаз, которые специфически ингибируются CHFI (трипсин и фXIIa) и фXIa, ингибирующая активность в отношении которого значительно ниже. Для предсказания характера взаимодействия CHFI-2 с этими протеазами были использованы вычислительные методы: МД и докинг. По результатам МД-симуляции наша гипотеза об излишней гибкости изолированной протеаза-связывающей петли не подтвердилась, напротив, по расчетам, структура пептида должна быть жесткой и не имеет серьезных отличий от петли в нативном ингибиторе. Единственным небольшим изменением, по результатам МД расчетов, было небольшое изменение угла между альфа спиралями, фланкирующими петлю, по сравнению с положением соответствующих спиралей в полноразмерном CHFI (рис. 15 В). Таким образом, результаты расчетов не подтвердили нашу гипотезу об избыточной гибкости изолированной протеаза-связывающей петли.
Результаты измерения ингибирующей активности пептида CHFI-2 согласуются с литературными данными об изолированных протеаза-связывающих петлях канонических ингибиторов [102,103]. Наши экспериментальные данные позволяют заключить, что изолированная протеаза-связывающая петля CHFI частично сохраняет ингибирующую активность и может действовать как независимый структурный элемент. CHFI-2 сохраняет ингибирующую активность в отношении фXIa, хотя константа ингибирования (94 ± 11 мкМ) и возросла, примерно, в 20 раз, по сравнению с полноразмерным CHFI (Ki=5,4 ± 0,2 мкМ). CHFI-2 также сохранил способность ингибировать трипсин, однако различие в константах ингибирования изолированной петли и полноразмерного ингибитора оказалось даже выше, чем в случае фXIa (12 ± 2 мкM и 1,3 ± 0,2 нM, соответственно). Если рассмотреть экспериментальные данные и результаты МД-симуляции в комплексе, по можно предположить, что изолированная протеаза-связывающая петля находилась в активной конформации, т.к. CHFI-2 ингибировал трипсин и фXIa в хромогенном тесте. Результаты докинга согласуются с экспериментальными данными , поскольку расщепляемая пептидная связь (между Арг34 и Лей35) находилась в каталитическом сайте как при взаимодействии с трипсином, так и с фXIa.
Неожиданным результатом явилось то, что CHFI-2 не ингибировал фXIIa в хромогенном тесте. Поскольку пептид, предположительно, находился в активной конформации, отсутствие ингибирования может объясняться некорректным положением расщепляемой пептидной связи протеаза-связывающей петли относительно активного сайта фXIIa. Мы предполагаем, что корректное положение протеаза-связывающей петли CHFI в щели активного сайта фXIIa обеспечивается взаимодействиями непетельных участков ингибитора с фXIIa за пределами его активного сайта. С данной гипотезой согласуются с результатами докинга CHFI-2 и фXIIa. Наиболее энергетически выгодная позиция пептида находилась вне активного сайта модельной структуры фXIIa (рис. 18 Е). Однако, с другой стороны, непропорциональная потеря ингибирующей активности изолированной протеаза-связывающей петли в отношении фXIIa по сравнению с трипсином и фXIa может также частично обуславливаться заменой Цис29 на Асп, а также отсутствием стабилизации за счет взаимодействия петли с другими частями ингибитора.
Для прояснения возможных причин отсутствия ингибирующей активности CHFI-2 в отношении фXIIa, вклад стабилизации протеаза-связывающей петли CHFI за счет третьей дисульфидной связи был исследован экспериментально в хромогенных тестах активности фXIIa, фXIa и трипсина в присутствии мутанта CHFI-1245 (полноразмерный ингибитор с заменой Цис29Асп и, как следствие, разрушенной третьей дисульфидной связью). Данный мутант также является контролем для замены Цис29Асп в пептиде CHFI-2. CHFI-1245 показал сниженную способность ингибировать фXIIa и трипсин (Ki = 50 ± 8 и 250 ± 20 нM, соответственно) по сравнению с полноразмерным ингибитором (Ki = 1,0 ± 0,1 и 1,3 ± 0,2 нM, соответственно). Неожиданным результатом стало то, что CHFI-1245 практически не ингибировал фXIa (Ki = 490 ± 110 мкМ). Результаты докинга позволяют объяснить это наличием альтернативного (вне каталитического сайта) сайта связывания CHFI-1245на поверхности фXIa (рис. 18 Б). Тем не менее, сохраняющаяся пониженная ингибирующая активность CHFI-1245 в отношении фXIIa и трипсина позволяет предположить, что стабилизация протеаза-связывающей петли за счет третьей дисульфидной связи вносит вклад во взаимодействие CHFI с активным сайтом фXIIa, но в то же время замена Цис29Асп не может расцениваться как единственная причина потери ингибирующей активности CHFI-2 в отношении фXIIa.
Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга
Для выявления возможных причин неактивности CHFI-2 в отношении фXIIa, к.х.н. старшим научным сотрудником Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН Софьей Владимировной Лущекиной было проведено моделирование взаимодействия CHFI-2, CHFI-1245 и CHFI-12345 (полноразмерный ингибитор) с фXIIa, фXIa и трипсином. Результаты модельных экспериментов были опубликованы в совместной статье (Korneeva et.al., 2014).
За неимением опубликованной полной рентгеновской структуры фXIIa, была подготовлена модельная структура данной протеазы, которая и использовалась в дальнейшем для докинга с CHFI и его мутантами. Структуры мутантов CHFI, использованные в экспериментах были получены из опубликованной структуры CHFI (1BEA в базе данных «PDB», [71]) методом молекулярной динамики (МД).
Чтобы выяснить и при необходимости учесть конформационные изменения изолированной протеаза-связывающей петли CHFI-2 и CHFI-1245 (CHFI с заменой Цис29Асп), были проведены расчеты молекулярной динамики. В результате проведения 50-наносекундной симуляции с последующим охлаждением системы были получены структуры всех трех ингибиторов, стабильные в водном окружении. Положение боковой цепи Арг34 представляет особый интерес, т.к. связь между Арг34 и Лей35 гидролизуется во время взаимодействия CHFI с протеазой.
Во время МД-симуляции с CHFI-12345, CHFI-1245 и CHFI-2 не происходило серьезных конформационных изменений. После охлаждения системы положение боковой цепи Арг34 в CHFI-12345 отличалось от состояния в кристаллической структуре 1BEA. В CHFI-1245 и CHFI-2 Арг-34 сходным образом приближен к остову. Однако, в CHFI-1245 (мутант с заменой Цис29Асп) Арг34 формирует стабильный солевой мостик с Асп29 (рис. 15 А), что несколько изменяет форму протеаза-связывающей петли (рис. 15 Б). В CHFI-2 угол между двумя альфа-спиралями несколько отличался от угла между соответствующими спиралями в исходной рентгеновской структуре CHFI (рис. 15 В). Данное изменение конформации привело к тому, что изолированная протеаза-связывающая петля имела более жесткую конформацию по сравнению с петлей, находящейся в составе ингибитора. Арг34 и Асп29 при этом находились в пептиде на расстоянии 7 , что не позволяло им сформировать солевой мостик.
Рисунок 15. Конформация протеаза-связывающей петли CHFI, нативной и мутированной (с заменой Цис 29 Арг). А и Б – конформация петли CHFI-1245 с заменой Цис 29 Асп (результат МД-симуляции). А – мутированная протеаза-связывающая петля CHFI-1245 с заменой Цис 29 Арг. Солевой мостик между Арг34 (R34) и Асп29 (D29) (А) показан точечной линией. Боковые цепи Арг34 (R34), Асп29 (D29) и неспаренным Цис29 (С29) показаны шариками и палочками. Б - наложение протеаза-связывающих петель нативного CHFI (CHFI-12345, синего цвета) и мутантной у CHFI-1245 (красная) по результатам МД-симуляции. В – угол между альфа-спиралями оказался несколько различным у пептида CHFI-2 (синий) и нативного CHFI-12345 (красный) по результатам МД-симуляции. Визуализация структур выполнена при помощи плагина «Bendix» [101] для программы «VMD». Так как между известной рентгеновской структурой CHFI и структурой после оптимизации, проведенной методом МД наблюдались различия в положении Арг34, для дальнейших экспериментов (докинг) использовались оба варианта структуры для каждого из ингибиторов: рентгеновская структура после минимизации мутированных участков и стабилизированные в водной среде и структуры после 50 нс МД при 298 К и медленного охлаждения системы до 4 К. 3.3.2. Моделирование структуры фXIIa. Докинг
Модельная структура фXIIa построенная на основе гомологии с каталитической триадой серин-гистидин-аспарагиновая кислота, расположенной в щели на поверхности фермента и находящейся в положении, позволяющем производить каталитической расщепление субстрата представлена на рисунке 16 (рис. 16 А).
Оценку пригодности модельной структуры фXIIa проводили путем докинга с трипептидом, аналогичным специфическому коммерческому хромогенному субстрату S2302 (H-D-пропил-L-фенилаланил-L-аргинин-паранитроанилина гидрохлорид). Позиция пептида, рассчитанная при помощи веб-сервера «ClusPro», была использована в качестве стартовой точки для более точного моделирования при помощи веб-сервера «Rosetta FlexPepDock» [93,94]. Для повышения точности расчетов пептид считался гибким. По результатам расчетов трипептид был локализован в активном сайте фXIIa (рис. 16 Б), так что расщепляемая пептидная связь находилась между фенилаланином и аргинином протеазы. Положение трипептида дополнительно стабилизировалось взаимодействием между аргинином субстрата и остатком Асп141 фактора XIIa. Таким образом, полученная модельная структура была признана годной для проведения дальнейших экспериментов. Рисунок 16. Модельная структура фXIIa. А - модельная структура фXIIa, боковые цепи аминокислотных остатков каталитической триады показаны шариками и палочками и подписаны, альфа-спирали окрашены красным, а бета-слои – голубым цветом. Б. Результаты докинга трипептида Про-Фен-Арг (аналог хромошенного субстрата S2302, который использовался в экспериментах). Пептид (сине-голубой) находится в активном сайте протеазы. ФXIIa (серый). Боковые цепи аминокислотных остатков каталитической триады фXIIa показаны шариками и палочками и подписаны.
В большинстве случаев, наиболее выгодное значение энергетической функции для комплекса протеаза-ингибитор было получено при использовании структур CHFI и его мутантов (CHFI-1245 и CHFI-2), оптимизированных методом молекулярной динамики (табл. 5). Это позволяет предположить, что конформации ингибиторов, полученные в ходе МД-симуляции лучше подходят для ингибирования целевых протеаз, чем минимизированные кристаллические структуры.
Результаты докинга оптимизированных структур ингибиторов с протеазами не противоречили экспериментальным данным. Как CHFI, так и мутанты CHFI-2 и CHFI-1245 связывались с активным сайтом трипсина в позиции, пригодной для расщепления связи между Арг34 и Лей35 ингибитора (рис. 17), однако пептид CHFI-2 связывался слабее по сравнению с CHFI и мутантом CHFI-1245. Это согласовывалось с экспериментальными данными, полученными в хромогенном тесте (табл. 3, рис. 13).
