Содержание к диссертации
Введение
I. Анализ энергетических профилей ионов мембранных каналов (на примере потенциал-независимого калиевого канала KCSA) -. 19
1.1. Введение 19
1.2. Расчет энергетических профилей ионов в мембранных каналах 24
1.2.1. Введение 24
1.2.2. Представление ионного канала в системе координат с поворотной осью симметрии 25
1.2.3. Расчет эффективной диэлектрической постоянной и энергии ион-водного комплекса в поре канала 30
1.2.4. Расчет энергетических профилей методами силового поля 33
1.2.5. Расчет взаимодействия местных анестетиков с модельными каналами методом силового поля 37
1.2.6. Разделение дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических профилей: описание и физическое обоснование метода 41
1.2.7. Результаты и их обсуждение 57
1.3. Расчет функциональных характеристик одиночных каналов 62
1.3.1. Введение 62
1.3.2. Ионный ток, проводимость и вольтамперная характеристика одиночного канала 66
1.3.3. Результаты и их обсуждение 69
1.4. Неэмпирический расчет энергетических профилей ионов в канале 73
1.4.1. Выбор системы базисных функций 74
1.4.2. Результаты и их обсуждение 79
1.5. Выводы 81
II. Теоретическое исследование функциональных характеристик потенциал-зависимых калиевых каналов клетки 83
2.1. Введение 83
2.2. Потенциал-зависимый калиевый канал KvAP из Aeropyrum pernix 88
2.2.1. Структура и механизмы функционирования канала 88
2.2.2. Энергетические профили канала 94
2.2.3. Функциональные характеристики канала 93
2.3. Потенциал-зависимый калиевый канал в виде комплекса а- и Р-
субъединицы из Rattus norvegicus 99
2.3.1. Структура и механизмы функционирования канала 99
2.3.2. Энергетические профили канала 103
2.3.3. Функциональные характеристики канала 108
2.3.4. Построение третичной структуры а/(3-канала в закрытом состоянии.. 110
2.4. Потенциал-зависимый калиевый канал Kvl.2 типа Shaker из Rattus norvegicus 117
2.4.1. Структура и механизмы функционирования канала 117
2.4.2. Энергетические профили канала 119
2.4.3. Функциональные характеристики канала 122
2.5. Выводы 125
III. Теоретическое исследование структурных и функциональных характеристик хиральномодифицированных модельных ионных каналов с инвариантной и модифицированной первичной структурой 128
3.1. Введение 128
3.2. Структурные и функциональные характеристики хирально модифицированных каналов с инвариантной первичной структурой 135
3.2.1. Потенциал-независимый калиевый канал KcsA 137
3.2.2. Потенциал-зависимый калиевый канал KvAP 141
3.2.3. Потенциал-зависимый калиевый а/р-канал 149
3.2.4. Потенциал-зависимый калиевый канал Kvl.2 156
3.2.5. NRl-центр связывания NMDA-рецептора 163
3.3. Структурные и функциональные характеристики хирально модифицированных каналов с модифицированной первичной структурой. 167
3.3.1. Энергетическое выравнивание структур - метод построения хирально модифицированных каналов с природной функциональностью 171
3.3.2. Потенциал-независимый калиевый канал KcsA 173
3.3.3. Потенциал-зависимый калиевый канал KvAP 183
3.3.4. Модельный потенциал-зависимый калиевый канал в виде комплекса а-и (3-субъединиц 187
3.3.5. Потенциал-зависимый калиевый канал Kvl .2 191
3.3.6. NR1 -центр связывания NMDA-рецептора 194
3.4. Выводы 197
IV. Теоретическое исследование влияния неферментативной изомеризации и рацемизации аминокислот ионных каналов на их структурные и функциональные характеристики 201
4.1. Введение 201
4.1.1. Рацемизация аминокислот в белках организма 205
4.1.2. In vivo механизм рацемизации Asx стареющих белков 208
4.1.3. Рацемизация Asx как молекулярный индикатор старения белков 213
4.1.4. Связь рацемизации Asx с деградацией белков при патологических состояниях 215
4.1.5. Механизмы репарации и обновления как защита от молекулярного повреждения рацемизацией Asx 216
4.1.6. Патофизиологическая роль рацемизации Asx в ходе старения 218
4.1.7. Скорость неферментативной рацемизации Asx 220
4.1.8. Рацемизация Asx как часть комплексной биологии старения белков.222
4.1.9. Неферментативная изомеризация Asx в белках организма 224
4.2. Математическое моделирование динамики неферментативной изомеризации и рацемизации аминокислот в белках 225
4.2.1. Одиночный модельный белок 226
4.2.2. Совокупность белков организма в норме с учетом распределения скоростей изомеризации и относительных частот фрагмента Asn-Xxx 228
4.2.3. Одиночный белок с учетом увеличения времени жизни белков с возрастом 235
4.3. Влияние неферментативной изомеризации аспарагина ионных каналов на
их структурно-функциональные характеристики 237
4.3.1. Структура ионных каналов с isoAsp-остатками 238
4.3.2. Функциональные характеристики ионных каналов с isoAsp-остатками 4.4. Структура модифицированного NR1-центра связывания NMDA-
рецептора в комплексе с D-аминокислотными лигандами 245
4.5. Выводы 250
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 252
5.1. Особенности рибосомального синтеза природных мембранных каналов
5.2. Особенности матричного синтеза хирально модифицированных ионных каналов 259
VI. Основные результаты и выводы 264
vii. Список литературы
- Представление ионного канала в системе координат с поворотной осью симметрии
- Структура и механизмы функционирования канала
- Структурные и функциональные характеристики хирально модифицированных каналов с инвариантной первичной структурой
- Рацемизация Asx как молекулярный индикатор старения белков
Введение к работе
Перенос ионов через биологические мембраны является одним из наиболее важных процессов, происходящих в живых клетках. Обеспечивая общую термодинамическую неравновесность клетки, он играет основополагающую роль в таких важнейших физиологических процессах, как преобразование энергии, поддержание постоянного химического состава внутренней среды, регуляция и рецепция, биологическая подвижность, распространение импульса и др. Так как липидный бислой мембраны создает исключительно высокий энергетический барьер для прохождения ионов, то осуществление ионного транспорта требует наличия специализированных макромолекулярных структур, которые могли бы существенно уменьшить этот энергетический барьер. Именно эту роль выполняют ионные насосы, ионные каналы, ионообменники, антибиотики. Среди различных ион-транспортных систем ионные каналы характеризуются относительно высокой скоростью транспорта в сочетании с высокой селективностью к транспортируемым ионам.
Центральной проблемой в исследовании физических свойств ионных каналов является установление связи между их структурой и функциями. Появление экспериментальной информации по структуре ионных каналов стимулировало разработку различных теоретических подходов к исследованию механизмов переноса ионов в каналах, основывающихся, прежде всего, на уравнениях молекулярной и броуновской динамики, теории абсолютных скоростей реакций Эйринга и теории диффузии Пуассона-Нернста-Планка. Вместе с тем прогресс в теоретическом исследовании механизмов переноса ионов существенно затруднен из-за отсутствия единого подхода к оценке энергетических профилей ионов в канале, которые, в явном или неявном виде, включены во все вышеуказанные уравнения. Следствием этого является физически неоднозначная калибровка параметров энергетических профилей и уравнений для расчета функциональных характеристик каналов, таких как проводимости, ионные токи, вольтамперные характеристики и отношения коэффициентов проницаемостей для различных ионов.
Ионная асимметрия в содержании важнейших катионов во внутренней среде клеток относительно внешней среды, формируемая при участии ионных насосов и ионных каналов, непосредственным образом связана с другой фундаментальной асимметрией - хиральнои асимметрией важнейших биомолекул во всей биосфере, которая проявляется в построении нуклеиновых кислот из D-энантиомеров (дезокси)рибозы, а синтезируемых в рибосомах белков - из L-энантиомеров аминокислот. Так существуют близкие значения свободной энергии, необходимой для формирования хирально чистых биополимеров и ионной асимметрии клеток [ПО]. Рассматривая общие структурные и функциональные особенности живой клетки, целесообразно выделить два аспекта нарушения зеркальной симметрии биомолекул. Во-первых, это эволюционно востребованная необходимость гомохиральности, во-вторых - эволюционно закрепившийся знак хиральности.
Физико-химические и биологические основы гомохиральности биополимеров в последнее время изучены достаточно разносторонне [1, 13, 110, 107]. Так гомохиральность белков и нуклеиновых кислот определяет их стереоспецифичность - необходимое условие матричного синтеза, обусловливает стабильность их структур, обеспечивающих их функционирование. Для биохимических преобразований гомохиральных соединений требуется значительно меньший набор ферментов, чем для таких же преобразований гетерохиральных соединений. Основы механизмов сопряжения ионной и хиральнои асимметрий рассмотрены в работах Твердислова, Яковенко, Дмитриева (1988 - 2008).
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области исследования гомохиральности биополимеров, физико-химическое и биологическое основы того, что белки-ферменты и нуклеиновые кислоты имеют строго определенный знак хиральности, остаются недостаточно выясненными. Интерес к этой проблеме усиливается тем, что, согласно гипотезам спонтанной дерацемизации и решающей роли глобального фактора преимущества [13], повторение всей совокупности событий, приведших к появлению хиральной чистоты, равновероятно способно привести к такой гипотетической биосфере, которая использовала бы D-аминокислоты и L-caxapa.
Следует отметить, что, помимо Сахаров и аминокислот, другие хиральные компоненты клетки в определенных случаях могут встречаться как в одной, так и в другой изомерной форме. В некоторых бактериях обнаружены L-caxapa и D-аминокислоты. D-аминокислоты достаточно широко распространены в живой природе и, более того, входят в состав ряда биологически значимых коротких олигопептидов. Встречаются бактерии, которые содержат D-глютаминовую кислоту и D-Ala в своих клеточных стенках, а в организме человека вырабатывается в качестве нейромедиатора D-Ser. Некоторые пептидные антибиотики, а также плазма крови высших организмов, имеют в своем составе D-аминокислоты. Некоторые термофилы используют высокие концентрации D-Ala в качестве осморегулятора. В нервных клетках высших организмов находят D-Ala, D-Asp и D-Ser, иногда в значительных концентрациях. Поэтому в деталях биологический мир не обнаруживает хиральной чистоты, но все, что относится к рибосомальному синтезу полипептидов, характеризуется абсолютной хиральной чистотой.
Нарушение хиральной чистоты аминокислот в белках является следствием их посттрансляционной модификации - неферментативной рацемизации и изомеризации аминокислот в белках. Причем из двадцати аминокислот, участвующих в рибосомальном синтезе, прежде всего Asp- и Asn-остатки в белках являются наиболее подверженными неферментативной модификации: рацемизации и изомеризации. Если накопление остатков D-Asp в белках - достаточно долгий процесс, который является наиболее значимым для очень медленно обновляющихся белков и белков организма, вовлеченных в патофизиологические процессы при заболеваниях пожилого возраста, то появление остатков iAsp в белках — существенно для функционирования медленно обновляющихся белков даже в норме.
Посттрансляционные неферментативные модификации аминокислот в белках играют существенную роль в патогенезе болезней, характерных для людей пожилого возраста. Так установлено появление значительного содержания остатков D-Asp в белках организмов с болезнью Альцгеймера, Паркинсона, а также при склеротических изменениях в сердечно-сосудистой системе, при глазной катаракте и т.д. Некоторые исследователи рассматривают содержание остатков D-Asp в белках как патофизиологический фактор в патогенезе болезней пожилого возраста, таких как атеросклероз, эмфизема легкого, катаракта, дегенеративные заболевания хряща и возрастная дисфункция головного мозга и др.
Исследование влияния посттрансляционных модификаций
аминокислотных остатков белков на их структуру и механизмы функционирования остаётся малоисследованным направлением в биофизике. Прежде всего, это относится к биологически активным соединениям стереоспецифичного действия, которые могут оказывать как более, так и менее активное действие на белки организмов, подверженным возрастным изменениям.
Отдавая должное значительным успехам экспериментальной молекулярной геронтологии последних лет, достигнутым в данном направлении, следует отметить, что в ряде случаев функциональные нарушения, связанные с хиральными нарушениями, можно исследовать исключительно в модельных компьютерных экспериментах. В первую очередь это относится к молекулярным структурам, присутствующим в отдельных клетках в незначительных количествах, как, например, в белковых ион-транспортных системах мембран. Тем более, когда изменение знака хиральности захватывает аминокислотные группы, укрытые в их гидрофильных ион-связывающих полостях. При этом принципиально важно в рамках единого численного эксперимента выполнить сравнение функций нормальных и хирально модифицированных молекулярных структур.
Таким образом, представляется перспективным исследование структуры и механизмов функционирования ионных каналов по следующим направлениям:
1) Выбор и обоснование метода расчета энергетических профилей ионов в каналах, не требующего значительных затрат расчетного времени и выявляющего с хорошей точностью функциональные характеристики природных и модифицированных ионных каналов.
2) Исследование функциональных характеристик природных ионных каналов, для которых известны их электрохимические характеристики.
3) Построение хирально модифицированных модельных ионных каналов, исследование их структуры и функциональных характеристик.
4) Исследование влияния не ферментативной модификации остатков Asn и Asp в ионных каналах на их структуру и функциональные характеристики.
Представление ионного канала в системе координат с поворотной осью симметрии
Вид энергетического профиля иона в поре мембранного канала, в большинстве случаев, однозначно определяет поведение иона в канале, количественные характеристики которого (траектория движения иона, изменение концентрации ионов, константы перехода через энергетические барьеры и вероятности заполнения энергетических ям), позволяют рассчитать функциональные характеристики одиночных каналов (вольтамперная характеристика, проводимость, отношение коэффициентов проницаемостей различных ионов). Кроме того, энергетические профили дают исходную информацию для полуколичественного объяснения ионной селективности мембранных каналов. Так в современном подходе к объяснению ионной селективности мембранных каналов, основанный главным образом на теории Эйзенмана [205, 206, 207, 209], селективность каналов объясняется различием свободной энергии гидратации иона и энергии его взаимодействия с заряженными участками поры канала.
Профиль свободной энергии Гиббса комплекса ион-вода-канал, в случае однорядного движения иона в аксиально-симметричных каналах, представляет собой зависимость Giwc =Giwc(z), где Z - координата оси аксиальной симметрии канала. В наиболее общем виде Giwc(z) = Eic(z) + Eivv(z) + Ewc(z) + Ewv(Z)Siwc(z), (1.1) где Eic(z) - внутренняя энергия комплекса ион-канал при локализации иона в точке с координатой Z, Eiw(z) — внутренняя энергия ион-водного комплекса, EWC(Z) - внутренняя энергия комплекса вода-канал, Eww(z) -внутренняя энергия комплекса вода-канал при локализации иона в точке с координатой Z, Siwc(z) -энтропия. Составляющие Eic(z), Ewc(z) и Eww(z) обусловлены тем, что, находясь в поре канала, ион является частично дегидратированным [173, 487].
Зависимость є = s(d) рассчитывали численным решением уравнения Буза [173], величину Eiw(z)Siwc(z) - по полуэмпирическим формулам Лайо-Торрэ [298], включающим экспериментальные значения свободной энергии Гиббса комплексов, включающих і молекул воды и катион в газовой фазе.
Величину Е ww (z) + Е wc (Z) с хорошей степенью точности можно считать постоянной, не зависящей от локализации иона, для определенного канала. По результатам численного моделирования методом Монте-Карло установлено, что в зависимости от положения иона на оси канала Eww(z) + Ewc(z) принимает постоянное значение для определенного канала, при этом ошибка составляет не более 2%. Данный результат может быть обоснован статистической природой рассматриваемых взаимодействий и свойствами потенциалов межмолекулярного взаимодействия.
Учитывая, что различные методы расчета дают, как правило, различные количественные результаты, целесообразно провести расчет зависимостей Е = E(z) полученных различными методами и по полученным зависимостям рассчитать функциональные характеристики канала, а последние сопоставить с экспериментальными данными. Данный анализ позволит сделать выводы о возможностях и ограничениях традиционных методов расчета E = E(z) И выборе лучшего из них в исследовании механизмов функционирования мембранных каналов.
Знание атомных моделей мембранных каналов является необходимым для детального исследования ионного транспорта через биологические мембраны. Этого требуют практически все традиционные теоретические методы исследования движения ионов в каналах. Атомная структура канала определяет Е = E(z). При этом если рассматривать ионные каналы, имеющие поворотную ось симметрии любого порядка С„ [103, 15, 234, 8, 90], наибольший интерес представляет Е = E(z) ионов, в которой Z - ось аксиальной симметрии канала. Группой поворотной симметрии обладает практически все представители генетического суперсемейства потенциал-зависимых Na+, К+ и Са2+-каналов [89, 12].
Тем самым, выше сказанное определяет необходимость представления атомной структуры аксиально-симметричных ионных каналов в системе координат с осью поворотной симметрии Сп, для последующего расчета энергетических профилей ионов и моделирования ионного транспорта в каналах. Учитывая, что большинство мембранных каналов приводимых в Банке белковых структур представлены в произвольной системе координат, особый интерес представляет определение значений атомных координат в системе координат с поворотной осью симметрии. Получить формулы данных преобразований и является задачью данного параграфа.
Назовем систему координат, в которой заданы атомные координаты каналов из Банка белковых структур, лабораторной системой координат (ATZ-система); систему координат, одна из осей которых, например Z-ось, совпадает с осью поворотной симметрии Сп канала, - естественной системой координат {X Y Z -система). При этом ось Сп проходит через две точки с заданными координатами в ZTZ-системе: 0(хо, уо, z0) и А(х\, уь z\). В некоторых случаях, это могут быть координаты ионов, локализованных в поре канала [23, 25].
Структура и механизмы функционирования канала
Данная структурная модель показывает, каким образом сенсоры напряжения могут двигаться в ответ на изменения мембранного напряжения и открывать пору. В кристаллической структуре, сенсоры напряжения находятся рядом с внутриклеточной стороной канала, но электрофизиологические исследования с использованием токсинов паука и тиол-реактивных соединений показывают, что аминокислоты в лопасти могут открываться в сторону внеклеточной жидкости [267, 300, 483, 126, 437]. Эти наблюдения приводят к предположению о том, что спирали сенсора напряжения двигаются в мембране, за счет энергии воротных зарядов в изменяющемся электрическом поле. Последующие модели потенциал-зависимого воротного механизма утверждают, что спирали S4 двигаются по своим собственным траекториям, определяемым белком, как показано в работах [256, 224, 131]. Данная новая модель находится в противоречии с наблюдениями Финкельштейна [428, 383], согласно которым воротный механизм пороформирующих токсинов колицина определяется положительно заряженными пептидами проникающими через мембрану. Предположение о том, что лопасти сенсора напряжения несут воротные заряды через мембрану в протеино-липидном слое следует из экспериментальных данных. В работе [265, 265], авторы развивают некоторые из этих идей, фиксируя позиции спиралей сенсора напряжения в мембране, и исследуя насколько далеко двигаются сенсоры, когда пора открывается в ответ на деполяризацию мембраны [266, 267].
В работе [265, 266] была определена атомная структура калиевого канала и дан гипотетический ответ на вопрос: каким образом трансмембранный потенциал открывает пору ионного канала. Так потенциал-зависимый калиевый канал, в зависимости от направления трансмембранного потенциала, определяющего положение сенсора в пространстве, может находиться в двух конформациях: открытой - пропускающей ионы, и закрытой - не пропускающей ионы (см. рисунок 2.3). При изменении разности потенциалов на концах мембраны, достаточно лабильный сенсор канала занимает новое положение, что приводит к переходу канала из открытого состояния в закрытое состояние и наоборот.
Предложенная модель, объясняющая переход канала из одного состояния в другое, не дает ответа на вопрос о механизмах исключительно калиевой избирательности открытого канала и отсутствия таковой для закрытого ионного канала.
Потенциал-зависимый калиевый канал KvAP может находиться в двух состояниях: открытом, проводящем состоянии и закрытом, непроводящем состоянии. Исходя из этого, нами проведено исследование двух соответствующих состояний канала KvAP.
Атомные координаты канала KvAP брали из банка белковых структур. Атомные координаты молекулы представленные в естественной системе координат рассчитывали по формуле (1.2). Результирующие энергетические профили канала рассчитывали в виде суммы Eic+Ejw; при этом составляющую Е1С рассчитывали методом ЕНТ/AMBER, Eiw — по формуле (1.7).
Результаты расчета энергетических профилей ионов Li+, Na+, К+, Rb+, Cs+ в поре открытого и закрытого канала KvAP представлены на рисунках 2.4 и 2.5. Профили Eic =Eic(z) в области селективного фильтра и центральной полости открытого и закрытого аналогичны профилям энергии ионов в соответствующих областях потенциал-независимого калиевого канала KcsA, что является следствием гомологичности [71] каналов KvAP и KcsA.
Понижение энергии иона в селективном фильтре канала оказывается наибольшим у иона К+ и наименьшим у иона Li+ (ион Na+ занимает промежуточное положение), что обусловлено тем, что только ион Kf из-за своих размеров может формировать достаточно плотный контакт одновременно со всеми четырьмя карбонильными кислородами селективного фильтра. Повышение энергии ионов, локализованных в области селективного фильтра, происходит за счет их взаимодействия с молекулами воды частично дегидратированного комплекса. Причем наибольшее уменьшение глубины потенциальной ямы за счет энергии ион-водного комплекса характерно для иона К , что обусловлено тем, что в отличие от ионов Li+ и Na+, локализованный в области селективного фильтра ион К+ содержит только две молекулы воды в частично дегидратированном комплексе.
Существенное отличие энергетических профилей Е]С каналов KvAP и KcsA наблюдается только в области нижней поры, что обусловлено наличием дополнительных сенсоров напряжения в канале KvAP. В данной области открытого и закрытого канала KvAP появляется энергетические барьеры для всех видов ионов. Причем в закрытом канале значения энергетических барьеров больше чем в открытом. Кроме того, в закрытом канале KvAP величина диаметра канала в области нижней поры меньше чем в открытом. Данное различие приводит к увеличению стерических ограничений для ион-водного комплекса и, как следствие, приводит к увеличению значения энергии данного комплекса в закрытом канале.
Таким образом, появление больших, по сравнению с открытым каналом, энергетических барьеров в области нижней поры закрытого канала KvAP может быть причиной наблюдаемого отсутствия ионной проводимости канала.
Структурные и функциональные характеристики хирально модифицированных каналов с инвариантной первичной структурой
На рисунке 3.1 представлены зависимости потенциальной энергии от времени природного потенциал-независимого калиевого канала KcsA и модельного изомера данного канала, построенного заменой всех его L аминокислотных остатков на D-аминокислотные (D-KcsA). Данные зависимости характеризуются наличием множества локальных минимумов, причем по нашим наблюдениям, каждый из них соответствует пору-формирующей конформации молекулы как природного, так и не природного изомера канала.
Наиболее глубокий потенциальный минимум, после релаксации молекулярной структуры, для природного изомера потенциал-независимого калиевого канала KcsA равен -1360.69 ккал/моль, для модельного канала D-KcsA - -479.50 ккал/моль. Следовательно, природный изомер потенциал-независимого калиевого канала почти в 3 раза энергетически стабильней, чем его модельный D-изомер.
Другая важная структурная особенность канала D-KcsA состоит в том, что после снятия стерического напряжения происходит увеличение его диаметра в среднем в 1.4 раза, по сравнению с диаметром природного канала.
Профили потенциальной энергии взаимодействия в системе ион-канал и результирующие энергетические профили ионов Li+, Na+, К+, Rb+ и Cs+ в поре неприродного D-изомера потенциал-независимого калиевого канала представлены на рисунке 3.2. Как и в случае природного канала KcsA, потенциальные профили в области селективного фильтра характеризуются наличием потенциальных ям, глубины которых расположены в последовательности Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+. Вид данных потенциальных профилей меняется за счет добавления энергии взаимодействия в ион-водном комплексе: для всех ионов формируются входные энергетические барьеры и энергетические ямы в центре селективного фильтра. Причем глубины потенциальных наименьшие для ионов калия и рубидия, и наибольшие для ионов лития, цезия и рубидия.
Вид рассчитанных энергетических профилей ионов канала D-KcsA указывает на то, что наиболее подходящей, как и в случае природного канала, является пятибарьерная модель ионного канала с пятью потенциальными ямами. Таким образом решали систему шести уравнений вида (1.48) для ионов Li+, Na+, К+, Rb+, Cs+ в которой константы скорости перехода через энергетические барьеры рассчитывали по формуле (1.49).
Ионный ток, проводимость и отношение коэффициентов проницаемостей для различных ионов одиночного канала D-KcsA рассчитывали по формулам (1.50), (1.51) и (1.52), соответственно.
Результаты расчетов величин ионных токов для одиночного канала D-KcsA при ф=60мВ, расчетные значения отношений коэффициентов проницаемости и их значения для природного канала KcsA (L-KcsA) представлены в таблице 3.1. Несмотря на то, для ионов лития рубидия и цезия результаты расчета отношений коэффициентов проницаемости канала
D-KcsA находятся в хорошем соответствии с экспериментальными данными по селективности калиевых каналов [191, 197, 252, 299, 302, 355, 388], данный канал не является калий-избирательным. Данный канал пропускает все исследованные ионы, но с разными проводимостями: для лития 18.533 пСм, для натрия 146.366 пСм, для калия 459.700 пСм, для рубидия 401.883 пСм, для цезия 3.85 пСм. В этом отношении канал D-KcsA аналогичен грамицидиновому каналу [461, 148, 119].
Рацемизация Asx как молекулярный индикатор старения белков
Автономная (в отсутствии патологических состояний) рацемизация Asx может использоваться в качестве молекулярного индикатора старения белков. Используя эти молекулярные часы можно оценить in vivo время жизни внеклеточных белков, т.к. существует соотношение между возрастом определенного белка и содержанием в нем D-Asx, в зависимости от его обновления:
1) Белки со значительным обновлением изменяются перед аккумуляцией D-Asx. Эти белки не показывают 5 с» 2 Ф а. аккумуляции остатков D-Asx с возрастом Возраст белка (линия из точек нарис. 4.5).
2) Долгоживущие белки с незначительны м обновлением могут аккумулировать D-Asx. Однако, из-за обновления соотношение между рацемизацией Asx и возрастом не значимо. Равновесие между аккумуляцией остатков D-Asx и L-Asx вновь синтезируемых белков может приводить к значительным концентрациям D-Asx на постоянном уровне (линия из тире на рис. 4.5).
3) Только в стабильных белках без какого-либо обновления можно обнаружить тесную зависимость между аккумуляцией модифицированных Asx и возрастом: концентрация D-Asx увеличивается с возрастом (сплошная линия на рис. 4.5). Это может быть основой для идентификации стабильных и долгоживущих белков, стареющих вместе с организмом человека.
Созревшие мембранные белки подвергаются непрерывному обновлению. Так период полуобновления Na-канала составляет около 30 часов [413], что типично для поверхностных белков. Обновление большой субъединицы Na/K-АТФазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20 - 40 часов [274, 441]. По-видимому, деградация по крайней мере некоторых белков происходит в лизосомах. В качестве примера можно привести цитохром Р450, содержащийся в эндоплазматическом ретикулуме [331].
В целом же, по времени полужизни белки животных можно разделить на четыре группы: 1) очень быстро обновляющиеся белки (время полужизни - менее 1 часа): белок-супрессор опухолей р53, продукты протоонкогенов c-fos и с-тус, орнитиндеарбоксилаза, циклины; 2) быстро обновляющиеся белки (время полужизни 1 - 24 часа): тирозинаминотрансфераза, триптофан-2,3-диоксигеназа, гамма-глутамилтрансфераза, Hsp70, РНК-пол имераза I, рецептор инсулина, убиквитин; 3) медленно обновляющиеся белки (время полужизни 1 - 5 дней): каталаза, калпаины, катепсины, протеасомы, тубулины, актины, альдолаза, лактатдегидрогеназа, аргиназа; 4) очень медленно обновляющиеся белки (время полужизни - больше 5 дней): митохондриальная фумараза, цитохромы b и с, миозин, гемоглобин, гистоны в интерфазном ядре, эластин, коллаген.
Тесная связь между рацемизацией Asx и возрастом в очищенных белках [420, 379, 394] показывает, что накопление D-Asx в течение естественного старения встречается автономно. Однако связь между патологией ткани и повышением концентрации D-Asx также наблюдалась, например, в остеоартрическом хряще [329] и в глазных хрусталиках, которые являются брунесцентными [332] или были подвержены ультрафиолетовому облучению [216]. Т.к. деградация может ускорять рацемизацию, которая in vivo может привести к дальнейшему конформационному изменению [208, 366, 342], существует возможность для цикла: деградация белка — повышенная конформационная свобода — рацемизация Asx — дальнейшее конформационное изменение — дальнейшая деградация.
Один из механизмов контроля рацемизации Asx - репарация. Биологическое значение рацемизации Asx показано широким распространением репаративного фермента белок-Ь-изоаспартат О-метилтрансфераза (PIMT [338, 339, 270, 122, 272]).
Фермент функционирует селективно метилируя остатки L-isoAsp. Аспарагиновый метил аспартил превращается в Asu, повторное метилирование которого может вновь превратить его в L-Asp. Однако субстратный характер L-Asp достаточно низок и не существует механизма для дальнейшего диамидирования остатков Asn.
Отсутствие PIMT ухудшает выживание [273, 279, 458, 482, 424] и возможно существует связь между экспрессией этого репаративного фермента и старением [189, 482]. PIMT сводит на нет смерть мышей в течение 42 дней [279, 482], но продолжительность их жизни можно увеличить локальной выработкой PIMT в мозге [318]. Однако следует отметить, что PIMT - внутриклеточный фермент (модификации внеклеточных белков обычно не могут восстанавливаться [468]).
Рацемизация аспарагина и аспартата в составе белков может непосредственно влиять на механизмы репарации ДНК и апоптоз и, таким образом, на процессы старения и развития некоторых патологий. Уменьшение активности апоптоза может приводить к пролифераци клеток и онкогенезу, а увеличение его активности или изменение специфичности - к таким нейродегенеративным заболеваниям, как болезни Альцгеймера и Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз.
В апоптозе важную роль играют специфические протеазы — каспазы, которые содержат аспартат в активном центре и расщепляют субстраты по остатку аспарагиновой кислоты. Очевидно, что деаминирование аспарагина до аспартата приводит к появлению новых центров расщепления и к исчезновению точек N-гликозилирования белков, что может изменять профиль активности каспаз. При изменении структуры активного центра каспазы ее активность уменьшается или полностью исчезает.
В механизме репарации ДНК участвует множество ферментов. В частности последствия окислительного стресса, приводящего к образованию 8-оксогуанина, ликвидируются ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой (hOGGl). У линии быстро стареющих мышей обнаружены мутации гена hOGGl, приводящие к заметному снижению активности и термоустойчивости этого фермента, поэтому его считают по крайней мере частично ответственным за накопление дефектов в ДНК при старении. Существенно, что hOGGl имеет в активном центре триплет остатков аспарагина (положения 149-151), которые обеспечивают связывание этого фермента с ДНК [147]. С другой стороны, при мутации, приводящей к замене аспарагина на аланин в активном центре сходного фермента - тимин-ДНК-гликозилазы человека, этот фермент теряет активность. Поэтому можно предполагать, что рацемизация аспарагина и аспарагиновой кислоты в составе ферментов репарации ДНК может быть ответственна, хотя бы частично, за накопление дефектов в ДНК, сопровождающее старение.