Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор
1. Бурая жировая ткань и ее функции 7
1.1. Нор адреналин как основной функциональный регулятор клеток бурого жира 10
1.2. Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования 11
1.3. Термогенин - разобщающий белок митохондрий бурой жировой ткани. 14
1 А. Адренергические рецепторы клеток бурого жира 17
1.5. Агонисты и антагонисты адренорецепторов клеток бурого жира. 20
2. Са2+-система сигнализации и её взаимодействие с самр-сигнализацией в клетках бурого жира 22
2.1. Са -транспортирующие системы электроневозбудимых клеток 22
2.1.2. Механизмы входа Са2+ в клетки 23
2.1.3. Пути выхода Са2+ из клетки 27
2.2. Взаимодействие с AMP- и Са2+- сигнальных путей 29
3. Хладоадаптация и зимняя спячка как модели для изучения механизмов регуляции развития бурой жировой ткани 31
Глава II. Материалы и методы исследований 41
1. Содержание экспериментальных животных 41
2. Выделение и подсчет клеток . 41
3. Используемые среды. 42
4. Измерение [Са ]j 43
5. Описание установки 43
6. Определение плотности oti адренорецепторов радио-лигандным методом 46
7. Используемые реактивы 46
Глава III. Результаты исследований 47
1. Участие си и р адренорецепторов в формировании Са2+-сигнала в преадипоцитах мышей в ответ на норадрєналин 47
2. Влияние антагонистов сер и (3-адренергических рецепторов на вызванный норадреналином Са2+-ответ в бурых преадипоцитах 52
3. Са2+-ответы, инициированные в клетках ВгсАМР 53
4. Изменение Са +-ответа на норадрєналин при развитии ткани в условиях хладоадаптации 55
5. Са2+-ответы на норадрєналин в бурых преадипоцитах зимоспящих 60
Глава IV.Обсуждение. 64
1. Р адренорецепторы формируют Са -сигнал в бурых преадипоцитах мышей 64
2. Гиперплазия ткани сопровождается усилением Са2+-сигнала в бурых преадипоцитах мышей 70
3. Са -сигнализация в бурых преадипоцитах зимоспящих 75 Заключение 78 Выводы 79 Список цитированной литературы 80 Список работ по теме диссертации 109
- Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования
- Выделение и подсчет клеток
- Влияние антагонистов сер и (3-адренергических рецепторов на вызванный норадреналином Са2+-ответ в бурых преадипоцитах
- Гиперплазия ткани сопровождается усилением Са2+-сигнала в бурых преадипоцитах мышей
Введение к работе
Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1. БУРАЯ ЖИРОВАЯ ТКАНЬ И ЕЕ ФУНКЦИИ 7
Нор адреналин как основной функциональный регулятор клеток бурого жира 10
Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования 11
Термогенин - разобщающий белок митохондрий бурой жировой ткани.
1 А. Адренергические рецепторы клеток бурого жира 17
1.5. Агонисты и антагонисты адренорецепторов клеток бурого жира. 20
2. Са2+-СИСТЕМА СИГНАЛИЗАЦИИ И ЕЁ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С
сАМР-СИГНАЛИЗАЦИЕЙ В КЛЕТКАХ БУРОГО ЖИРА 22
2.1. Са -транспортирующие системы электроневозбудимых клеток 22
Механизмы входа Са2+ в клетки 23
Пути выхода Са2+ из клетки 27
2.2. Взаимодействие с AMP- и Са2+- сигнальных путей 29
3. ХЛАДОАДАПТАЦИЯ И ЗИМНЯЯ СПЯЧКА КАК МОДЕЛИ ДЛЯ
ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ БУРОЙ
ЖИРОВОЙ ТКАНИ 31
Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования
Среди природных веществ-разобщителей большой интерес представляют длинно цепочечные жирные кислоты. Их разобщающее действие было открыто в 1956 г. На протяжении многих лет внимание к жирным кислотам как к эндогенным разобщителям было направлено восновном на изучение их роли в термогенезе [Скулачев, 1962; Nichols & Locke, 1984; Скулачев, 1989; Brustovetsky et al., 1990; Brustovetsky et ah, 1992; Daikoku et al., 1997] и в повреждении клеток и тканей при различных патологических состояниях организма [Boime et al., 1970; Corr et al., 1984; Биленко, 1989; Lenton et al., 1995].
По характеру своего действия на митохондрии жирные кислоты похожи на классические разобщители-протонофоры (ДНФ, ТТФБ, SF6847), что позволило говорить о наличии общего механизма действия [Shol ts & Zakharova, 1977; Schonfeld et al., 1989; Shinohara et al., 1995].Следует, однако, заметить, что сам факт установления протонофорной активности жирных кислот на изолированных митохондриях нельзя рассматривать как свидетельство в пользу того, что эти соединения функционируют как классические разобщители-протонофоры, для которых характерна способность пересекать фосфолипидную мембрану митохондрий, как в форме нейтральной молекулы, так и в форме аниона [Hanstein, 1976; Terada, 1981; Скулачев, 1989]. Предполагается, что в реализации протонофорной активности жирных кислот на митохондриях принимают участие белки-переносчики анионов внутренней мембраны [Samartsev et al, 1999]. В связи с этим говорить о том, что жирные кислоты функционируют как разобщители-протонофоры, можно только в том случае, если известно, что эти соединения в процессе разобщения способны переносить протоны непосредственно через фосфолипидные структуры мембраны без участия переносчиков анионов.Было показано, что митохондрии, выделенные из бурой жировой ткани адаптированных к холоду или новорожденных крыс, хомяков и морских свинок, не способны к окислительному фосфорилированию, если они были получены методами, которые применяются для выделения митохондрий из других тканей [Lindberg et al., 1967; Pedersen et al., 1968]. Способные к синтезу ATP митохондрии удалось получить в присутствии всреде выделения альбумина, который связывал жирные кислоты, ассоциированные с изолированными митохондриями [Aldridge & Street, 1968; Guillory & Racker, 1968]. Альбумин мог быть заменен коферментом А, карнитином и АТР, которые необходимы для активации и окисления жирных кислот [Hittelman et al., 1969].
Удаление тем или иным способом эндогенных жирных кислот из митохондрий бурой жировой ткани приводит, кроме того, к восстановлению и других свойств сопряженных митохондрий: АТР/Рг обмена и стимулируемой ДНФ АТР-азной активности при отсутствии эндогенной М2+-зависимой АТР-азной активности [Bulychev et al., 1972]. Однако, даже в присутствии альбумина в среде инкубации в митохондриях бурой жировой ткани, выделенных из адаптированных к холоду животных, не удалось получить классическую стимуляцию дыхания, характерную для прочно сопряженных митохондрий печени [Drahota et al, 1968; Christiansen et al., 1969; Grav et al., 1970; Horwitz & Eatom, 1975; Horwitz, 1979]. Позднее было показано, что хороший дыхательный контроль для этих митохондрий можно получить при добавлении в среду инкубации вместе с альбумином АТР или GTP в миллим олярных концентрациях [Horwitz & Eatom, 1975; Horwitz, 1979; Nedergaard et al,, 1999; Ricquier & BouiUaud, 2000].Митохондрии из термогенно активируемой бурой жировой ткани имеют очень высокую проницаемость для протонов, которая снижается как при устранении эндогенных жирных кислот, так и при добавлении пуриновых нуклеотидов [Nicholls & Lindberg, 1973; Nicholls, 1974], Удаление только одних жирных кислот недостаточно для устранения аномально высокой протонной проводимости, которая даже в отсутствие жирных кислот имеет значение, на порядок больше, чем это характерно для митохондрий печени. Добавление пуриновых нуклеотидов в отсутствие жирных кислот значительно снижает протонную проводимость [Nicholls, 1974; Nicholls, 1977; Nicholls & Bernson, 1977].
Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования значительно более эффективны в митохондриях бурой жировой ткани, чем в митохондриях других тканей. В частности, было показано, что митохондрии печени и бурой жировой ткани имели эффективные протонные проводимости, повышающиеся соответственно на 0,028 и 0,94 нмоль Н /мин на 1 мВ протонного электрохимического градиента на каждый связанный нмоль пальмитиновой кислоты.Разобщающий белок содержится во внутренней мембране митохондрий БЖТ и составляет до 10-15% общего митохондриального белка [Nicholls and Locke, 1984]. Показано, что разобщающий белок представляет собой димер, состоящий из идентичных полипептидов, имеющих молекулярную массу около 32 кДа [Rial et al., 1983]. Для многивидов животных была определена аминокислотная последовательность этого белка и показана высокая степень их гомологичности [Aquila et al., 1985]. Имеются также данные о большом сходстве первичных структур и ряда других свойств разобщающего белка и переносчика адениннуклеотидов [Aquila et al., 1985]. Высказывается предположение, что разобщающий белок произошел от АТФ/АДФ-антипортера, который утратил свою основную функцию (нуклеотидтранспортирующую) и специализировался на дополнительной функции - разобщении жирными кислотами [Скулачёв, 1989].
Как отмечалось выше, разобщающий белок является регулируемым Н+ -каналом. Однако имеются данные, что этот белок участвует также в транспорте анионов. Было показано, что митохондрии БЖТ имеют высокую проницаемость для ионов СГ [Houstek et al., 1972; Nicholls and Locke, 1984]. Кроме ионов ЬҐ и СГ разобщающий белок может также транспортировать такие анионы, как Вг и NO" [Nicholls and Locke, 1984].При снижении окружающей температуры происходит стимуляция нервной симпатической системы и выделение НА в бурой жировой ткани а- и Р- адренорецепторами. Связывание норадреналина с этими рецепторами приводит к активации разобщающего белка, что, в свою очередь, приводит к 20-40 кратному увеличению скорости дыхания и выделения тепла [Heaton, Nicholls, 1977]. Механизм активации разобщающего белка на уровне митохондрий до конца не выяснен. Наиболее вероятными физиологическими регуляторами in vivo считаются жирные кислоты и АТР. Показано, что для этих двух модуляторов существуют специфические места связывания на молекуле разобщающего белка [Nicholls, 1974]. UCP1 опосредует разобщение дыхательной цепи митохондрий и АТР синтетазы и таким образом обеспечивает производство тепла в бурых адипоцитах. Вопрос о том, каков механизм, при помощи которого UCP1 опосредует разобщение, нетривиален: было показано что UCP1 транспортирует протоны (или их эквиваленты) и
Выделение и подсчет клеток
Мышей в возрасте 3-5 недель забивали методом цервикальной дислокации. Увлажняя шерсть спиртом, кожу надрезали, и аккуратно снимали, получая доступ к бурому жиру. Забор ткани производили из межлопаточной и шейных областей. Кусочки бурого жира помещали в чашку Петри с 2 мл охлажденного изоляционного буфера [Nechad et al., 1983b; Bronnikov et al., 1999a]. Бурую жировую ткань очищали от белой жировой ткани, соединительной ткани и крови, затем тщательно измельчали с помощью ножниц и переносили в пробирки с раствором коллагеназы для удаления внеклеточного матрикса, 0,5-0,6 мг коллагеназы (Sigma) на 1 мл изоляционного буфера, готовится непосредственно перед опытом из расчета 2-2,5 мл раствора на одно животное.
Гомогенат ткани инкубировали с коллагеназой на водяной бане при 26 С в течение 25 мин, периодически встряхивая. Процесс разрушения межклеточных контактов останавливали охлаждением пробирок во льду в течение 15-30 мин. Суспензию клеток отфильтровывали на грубом нейлоновом фильтре (размер пор 250 микрон) и центрифугировали при 1200 g в течение 10 мин на центрифуге К-23 ("MLW\ Германия). Слой белого жира удаляли и супернатант отсасывали шприцем с длинной иглой. Затем осадок ресуспендировали в 9 мл среды DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (BSA) рН 7,4, отфильтровывали на нейлоновом фильтре (размер пор 25 микрон) и центрифугировали при 1200 g в течение 10 минут. Супернатант отсасывали шприцем, осадок ресуспендировали в DMEM (без альбумина), доводя объем до 1 мл. Полученная суспензия содержала молодые преадипоциты, так как зрелые адипоциты содержат жировые капли и не осаждаются при данных параметрах центрифугирования. Количество клеток в суспензии считали в камере Горяева. Как правило, одновременно определяли жизнеспособность клеток при использовании трипанового синего. Живые клетки не проницаемы для красителя, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются. Жизнеспособность клеток оценивалась по окраске клеток 0,04% трипановым синим и составляла во всех опытах не менее 90%. Состав изоляционного раствора: 123 мМ NaCI (хч., Реахим); 5 мМ КС1 (осч., Реахим); 1,3 мМ СаС12 (Flow Laboratories); 5 мМ глюкозы (ч., Реахим); 20 мМ HEPES (Sigma); 0,5 % BSA (Serva). (СаСЬ и BSA добавляются после доведения рН до 7,4) [Методы культивирования клеток, 1988]. Для измерения [Са ]; клетки бурого жира нагружали флуоресцентным красителем Fura-2/AM. Fura-2/AM - это вариант Са2+ хелатора ВАРТА [Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y., 1985]. Эти соединения имеют большой отрицательный заряд и поэтому не способны проходить через плазматическую мембрану клетки.
Отрицательные заряды карбоксильных групп нейтрализуются путем эстеризации. В виде ацетооксиметильного эфира Fura-2/AM пассивно проникает через плазматическую мембрану. В цитоплазме клеток эфирные связи расщепляются внутриклеточными эстеразами, зонд становится гидрофильным и не выходит из клетки [Авдонин П.В., Ткачук В.А., 1994; Borle А.В. and Snowdowne K.W., 1987]. Суспензию клеток (1-Ю клеток/мл) инкубировали с 4 мкМ флуоресцентного красителя Fura 2/АМ в течение 40 минут при 37С. Окрашенные клетки отмывали от внешнего красителя и ресуспендировали в среде Хенкса с добавлением 10 мМ HEPES, рН= 7,2 при 37С. Полученную суспензию инкубировали 10-15 мин при 37 С, центрифугировали 2 мин при 1200 g, супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в нужном объеме рабочей среды. Эксперименты выполнены на установке, специально сконструированной для изучения суспензий клеток и органелл (Холмухамедов и др., 1980). Установка представляет собой комплекс микроспектрофлуоримента и сложной термостатируемой ячейки со встроенными Н - и К+-электродом и магнитной мешалкой. Особенностью флуориметра также является применение высокоаппертурной контактной оптики, обеспечивающей концентрацию возбуждающего света в небольшом объёме постоянно перемешиваемой суспензии. Схема установки представлена на рис. 4. Регистрация сигналов осуществлялась на компьютере с частотой опроса 1 Гц при помощи программы «Record4». Значения интенсивности флуоресценции пересчитывали в [Ca2+]j, используя графическую программу Origin 7.0 Длина волны возбуждения флуоресценции -337 нм, регистрации - 520 нм. [Ca2+]i рассчитывали по формуле: [Ca rKdCF-F CF -F), где: F-наблюдаемая интенсивность флуоресценции, Fmax- флуоресценция красителя, насыщенного Са , Fmin - флуоресценция красителя, свободного от Са , Kd = 224 нМ при 37С. Fmax - измеряли после добавления б мкМ дигитонина. Fmi[1 измеряли после добавления 4 мМ ЭГТА. Уровень собственной флуоресценции вычитали после добавления 100 мкМ Mn . Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием программ Origin 7.0 и Excel. Рис. 4. Схема установки.
Спектрофлюориметр снабжен приставкой (1) к монохроматору (2) для одновременного измерения интенсивности оптического сигнала на трех выбранных длинах волн. Приставка (1) представляет собой блок из трех фотоэлектронных умножителей (ФЭУ), по одному ФЭУ на каждый оптический канал. Свет возбуждения люминесценции от источника (6) через систему фильтров (5) отражается от светоделительной пластинки (4) и фокусируется контактным объективом (7) на суспензию клеток, находящихся в ячейке. Сигнал для измерения 90-СР подается от другого источника света (15) через соответствующие светофильтры (14). Объективом (13) этот свет фокусируется на торец световода диаметром 1 мм 12 и подается в ячейку. Рассеянный свет и свет люминесценции собирается контактным микрообъективом (7) и направляется в спектрограф. В спектрографе этот световой поток
Влияние антагонистов сер и (3-адренергических рецепторов на вызванный норадреналином Са2+-ответ в бурых преадипоцитах
Для подтверждения главенствующей роли [3-адренорецепторов в формировании Са -ответа мы использовали антагонисты соответствующих рецепторов. Антагонисты а і и р рецепторов добавляли к свежевыд еденным преадипоцитам за 2 мин до добавления НА. На рис. 6 показано, что надолол, антагонист Р-адренорецепторов, снижал амплитуду Са2+-ответа на НА практически до нуля ([Са2+]і =116 нМ). В то же время, фентоламин, антагонист о адренорецепторов, снижает Са -ответ на НА лишь незначительно ([Са ]\= 144 нМ). Таким образом, использование антагонистов соответствующих рецепторов позволило подтвердить, что вызванный НА в бурых преадипоцитах Са2+-сигнал определяется, преимущественно, взаимодействием последнего с р-адренорецепторами. Главенствующая роль в формировании Са2+-ответа в бурых преадипоцитах принадлежит Р- адренорецепторам, активация которых вызывает повышение уровня [Са ]-, в преадипоцитах. Наиболее вероятными причинами могли быть следующие: р-адреноререцепторы непосредственно связаны с системой кальциевой сигнализации, например, через сопряженные с G-белками Са2+-каналы [Sako et al., 1997], либо аденилатциклазная система участвует в стимуляции Са -сигнала путем фосфорилирования Са -каналов протеи нкиназой А по типу, описанному ранее для кардиомиоцитов [Sako et al., 1997].
На дифференцированных клетках бурого жира показано, что активация р-адренорецепторов приводит к опосредованной Gj-белками стимуляции аденилатциклазы (АЦ) и к образованию вторичного мессенджера с AMP [Chaudhry & Granneman, 1991; Svoboda et al., 1993; Abramson et al., 1999]. Увеличения внутриклеточного уровня cAMP, если не использовать рецепторный путь, можно также достичь двумя другими способами: 1) добавлением форсколина - непосредственного активатора аденилатциклазы; 2) либо добавлением к клеткам проникающего через плазматическую мембрану аналога сАМР - Вг-сАМР.Как видно из рисунка, кривая зависимости величины Са ответа бурых преадипоцитов имеет колокол ообразный характер, где добавление 500 рМ ВгсАМР вызывает максимальное увеличение [Са ];. Этот график может служить некоторым основанием для объяснения кол около образных кривых зависимости Д[Са ]; от концентрации адренергических агонистов (рис. 9). В последующих экспериментах, проведенных в лаборатории, были получены дополнительные свидетельства такой зависимости [Са2+][ от [cAMP]j. Следует упомянуть, что характер зависимости в некоторой степени подобен, но в то же время, противоположен, колоколообразным дозозависимостям аккумуляции сАМР в зрелых бурых адипоцитах в зависимости от концентрации норадреналина и изопротеренола [Bronnikov etaL, 1999b]. Таким образом мы показали, что Са2+-сигналы, индуцируемые норадреналином в бурых преадипоцитах и зрелых бурых адипоцитах различаются принципиальным образом. Весьма интересно было установить этапы преобразования Са -сигнальной системы в процессе пролиферации преадипоцитов и последующей их дифференцировки, что можно наблюдать в культуре клеток или при гиперплазии и гипертрофии бурой жировой ткани. Удобной моделью для изучения различных функций и механизмов регуляции бурой жировой ткани является экспозиция животных на холоду. У млекопитающих, подвергнутых резкому холодовому воздействию, немедленно увеличивается скорость метаболизма в результате дрожательного термогенеза.
У мелких животных, в том числе у грызунов, это происходит также через активацию специфической функции бурой жировой ткани, где высокий уровень метаболизма обеспечивается через процесс несократительного термогенеза. Длительное холодовое воздействие является тем физиологическим стимулом, что инициирует гиперплазию бурой жировой ткани, и норадреналин, пол и специфический агонист адренорецепторов, играет центральную роль в этом процессе. На рисунке 12 показаны кривые Са -ответов на агонисты адренорецепторов в соответствующие дни хладоадаптации мышей. Схема эксперимента (хладоадаптации) выбрана согласно работе [Renmark and Nedergaard., 1989], где была изучена динамика изменений скорости включения [3Н]-тимидина в ДНК бурой жировой ткани: на 3 и 8-ой день наблюдается два максимума такого включения, тогда как через 14 дней скорость включения тимидина уменьшается до уровня его в контроле (животное в тепле). Трехдневное пребывание животных на холоде (рисунок 12Б), не привело к заметным изменениям Са2+-ответов на р- и ар агонисты в преадипоцитах по сравнению с контрольными животными (рисунок 12А). После восьмидневной акклимации к холоду (рис. 12В) существенным образом выросла скорость входа ионов кальция под действием каждого из агонистов. Как следует из приведенной кинетики, выросла скорость входа ионов кальция под действием каждого из агонистов. Ответ на норадреналин, измерянный как Д[Са2+]; на 20-ой минуте, увеличился более чем в два раза; ответ при действии изопротеренола увеличился в два раза и почти в три раза - под действием циразолина.
Таким образом, Са2+-ответы, инициируемые Р- и агадренорецепторами, стали примерно одинаковыми у животных, экспонированных на холоду в течение восьми дней. Аддитивность в клеточных ответах на р- и а і-агонисты наблюдалась, но формирование Са2+-ответа, инициированного норадреналином, сдвигалось в сторону aj-адренорецепторов, в отличие от контроля, где Са2+-ответ формируется, в основном, Р" адренорецепторами. Пребывание мышей на холоде в течение 14-ти дней (рис. 12Г), привело к тому, что Са2+-ответ на циразолин превысил не только ответ на агонист р- адренорецепторов, но даже на НА, что может свидетельствовать о перестройке Са2+-сигнализации преадипоцитов бурого жира от її редуцированной Са -сигнальной системы, активируемой через р-адренорецепторы и сАМР, в более мощную Са2+-систему, индуцируемую через си -рецепторы, т. е. сходную с таковой у зрелых адипоцитов. В экспериментах по равновесному связыванию а і-специфичного [3Н]-празоцина с мембранами, выделенными из бурой жировой ткани мышей было найдено большое число агрецепторов (Вмах 60 фмоль/мг белка). Через одну неделю пребывания животных на холоде плотность сср рецепторов в ткани увеличилась приблизительно вдвое по сравнению с контролем (Рис. 13), однако в процессе дальнейшей акклимации в течение 2 недель произошло уменьшение плотности ai-адренорецепторов в БЖТ
Гиперплазия ткани сопровождается усилением Са2+-сигнала в бурых преадипоцитах мышей
В результате акклиматизации к холоду или длительного переедания хронически повышается активность симпатической нервной системы БЖТ. Это приводит к гипертрофии ткани, что существенно усиливает возможности термогенеза у животных. Наоборот, длительное уменьшение активности симпатической нервной системы БЖТ вызывает атрофию БЖТ и уменьшает возможности производства тепла. Только зрелые бурые адипоциты отвечают за термогенез, т.к. преадипоциты не содержат белка-разобщителя и не способны к разобщению окислительного фосфорилирования. Известно, что с AMP является вторичным мессенджером с решающей ролью в контроле термогенеза [Zhao et al., 1997], клеточной пролиферации [Bronnikov et ah, 1992], апоптоза [Lindquist & Rehnmark, 1998], и клеточной дифференцировки [Rehnmark et al., 1990; Bronnikov et al., 1999a] бурых адипоцитов. Знание механизма контроля уровня сАМР может быть достаточно для понимания механизма регуляции других клеточных процессов и может быть весьма полезно для поиска фармакологических агентов, контролирующих процессы активации бурых адипоцитов. В бурых преадипоцитах норадреналин стимулирует синтез ДНК и белка по сАМР-зависимому пути. В постконфлуентных клетках норадреналин стимулирует экспрессию гена белка-разобщителя. Была показана линейная корреляция между экспрессией гена и повышением концентрации сАМР [Bronnikov et al., 1999]. Таким образом, процессы; пролиферации, дифференцировки и термогенеза опосредованы одним и тем же мессенджером - с AMP и инициируются через р-адренорецепторы. Роль аі-адренорецепторов в указанных процессах оказалась минорной и сводилась к усилению сигнала: в этом случае ионы Са2+ усиливали стимулирующее действие Р-рецепторов с AMP на термогенез клеток и экспрессию ряда генов [Thonberg et al., 1994; Zhao et al., 1997]. При кратковременной экспозиции на холоде, активация термогенеза происходит очень быстро [Zhao et al., 1997]. Длительные холодовые воздействия приводят к гиперплазии и гипертрофии [Cannon et al., 1996], но этот процесс небесконечен, а останавливается на определенном уровне развития ткани, который обеспечивает рассеивание БЖТ достаточного количества тепла, необходимого для обогрева. В ряде ранних работ было исследовано влияние на адренергическую сигнальную систему хронической активации симпатической нервной системы в результате холодового стресса [Raasmaja et al., 1984], скармливания животным кафетерийной диеты [Raasmaja et al., 1984b] или при повышенном уровне тиреоидных гормонов [Dicker et al., 1992].
Было показано, что длительная активация выброса норадреналина в БЖТ в результате выше указанных воздействий приводила к снижению мощности сигнализации, активируемой в зрелых бурых адипоцитах через р- адренорецепторы и сАМР, которая заключалась или в снижении количества 3-адренорецепторов или Gs белков [Svoboda et al., 1993; Bukowiecki et al., 1982] или приводила к увеличению фосфодиэстеразной активности, понижавшей с AMP в клетке [Unelius et al., 1993], Если подобные изменения наблюдаются и в Р-адренорецептор - инициируемой сигнализации в бурых преадипоцитах, то после холодовой адаптации мы должны будем наблюдать снижение Са2+ ответа преадипоцитов. В работе [Rehnmark, 1989] была выполнена 3-х недельная хладоадаптация мышей, где регистрировалась гиперплазия БЖТ при помощи регистрации включения [ Н]-тимидина в ДНК и измерялось общее количество ДНК в этой ткани. В работе показано существование 2 пиков в возрастании ДНК в ткани: маленький пик на 3 день и общий максимум, который достигается на 17 день хладоадаптации. Повышение включения тимидина, что указывает на скорость пролиферативных процессов, достигает максимума на 8 день, когда, скорее всего и происходит процесс массированной пролиферации клеток. На наш взгляд существование двух пиков указывает на то, что инициация вступления клеток в процесс деления несколько отодвинута, и наступает на 3-4 день и достигает максимума на 8-9 день хладоадаптации. Скорее всего, в первые 3 дня происходит углубленная дифференцировка имеющихся зрелых бурых адипоцитов, сопровождающаяся интенсивным митохондриогенезом и активацией экспрессии генов таких белков как гормончувствительная липаза [Kuusela et al, 1997] и UCP1 [Rehnmark et aL, 1990]. Включение метки в ДНК завершается на 12 день, однако общее количество ДНК продолжает увеличиваться до 18 дня. Эти три характерных периода были выбраны нами для контроля Са сигнализации в бурых преадипоцитах. Как нам удалось показать, изменения в Са2+ -ответах не наблюдаются после 3 дней хладоадаптации т.к. преадипоциты, на наш взгляд, не изменяются или все изменения остаются минимальными. Значимые изменения в Са ответах появляются на 8-ой день, что указывает на то, что хотя большинство клеток остается преадипоцитами, не имеющими Са -сигнализации как у зрелых клеток, но степень их дифференцировки увеличилась. Последний этап начинается после 2 недель хладоадаптации, когда пролиферация заканчивается и происходит углубление дифференцировки, что ведет за собой перестройку С а -сигнализации стволовых клеток бурого жира от редуцированной, активируемой через р-адренорецепторы и сАМР, в Са2+-систему, индуцируемую а\-рецепторами и сходную с таковой у зрелых бурых адипоцитов.
Преадипоциты выделялись в работе методом центрифугирования. Взрослые клетки выделяются обратным методом: при центрифугировании они концентрируются в верхнем плавающем слое, поэтому мы считаем, что наша фракция не может быть загрязнена зрелыми клетками. То же самое показывает проверка под микроскопом, где, судя по размерам клеток, зрелые адипоциты отсутствовали. Представленные результаты по измерениям кинетик показывают, что Са2+-сигнализация изменяется и сдвигается в сторону активации через а і адренорецепторы, но при этом, хотя Са2+ сигнал становится более быстрым и более высоким, но он все же остается существенно ниже, чем Са -ответ в зрелых клетках. Ранее необходимость усиления Са2+ сигнализации в БЖТ была показана на нескольких моделях, где гиперплазия ткани вызывалась: а) холодом [Raasmaja et al., 1984], б) кафетерийной диетой [Raasmaja et al., 1984b], в) повышенным содержанием тиреоидных гормонов [Dicker et al., 1992]; во всех указанных случаях в ткани повышается активность симпатической нервной системы. Во всех случаях авторы нашли увеличение плотности ai адренорецепторов [Raasmaja et al., 1984; Raasmaja et al., 1984b; Dicker et al., 1992]. Как показано на рис. 13 то же самое происходило в нашей работе через неделю хладоадаптации мышей. В работе Кикучи и др. [Kikuchi-Utsumi К. et al., 1997] показано, что после 4-х недель хладоадаптации уровень экспрессии а\в подтипа уменьшался вдвое,
![Полиморфизмы [B]#32#1-адренорецептора и их роль в нарушении функции легких при атопической бронхиальной астме](/i/i/4354/407107.png "Полиморфизмы [B]#32#1-адренорецептора и их роль в нарушении функции легких при атопической бронхиальной астме Васьковский Николай Валерьевич")
