Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Окислительный стресс и его влияние на продолжительность жизни и развитие сердечно-сосудистых заболеваний 13
1.2. Вклад генетических факторов окислительного стресса в продолжительность жизни и сердечно-сосудистые заболевания
1.2.1. Гены ферментов и белков, обладающих прооксидантным действием 18
1.2.2. Гены ферментов системы антиоксидантной защиты 34
1.3. Обоснование выбора генов и полиморфных вариантов, включенных в
исследование 47
Глава 2. Материал и методы исследования 53
2.1. Характеристика обследованных групп 53
2.1. Характеристика методов исследования 54
1.2.1. Клинико-лабораторные методы 54
1.2.2. Молекулярно-генетические методы 55
1.2.3. Статистические методы 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Полиморфные варианты ядерных генов SOD2, GPX1, CAT, PON1,
CYBA, TFAMHPOLG 66
3.1.1. Характеристика изменчивости изученных полиморфных вариантов в обследованных выборках 66
3.1.2. Анализ ассоциаций изученных полиморфных локусов ядерных генов с ишемической болезнью сердца и продолжительностью жизни 73
3.2. Полиморфизм митохондриальной ДНК 89
3.2.1. Характеристика распространенности гаплогрупп и полиморфных локусов ТІ6189С и Т16519С мтДНК в изученных выборках 90
3.2.2. Анализ ассоциаций гаплогрупп мтДНК и полиморфных локусов Т16189С и ТІ6519С с ишемической болезнью сердца и продолжительностью жизни 92
3.3. Анализ фенотипической изменчивости количественных признаков в популяционной выборке и в группе больных ишемической болезнью сердца 101
3.3.1. Комплексный анализ фенотипической изменчивости количественных признаков 102
3.3.2. Анализ ассоциаций исследованных полиморфных локусов и гаплогрупп с изученными количественными признаками 109
3.4. Анализ вклада сочетаний полиморфных вариантов ядерных генов в определении изученных фенотипов 116
Заключение 119
Выводы 122
Список литературы
- Вклад генетических факторов окислительного стресса в продолжительность жизни и сердечно-сосудистые заболевания
- Клинико-лабораторные методы
- Анализ ассоциаций изученных полиморфных локусов ядерных генов с ишемической болезнью сердца и продолжительностью жизни
- Анализ фенотипической изменчивости количественных признаков в популяционной выборке и в группе больных ишемической болезнью сердца
Введение к работе
Актуальность проблемы: На протяжении последних десятилетий неуклонно растет количество исследований, посвященных генетике многофакторных заболеваний. Изучение генетических факторов наследования таких болезней осложняется наличием большого количества генов с малыми эффектами, вовлеченных в формирование предрасположенности к болезни [Бочков, 2001; McKusik, 2001; McCarthy, 2008; Torkamani, 2008; Пузырев, 2009, 2011].
Наряду с широко распространенным в настоящее время полногеномным анализом ассоциаций важным остается исследование кандидатных генов, т.е. генов, продукты которых потенциально вовлечены в патогенез заболевания. При этом важную роль играет выбор генов - компонентов определенной генной сети, контролирующей и регулирующей жизненно важные функции организма, а также генов, участвующих в отдельных биохимических и патофизиологических путях и механизмах [Колчанов, 2000; Barabasi, 2011].
Одним из патофизиологических механизмов, задействованных в развитии широкого спектра заболеваний, является окислительный стресс, который играет важную роль в патогенезе ишемической болезни сердца (ИБС), атеросклероза, сахарного диабета, нарушений мозгового кровообращения, онкологических и нейродегенеративных заболеваний и т.д. [Болдырев, 1995; Владимиров, 1998; Зенков, 2001; Воробьева, 2005; Меньщикова, 2006; Diaz, 1997; Ray, 2012], а также задействован в механизме старения организма и апоптоза [Анисимов, 2003; Ляхович, 2005; Скулачев, 2007, 2009; Тодоров, 2007]. Окислительный стресс является следствием нарушения баланса между продукцией активных форм кислорода прооксидантной системой и их детоксикацией системой антиоксидантной защиты в направлении повышения уровня активных форм кислорода (АФК): супероксидного анион-радикала, перекиси водорода, гидроксильного радикала [Воробьева, 2005; Fariss, 2005; Burton, 2011].
Основными источниками активных форм кислорода в клетках являются НАДФН-оксидаза, локализованная в цитоплазматической мембране макрофагов и нейтрофилов [Мапеа, 2010; Dikalov, 2011; Lassegue, 2012] и дыхательная цепь митохондрий [Андреев, 2005; Тодоров, 2007; Kowaltowski, 2009; Murphy, 2009], многие компоненты которой кодируются митохондриальной ДНК (мтДНК) [Taylor, 2005; Greaves, 2012]. Функционирование мтДНК определяется влиянием ядерных генов, среди которых можно выделить ген митохондриального фактора транскрипции А {TFAM), активирующий экспрессию генов мтДНК [Litonin, 2010; Ngo, 2011; Campbell, 2012], и ген митохондриальной ДНК-полимеразы у (POLG), участвующий в процессах репликации и репарации мтДНК [Chan, 2009; Copeland, 2010; Saneto, 2010].
Для защиты клеток и тканей от окислительного стресса в организме существует антиоксидантная система, которая включает в себя ряд ферментов: супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза [Владимиров, 1998; Меньщикова, 2006; Halliwell, 2012]. Кроме того, АФК активируют экспрессию генов, кодирующих ферменты антиоксидантной
защиты [Ляхович, 2005; 2006]. Также, существуют ферменты, которые опосредованно защищают клетку от окислительного стресса и его последствий. Например, параоксаназа обладает антиоксидантными свойствами, препятствуя окислительной модификации липидов [Marchegiani, 2008; Rosenblat, 2009; Sapian-Raczkowska, 2010].
Одним из наиболее распространенных многофакторных заболеваний, в патогенез которого вносит вклад окислительный стресс, является ишемическая болезнь сердца [Бокерия, 2007; Samani, 2007; Fearon, 2009; Negi, 2010]. Повреждающее действие активных форм кислорода на эндотелий сосудов и окислительная модификация липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) рассматриваются как ключевые факторы в развитии атеросклероза и ишемической болезни сердца [Diaz, 1997; Ланкин, 2000; Панкин, 2004; Higashi, 2009; Sugamura, 2011].
Активные формы кислорода играют также важную роль в процессе старения организма. Согласно свободнорадикальной теории старения, скорость накопления повреждений и возрастных изменений в клетках определяется соотношением процессов образования свободных радикалов и их нейтрализации антиоксидантной системой [Harman, 1956, 2006; Анисимов, 2003; Скулачев, 2007, 2009].
На структуру и функцию белков, задействованных в регуляции окислительного стресса, может оказывать значимое влияние генетический полиморфизм. Функциональные миссенс-полиморфизмы, приводящие к замене одной аминокислоты на другую, могут приводить к изменению заряда белковой молекулы, замены в различных доменах белка, в зависимости от локализации, могут изменять активность фермента, сродство с субстратом, специфичность и т.д. Полиморфизмы в регуляторных участках гена, например, промоторных, влияют на интенсивность транскрипции, что приводит к изменению количества синтезируемого белка. Вариабельность нуклеотидной последовательности генов окислительного стресса может оказывать влияние на уровень окислительного стресса организма [Halliwell, 2012].
Исследователями в разных странах получены данные о наличии или отсутствии ассоциаций полиморфных вариантов генов белков, оказывающих прямое или косвенное влияние на окислительный стресс, с продолжительностью жизни и сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) [Паук, 2007; Баранов, 2007; Tang, 2008; Soerensen, 2009; Солодилова, 2009; Пардо Пералес, 2009; Кухарчук, 2010; Майкова, 2012]. Однако в подавляющем большинстве исследований гены белков, обладающих анти- либо проксидантными свойствами, и влияние митохондриального генома на окислительный стресс изучают отдельно.
Поскольку окислительный стресс задействован как в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, так и в механизмах старения, можно предположить, что аллели, ассоциированные с долгожительством, могут быть протективными по отношению к развитию ишемической болезни сердца. В пользу этого предположения говорят данные о том, что у долгожителей реже
встречается патология сердечно-сосудистой системы, чем у лиц пожилого возраста [Шабалин, 2006].
Таким образом, изучение полиморфных вариантов генов, задействованных в метаболических путях регуляции окислительного стресса, и выявление ассоциаций этих полиморфных вариантов с ишемической болезнью сердца и с влиянием на продолжительность жизни является актуальным. Представляет интерес комплексное исследование генетической основы окислительного стресса: изучение генов, обладающих про- и антиоксидантной активностью, митохондриального генома и генов, оказывающих влияние на функционирование митохондриальной ДНК.
Цель работы: изучить связь полиморфизма генов окислительного стресса с предрасположенностью к ишемической болезни сердца и продолжительностью жизни, а также с изменчивостью патогенетически значимых количественных признаков.
Задачи исследования:
-
Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов ядерных генов компонентов про- и антиоксидантной системы (CYBA, SOD2, GPX1, CAT и PON1) с долгожительством, ишемической болезнью сердца и ранней смертностью от сердечно-сосудистых заболеваний.
-
Провести анализ ассоциаций гаплогрупп мтДНК и полиморфных вариантов генов-регуляторов функционирования мтДНК (TFAM и POLG) с изучаемыми фенотипами.
-
Изучить связь полиморфных вариантов генов окислительного стресса и митохондриальной ДНК с количественными признаками (показатели ЭхоКГ, показатели липидного обмена, индекс массы тела), значимыми для функционирования сердечно-сосудистой системы.
-
Оценить значимость вклада сочетаний изученных полиморфных вариантов ядерных генов в определении исследуемых фенотипов.
Научная новизна: Получены новые знания о вкладе полиморфных вариантов ряда ядерных генов и митохондриального генома, задействованных в регуляции окислительного стресса, в определение продолжительности жизни и развитие ишемической болезни сердца. Впервые установлено, что аллель Т полиморфного варианта С242Т гена CYBA ассоциирован с долгожительством у женщин, а генотип СС (Thr/Thr) полиморфного локуса Serl2Thr гена TFAM ассоциирован с развитием ишемической болезни сердца у мужчин. Показано, что митохондриальная гаплогруппа HI ассоциирована с ранней смертностью (до 55 лет) от сердечно-сосудистых заболеваний. Выявлены ассоциации полиморфных вариантов генов компонентов про- и антиоксидантной системы с количественными признаками, значимыми для функционирования сердечнососудистой системы.
Научно-практическая значимость исследования: Полученные данные могут быть востребованы при разработке исследовательских и диагностических панелей генетических маркеров для выявления наследственной предрасположенности к развитию ишемической болезни сердца. Сведения о полиморфных вариантах генов, участвующих в регуляции окислительного
стресса у жителей г. Томска, могут быть использованы при проведении генетико-эпидемиологических исследований. Материалы работы могут быть применены в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах высших учебных заведений.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Полиморфный вариант С242Т (CYBA) ассоциирован с долгожительством у женщин, а вариант Prol98Leu (GPX1) ассоциирован с ранней смертностью (до 55 лет) от сердечно-сосудистых заболеваний у мужчин.
-
Полиморфные локусы Alal6Val (SOD2), Serl2Thr (TFAM) и Prol98Leu (GPX1) вносят вклад в развитие ишемической болезни сердца.
-
Установлена ассоциация митохондриальной гаплогруппы Н с ишемической болезнью сердца и митохондриальной гаплогруппы HI с ранней смертностью (до 55 лет) от сердечно-сосудистых заболеваний.
-
Локусы Alal6Val (SOD2), Prol98Leu (GPX1\ Glnl92Arg (POM), C242T (CYBA) и митохондриальная гаплогруппа H вносят вклад в изменчивость количественных признаков, значимых для функционирования сердечнососудистой системы.
Апробация работы: Основные результаты исследования по теме диссертационной работы доложены и обсуждены на межлабораторных научных семинарах ФГБУ НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2009, 2013), Ежегодной Европейской конференции по генетике человека (Вена, 2009; Амстердам, 2011); VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Первой Всероссийской молодежной научной конференции, посвященной 125-летию биологических исследований в Томской государственном университете (Томск, 2010).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных высшей аттестационной комиссией.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Данные проиллюстрированы 24 таблицами, 15 рисунками. Библиографический список включает 356 источников, из них 45 работ отечественных авторов.
Вклад генетических факторов окислительного стресса в продолжительность жизни и сердечно-сосудистые заболевания
Окислительный стресс является следствием нарушения баланса в функционировании прооксидантной системы и системы аитиоксидантной защиты, при котором происходит повышение уровня активных форм кислорода (АФК): супероксидного анион-радикала, перекиси водорода, гидроксильного радикала [Воробьева, 2005; Fariss, 2005; Burton, 2011].
Биологических источников АФК в организме несколько. Основной -цепь переноса электронов или дыхательная цепь в митохондриях [Kowaltowski, 2009; Murphy, 2009; Poyton, 2009]. При нормальной работе дыхательной цепи лишь 2% потребляемого кислорода расходуется на образование АФК [Fariss, 2005; Kowaltowski, 2009; Murphy, 2009], а при нарушении работы дыхательной цепи этот процент возрастает [Fariss, 2005; Tsutsui, 2009; "Wei, 2009]. Еще одним крупным источником АФК служит НАДФН-оксидаза, локализованная в мембране фагоцитарных клеток, таких как нейтрофилы, макрофаги, моноциты [Мапеа, 2010; Dikalov, 2011; Lassegue, 2012]. АФК продуцируют также ксантиноксидаза, альдегидоксидаза, липооксигеназа, миелопероксидаза, NO-синтаза [Victor, 2009; Bonomini, 2008]. В цитозоле АФК могут образовываться в процессах окисления ряда белков и низкомолекулярных веществ, таких как катехоламины [Misra, 2009].
Активные формы кислорода необходимы для осуществления физиологических процессов — фагоцитарной активности, циклооксигеназной и липооксигеназнои реакций, метаболизма эйкозаноидов [Bartosz, 2009; Valko, 2007]. При нормальном протекании метаболических процессов активные формы кислорода и свободные радикалы не накапливаются в клетках. Но уровень активных форм кислорода в клетках может значительно повышаться при увеличении скорости генерации радикалов кислорода или снижении скорости их нейтрализации [Bartosz, 2009; Burton, 2011]. При этом супероксидный анион способен претерпевать изменения, приводящие к образованию других АФК, тем самым усиливая окислительный стресс [Fariss, 2005].
Окислительный стресс приводит к окислительному повреждению тканей, белков, липидов, ДНК, накоплению мутаций, нарушению гомеостаза [Kregel, 2007; Tsubota, 2007; Valko, 2007].
Для защиты клеток и тканей от окислительного стресса в организме существует антиоксидантная система, которая включает в себя как низкомолекулярные вещества (витамины С, Е, каротиноиды, мочевая кислота и др.), так и высокомолекулярные ферменты, к которым относятся супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза [Halliwell, 2012]. Супероксиддисмутаза превращает супероксид-анион в перекись водорода, которая уже может покинуть клетку [Miao, 2009; Fukai, 2011; Miller, 2012]. Если этого не происходит, на перекись водорода действуют другие ферменты - каталаза или глутатионпероксидаза, которые превращают ее в воду [Herbette, 2007; Ogata, 2008; Lubos, 2011]. Кроме того, некоторые ферменты опосредованно защищают клетку от окислительного стресса и его последствий. Например, параоксаназа оказывает антиоксидантное действие, препятствуя окислительной модификации липидов [Marehegiani, 2008; Rosenblat, 2009; Sapian-Raczkowska, 2010]. Вариабельность эндо- и экзогенных про- и антиоксидаитов может определять уровень окислительного стресса организма [Halliwell, 2012].
Возраст-зависимое накопление окислительных повреждений - один из постулатов, лежащих в основе свободнорадикальной теории старения, выдвинутой Харманом в 1956 году. Согласно этой теории, старение организма связано с накоплением повреждений, вызванных окислительным стрессом [Harman, 1956, 2006; Анисимов, 2003; Скулачев, 2007, 2009].
Вариантом свободнорадикальной теории старения является митохондриальная теория старения, согласно которой, АФК, продуцируемые митохондриями в процессе клеточного дыхания, вызывают окислительные повреждения мтДНК. мтДНК человека, не защищенная гистонами и подвергающаяся действию высоких доз АФК и свободных радикалов в митохондриальном матриксе, более чувствительна к окислительному повреждению, чем ДНК ядра. Прогрессивное накопление соматических мутаций мтДНК в течение жизни является ключевым фактором старения животных и человека [Тодоров, 2007; Gruber, 2008; Sanz, 2008; Wei, 2009].
Эта гипотеза поддерживается данными о том, что с возрастом в соматических клетках наблюдается снижение функциональной активности митохондрий, снижение скорости окислительного фосфорилирования, повышение продукции АФК, рост окислительных повреждений мтДНК, липидов и протеинов митохондрий, рост количества мутаций мтДНК [Wei, 2009; Lanza, 2010; Pan, 2011; Lee, 2012]. Снижение функциональной активности митохондрий и повреждение ферментов дыхательной цепи не только уменьшает синтез АТФ, но и увеличивает продукцию АФК за счет большей утечки кислорода в электрон-транспортной цепи, которая, в свою очередь, происходит из-за накопления мутаций мтДЫК. Мутации мтДНК нарушают работу дыхательной цепи вследствие нарушения экспрессии генов и нарушения структуры белков дыхательной цепи, кодируемых митохондриальным геномом [Lee, 2007; Ma, 2009; Wei, 2009].
За последнее время выявлено более 250 мутаций у пациентов с митохондриальными болезнями, и многие из них обнаруживаются в тканях людей престарелого возраста [Lee, 2007; Ma, 2009; Tuppen, 2010; Lee, 2012].
Предполагается, что уровень окислительного стресса оказывает влияние на продолжительность жизни [Harman, 1956, 2006; Скулачев, 2007, 2009; Romano, 2010]. Однако, следует помнить, что продолжительность жизни обусловлена как генетическими, так и эпигенетическими факторами, влиянием окружающей среды [Capri, 2006; Makino, 2009]. На основании близнецовых и крупных популяционных исследований показано, что вклад генетической компоненты в долгожительство варьирует от 15 до 30 % [Iachine, 1998; Ljungquist, 1998; Kulminski, 2009]. Отмечено, что влияние генетических факторов на продолжительность жизни может усиливаться в возрасте старше 60 лет [Hjelmborg, 2006].
Сильное влияние факторов окружающей среды на феномен долгожительства может ослаблять эффект генетических факторов, что отчасти объясняет отсутствие ассоциаций в некоторых исследованиях [Khabour, 2009]. Кроме того, в формирование фенотипов старения и долгожительства вносит вклад эпистатическое взаимодействие между полиморфными вариантами ядерных генов и вариабельностью мтДНК [Capri, 2006], также как между соматическими мутациями ДНК и наследуемыми гаплогруппами и подгаплогруппами мтДНК [Santoro, 2006].
Окислительный стресс вносит вклад не только в процесс старения, но и патогенез различных заболеваний, включая атеросклероз, ишемическую болезнь сердца (ИБС), гипертоническую болезнь, кардиомиопатии, нарушения мозгового кровообращения, онкологические заболевания, сахарный диабет, нейродегенеративные заболевания [Болдырев, 1995; Diaz, 1997; Владимиров, 1998; Зенков, 2001; Воробьева, 2005; Меньшикова, 2006; Максименко, 2007; Ray, 2012].
Клинико-лабораторные методы
Показано, что активность параоксаназы 1 значительно выше в группе контроля, чем у лиц, перенесших инфаркт миокарда. Возрастное снижение активности наблюдалось у носителей генотипа QQ полиморфного варианта Q192R гена PON1 (генотип низкой активности), особенно в группе лиц, перенесших инфаркт миокарда. Активность параоксаназы 1 и возраст негативно коррелируют у пациентов с инфарктом миокарда, но не в группе контроля. Активность параоксаназы 1 снижается с возрастом у гомозигот по аллелю Q. Риск инфаркта миокарда возрастает у лиц с низкой активностью фермента, т.е. у носителей QQ генотипа [Senti, 2001].
Некоторые исследования сообщают об ассоциации полиморфного варианта Q192R с ИБС [Ferre, 2002; Robertson, 2003], по данным других исследователей этот полиморфный вариант повышает риск только при наличии других факторов (курение, диабет, нездоровое питание) [Ruiz, 1995; Pfohl, 1999].
Отмечено, что генотип RR чаще встречается у больных ИБС [Mendonca, 2008; Agrawal, 2009]. Положительная ассоциация аллеля R с ИБС выявлена в популяциях азиатских индийцев [Pati,1998], европейцев Северной Америки [Bhattacharyya, 2008], японцев [Odawara, 1997], европейцев [Lawlor, 2004; Ruiz, 1995] и северных индийцев [Agrawal, 2009]. В то время как в популяциях китайцев [Ко, 1998], корейцев [Hong, 2001], испанцев [Ferre, 2002], итальянцев [Ombres, 1998], европейцев из Британии [Lawlor, 2004] и финнов [Antikainen, 1996] ассоциации не было обнаружено.
Интересные данные были получены американскими исследователями. Они провели анализ ассоциаций полиморфных вариантов PON1 с ИБС у женщин. Ассоциаций не было найдено ни среди европейских женщин, ни среди африканских женщин. Однако среди белых женщин частота генотипа RR полиморфного варианта Q192R была значительно выше в группе с 3-х-сосудистым поражением по сравнению с другими группами [Chen, 2003].
Российскими исследователями выявлена ассоциация низкой активности параоксаназы с генотипом RR по гену PON1 (Q192R) у мужчин, перенесших инфаркт миокарда (ИМ) до 45 лет [Пардо Пералес, 2009]. Также были выявлены различия в распределении генотипов в группах мужчин с ИБС и ИМ в возрасте до 45 лет и женщин с ИБС. Носителей генотипа 55ММ в группе женщин, больных ИБС, было примерно в 2 раза больше, а носителей генотипа 192QR в 1,3 раза меньше, чем в группе мужчин, перенесших ИМ в возрасте до 45 лет [Пардо Пералес, 2009].
Показано, что гомозиготное носительство LL генотипа полиморфного варианта L55M, ассоциированного с высокой активностью параоксаназы, является фактором риска ССЗ [Garin, 1997]. Аллель М полиморфного варианта L55M оказывает протективное действие по отношению к ИБС у пациентов в группе риска ССЗ [Oliveira, 2004]. По данным других исследователей ММ генотип более распространен в выборке с ИБС, но статистически значимых различий не выявлено [Mendonca, 2008]. В популяции северных индийцев также не обнаружено статистически достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту L55M [Agrawal, 2009].
Area не выявили ассоциации полиморфного варианта L55M и его комбинации с Q192R с ИБС [Area, 2002]. Однако другими исследователями обнаружено, что гаплотип RL был также значительно ассоциирован с риском ИБС [Agrawal, 2009].
Данные об ассоциациях полиморфных вариантов PON1 с ИБС подтверждаются не всегда и не во всех популяциях. Возможно, что другие факторы, такие как значительные межиндивидуальные различия в активности и концентрации параоксаназы 1 также вносят свой вклад в защитное действие параоксаназы от ИБС. Кроме того, на активность параоксаназы 1 влияют модифицирующие факторы, такие как образ жизни, диета, заболевания. Противоречивые результаты могут быть в связи с малым размером выборок, либо с различной стратегией формирования выборок, включением небольшого количества пациентов из других популяций, межэтнической дифференциацией [Gardemann, 2000]. 1.3. Обоснование выбора генов и полиморфных вариантов, включенных в исследование
Так как окислительный стресс развивается вследствие нарушения баланса между работой прооксидантной системы и системы антиоксидантной защиты [Воробьева, 2005; Fariss, 2005; Burton, 2011], то в нашем исследовании мы постарались изучить вклад генов компонентов как про-, так и антиоксидантной системы в определение продолжительности жизни и развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Общая схема участия ферментов и белков, гены которых были изучены, в регуляции окислительного стресса, представлена на рисунке 2.
Старение и апоптоз Снижение продолжительности жизни Сердечно-сосудистые заболевания ядерная ДНК Схема участия ферментов и белков, гены которых были изучены, в регуляции окислительного стресса Для исследовании были выбраны гены компонентов основных источников АФК: НАДФН-оксидазы макрофагов и нейтрофилов [Мапеа, 2010; Dikalov, 2011; Lassegue, 2012] и дыхательной цепи митохондрий [Андреев, 2005; Тодоров, 2007; Kowaltowski, 2009; Murphy, 2009]. Некоторые компоненты дыхательной цепи кодируются митохондриальной ДНК [Taylor, 2005; Greaves, 2012], на функционирование которой оказывают влияние ядерные гены: ген митохондриалыюго фактора транскрипции A (TFAM) [Litonin, 2010; Ngo, 2011; Campbell, 2012] и ген митохондриальной ДНК-полимеразы у (POLG) [Chan, 2009; Copeland, 2010; Saneto, 2010]. При нарушении работы дыхательной цепи может повышаться уровень генерации АФК [Fariss, 2005; Tsutsui, 2009; Wei, 2009].
Из компонентов антиоксидантной системы в исследование были включены гены ряда ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы [Владимиров, 1998; Меньщикова, 2006; Halliwell, 2012], а также параоксаназы, которая препятствует окислительной модификации липидов [Marchegiani, 2008; Rosenblat, 2009; Sapian-Raczkowska, 2010].
Полиморфизм генов окислительного стресса может оказывать влияние на уровень окислительного стресса [Halliwell, 2012], который, посредством повреждения макромолекул (белков, липидов, нуклеиновых кислот), вносит вклад как в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний (атеросклероз, ИБС) [Болдырев, 1995; Владимиров, 1998; Зенков, 2001; Воробьева, 2005; Меньщикова, 2006; Diaz, 1997; Ray, 2012], так и в механизм старения и апоптоза [Анисимов, 2003; Ляхович, 2005; Скулачев, 2007, 2009; Тодоров, 2007]. Выбор полиморфных вариантов изученных генов был обусловлен достаточной для исследования степенью гетерозиготности, функциональной значимостью локусов, данными других исследований о возможной связи локусов с продолжительностью жизни и развитием сердечно-сосудистых заболеваний (табл. 1). В работе были исследованы как активно изучаемые в настоящее время полиморфные варианты: Alal6Val гена супероксиддисмутазы-2 (S0D2) - около 80 исследований, Prol98Leu гена глутатионпероксидазы 1 (GPX1) - 24 исследования, и С-262Т гена каталазы (CAT) - 22 исследования [Crawford, 2012], Met55Leu и Argl92Gln гена параоксаназы-1 (PON1), так и малоизученные полиморфные локусы: С242Т гена а-субъединицы НАДФН-оксидазы (CYBA), Serl2Thr гена митохондриального фактора транскрипции A (TFAM), Т/С гена митохондриальной ДНК-полимеразы у (POLG). Кроме того, изучен вклад гаплогрупп и локусов Т16519С и Т16189С митохондриальной ДНК в определение продолжительности жизни и развитие сердечно-сосудистых заболеваний.
Анализ ассоциаций изученных полиморфных локусов ядерных генов с ишемической болезнью сердца и продолжительностью жизни
Полиморфизм митохондриальной ДНК исследовали путем секвенирования первого гипервариабельного сегмента (ГВСІ) D-петли мтДНК. Нуклеотидные последовательности, полученные в результате секвенирования, сравнивали с референсной последовательностью мтДНК [Anderson S. et al., 1981] с использованием программы BioEdit. На основе анализа специфических замен устанавливали принадлежность определенным гаплогруппам. В дальнейшем, принадлежность гаплогруппам проверяли с помощью рестрикционного аланиза специфических сайтов, локализованных в кодирующей части мтДНК.
Для анализа ассоциаций полиморфизма мтДНК с изучаемыми фенотипами были выбраны наиболее частые гаплогруппы: Н, HI, HV, I, J, Т, U4, U5a, U5b, U-K, V и W.
Каждая гаплогруппа характеризуются определенным набором полиморфных вариантов, большинство из которых являются нейтральными, однако, некоторые замены могут оказывать влияние на работу комплексов дыхательной цепи, скорость окислительного фосфорилирования и уровень АФК. Показано, что у носителей разных гаплогрупп различаются уровень мтДНК и мтРНК, активность цитохром оксидазы и количество потребляемого кислорода [Gomez-Duran, 2010], наблюдаются различия в уровне продукции АФК [Moreno-Loshuertos, 2006].
Также для исследования было выбрано два полиморфных варианта в регуляторном участке мтДНК: Т16189С и Т16519С. Замена Т16189С приводит к образованию полицитозинового тракта в D-петле мтДНК. Носительство данного полиморфного варианта может повреждать способность клетки должным образом отвечать на окислительный стресс и окислительные повреждения [Lin, 2005]. Кроме того, замена Т16189С приводит к снижению числа копий мтДНК в клетках крови человека, что объясняется влиянием варианта на процессы репликации мтДНК. Снижение колическтва мтДНК может приводить к развитию митохондриальных заболеваний [Liou, 2010]. Полиморфный вариант Т16519С - один из наиболее распространенных в D-петле мтДНК [Symonette, 2011]. Для данного локуса была выявлена ассоциация с уровнем триглицеридов в крови [Hegele, 1997], а также отмечена ассоциация аллеля Т с короткой продолжительностью жизни и сахарным диабетом [Navaglia, 2006].
Распределение частот гаплогрупп и полиморфных вариантов Т16189С и Т16519С мтДНК в контрольной группе, выборке больных ИБС, у лиц, умерших до 55 лет от ССЗ, и у долгожителей представлено в таблице 13. Наиболее частыми во всех изученных выборках оказались гаплогруппы Н, U, Т и J. Их суммарная частота варьировала от 80 до 86% (Рис. 9). Такое распределение характерно для европеоидных популяций, где эти гаплогруппы наиболее распространены.
Следует отметить, что в нашем исследовании мы анализируем отдельно от гаплогруппы Н наиболее частую ее подгруппу HI. Таблица 13 Частоты гаплогрупп Н, HI, HV, I, J, T, U4, U5a, U5b, U-K, V, W и аллеля С полиморфных вариантов Т16189С и Т16519С в исследованных выборках, %
Примечание: Частота гаплогруппы H не включает в себя частоту HI. Частота гаплогруппы Н, не включая ее подгаплогруппу НІ, в изученных выборках варьировала от 17,24% в группе мужчин долгожителей до 36,94% в группе мужчин, больных ИБС. В популяциошюй выборке частота данной гаплогруппы составила 26,65%, в группе долгожителей -22,63%, в группе умерших до 55 лет от ССЗ - 24,47%, а в группе больных ИБС - 35,43%.
Распределение частот гаплогруппы НІ в основных изученных выборках было следующим: в группе долгожителей частота данной гаплогруппы составила 13,17%, что немного выше, чем в контрольной группе - 12,03%; в группе больных ИБС гаплогруппа HI встречалась с частотой 9,14%, а в группе лиц, умерших от ССЗ до 55 лет- 21,28%.
Частота гаплогруппы Т в популяционной выборке составила 9,91%, что незначительно отличается от частоты этой гаплогруппы в выборке долгожителей - 10,29%. В группе больных ИБС гаплогруппа Т встречалась с частотой 7,43%, а среди лиц, умерших от ССЗ до 55 лет - 6,38%.
Гаплогруппа J в контрольной группе, у долгожителей и больных ИБС встречалась с частотой 7,31%; 8,64% и 7,43% соответственно, в то время как у лиц, умерших до 55 лет от ССЗ - 4,26%. Частота аллеля С полиморфного варианта Т16519С в контрольной выборке составила - 54,48%, в группе долгожителей - 59,07%, в группе больных ИБС - 49,71%, а лиц, умерших от ССЗ до 55 лет - 61,70%. Аллель С полиморфного локуса Т16189С встречался практически с одинаковой частотой в основных исследованных выборках: в группе долгожителей - 19,75%, в контрольной группе - 18,63%, у больных ИБС -18,86% у среди лиц, умерших от ССЗ - 18,09%.
С целью поиска ассоциаций гаплогрупп Н, HI, HV, I, J, Т, U4, U5a, U5b, U-K, V и W, а также полиморфных вариантов Т16189С и Т16519С с ИБС и продолжительностью жизни был проведен попарный сравнительный анализ распределения частот данных гаплогрупп и полиморфных локусов между обследованными выборками.
Анализ ассоциаций с долгожительством
Сравнительный анализ проводили между следующими выборками: долгожители и контрольная группа, долгожители и умерших от ССЗ до 55 лет. Сравнение проводили как в общих выборках, так у мужчин и женщин по отдельности. Вследствие малочисленности группы женщин, умерших от ССЗ до 55 лет, сравнение их с женщинами-долгожителями не проводили. Данные сравнительного анализа представлены в таблице 14.
Статистически значимых различий в частотах гаплогрупп и аллелей изученных полиморфных вариантов не выявлено. Однако, ранее для гаплогрупп мтДНК, распространенных в европейских популяциях, были показаны ассоциации с долгожительством. Отмечалось, что гаплогруппа Н у долгожителей встречалась реже, в то время как гаплогруппа U - чаще [Niemi, 2003]. Снижение частоты гаплогруппы Н наблюдалось у лиц старческого возраста в популяции татар [Паук, 2007]. Также выявлена ассоциация гаплогруппы J с долгожительством [De Benedicts, 1999; Ross, 2001; Niemi, 2003; Ren, 2008]. Наши данные этого ие подтверждают, но согласуются с данными крупного проспективного исследования, проведенного в популяциях Северной Европы, которое не выявило ассоциаций гаплогрупп мтДНК с долгожительством [Вепп, 2008].
Анализ фенотипической изменчивости количественных признаков в популяционной выборке и в группе больных ишемической болезнью сердца
В рамках настоящего исследования был осуществлен анализ вклада полиморфных вариантов генов, задействованных в метаболических путях регуляции окислительного стресса, в формирование трех фенотипов: ишемическая болезнь сердца, долгожительство ( 90 лет) и ранняя смерть (до 55 лет) от сердечно-сосудистых заболеваний. Были изучены полиморфные варианты генов ферментов системы антиоксидантной защиты: Alal6Val супероксиддисмутазы-2 (SOD2), Prol98Leu гена глутатионпероксидазы-1 (GPX1), С-262Т гена каталазы (САГ), Glnl92Arg и Leu55Met гена параоксаназы-1 (PON1). Также были изучены полиморфные варианты гены ферментов и белков, обладающих прооксидантным действием: С242Т гена CYBA, кодирующего а-субъединицу НАДФН-оксидазы - одного из главных источников супероксида в клетках сосудов; полиморфизм мтДНК, кодирующей субъединицы дыхательной цепи митохондрий - основного источника активных форм кислорода; а также локусы ядерных генов, оказывающих влияние на функционирование мтДНК: Serl2Thr гена митохондриального фактора транскрипции A (TFAM) и полиморфного варианта варианта Т/С (rs2238296) гена митохондриалыюй ДНК-полимеразы у (POLG).
В результате исследования были показаны ассоциации исследованных полиморфных локусов и гаплогрупп мтДНК с изученными фенотипами и с изменчивостью количественных признаков, значимых для функционирования сердечно-сосудистой системы (ЭхоКГ показатели, показатели липидного обмена, индекс массы тела) в популяционной выборке и в группе больных ИБС. Часть выявленных ассоциаций являются подтверждением ранее установленных другими исследователями ассоциаций, однако для некоторых локусов ассоциации с фенотипами были установлены впервые.
Так, нами впервые выявлена ассоциация аллеля Т полиморфного локуса С242Т гена СУВА с высокой продолжительностью жизни у женщин. Для мужчин подобной ассоциации не было выявлено.
В отношении развития ишемической болезни сердца ассоциации были получены для трех локусов ядерного генома: Alal6Val гена SOD2, Serl2Thr гена TFAM, Prol98Leu гена GPX1. Полученные нами данные о роли полиморфного варианта Alal6Val гена SOD2 в развитии ИБС подтверждают данные других исследователей: аллель Т (Val) ассоциирован с ИБС. Впервые показано, что генотип СС (Thr/Thr) полиморфного маркера Serl2Thr гена TFAM ассоциирован с риском развития ИБС у мужчин. Результаты проведенного исследования указывают также па вклад полиморфного варианта Prol98Leu гена GPX1 в развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Выявлена ассоциация аллеля Т (Leu) с ИБС у мужчин и генотипа ТТ (Leu/Leu) с ранним инфарктом миокарда у больных ИБС, что согласуется с данными других исследователей. Кроме того, частота генотипа TT(Leu/Leu) локуса Prol98Leu гена GPX1 статистически значимо выше у больных ИБС, чем у долгожителей. Также отмечена ассоциация аллеля Т (Leu) и генотипа ТТ (Leu/Leu) полиморфного варианта Prol98Leu гена GPX1 с ранней смертностью (до 55 лет) от сердечно-сосудистых заболеваний в группе мужчин.
Результаты анализа вклада сочетаний полиморфных вариантов ядерных генов в формирование изученных фенотипов свидетельстуют о незначимом влиянии исследованных локусов на продолжительность жизни, но показан статистически значимый сочетанный вклад этих полиморфных вариантов в развитие ишемической болезни сердца.
В результате исследования ассоциаций гаплогрупп мтДНК с изученными фенотипами показано, что гаплогруппа Н и ее подгаплогруппа HI являются фактором риска развития ИБС и ранней смертности (до 55 лет) от ССЗ.
Установлено, что полиморфизм ряда изученных локусов вносит вклад в изменчивость количественных показателей артериального давления, липидного обмена, показателей ЭхоКГ-исследования и индекс массы тела в популяционной выборке и в группе больных ИБС. В контрольной группе у мужчин отмечена ассоциация Alal6Val (SOD2) с индексом массы тела, В изменчивость показателей липидного обмена вносят вклад Alal6Val {SOD2) и гаплогруппа Н у мужчин и С242Т (CYBA) у женщин. Локус Prol98Leu (GPX1) ассоциирован с толщиной задней стенки левого желудочка и межжелудочковой перегородки. Отмечено влияние Glnl92Arg (PON1) на показатели артериального давления у женщин. В группе больных ИБС ассоциации выявлены с индексом массы тела и фракцией выброса. Индекс массы тела был ассоциирован с двумя локусами: Prol98Leu (GPX1) и С242Т (CYBA), а фракция выброса только с маркером Prol98Leu гена GPX1.
В целом, полученные данные свидетельствуют, что наличие определенных генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции окислительного стресса, и носительство некоторых гаплогрупп митохондриальной ДНК может оказывать влияние на предрасположенность к развитию ишемическои болезни сердца и ранней смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, а также на формирование фенотипа долгожительства.
Результаты исследования позволяют приблизиться к пониманию роли генетических факторов окислительного стресса в развитии ишемическои болезни сердца и определении продолжительности жизни, а также открывают перспективы для дальнейших исследований. Полученные данные вместе с результатами других исследований могут использоваться в разработке алгоритмов прогнозирования и профилактики сердечнососудистых заболеваний и увеличения продолжительности жизни людей.
