Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Строение глаза, фоточувствительные клетки, зрительные пигменты и первичные процессы фоторецепции 9
1.2. Зрительный цикл и накопление его побочных продуктов в сетчатке 23
1.3. Механизмы патогенного воздействия полностью-/иранс-ретиналя, липофусцина и А2Е на сетчатку глаза 33
1.4. Бислойная липидная мембрана как модель для изучения токсичности продуктов зрительного цикла. Постановка задачи исследования. 46
Глава 2. Материалы и методы. 64
2.1. Формирование БЛМ по методике Мюллера-Рудина и встраивание исследуемых веществ в мембрану 64
2.2. Эксперименты на липосомах. Получение спектров поглощения ретиналя . 72
Глава 3. Изучение воздействия бис-ретинилиден-этаноламина на бислойные липидные мембраны . 73
3.1 .Детергентное воздействие А2Е на БЛМ 73
3.2. Фото динамическое воздействие А2Е на мембраны и встроенные в них полипептиды 86
Глава 4. Изучение воздействия полностью-транс-ретиналя на бислойные липидные мембраны 97
4.1 Встраивание ретиналя в БЛМ 97
4.2. Фотодеструктивное воздействие ретиналя на БЛМ и встроенные в нее мишени 108
4.3. Изучение фотохимических превращений ретиналя в искусственных мембранных системах при длительном освещении 120
Выводы 125
Список литературы 127
Благодарности 143
- Зрительный цикл и накопление его побочных продуктов в сетчатке
- Эксперименты на липосомах. Получение спектров поглощения ретиналя
- Фото динамическое воздействие А2Е на мембраны и встроенные в них полипептиды
- Фотодеструктивное воздействие ретиналя на БЛМ и встроенные в нее мишени
Введение к работе
В настоящее время стремительно растет количество людей, страдающих заболеваниями зрения, обусловленными нарушениями цикла зрительного родопсина (называемого также зрительным циклом) и накоплением его побочных продуктов в сетчатке глаза. Под зрительным циклом подразумевается последовательность биохимических реакций, в ходе которой молекула родопсина, основного светочувствительного белка сетчатки глаза человека, восстанавливает свою способность к фоторецепции после поглощения кванта света. В результате фотолиза родопсина его хромофорная группа, ll-z/z/c-ретиналь, изомеризуется в полностью-транс-ретиналь (далее сокращенно обозначается «ретиналь», либо «ATR»), отсоединяется от белковой части молекулы и оказывается в свободном состоянии в мембране диска фоторецепторной клетки. При нормальном функционировании зрительного цикла свободный ретиналь сразу же восстанавливается до ретинола, транспортируется в клетки пигментного эпителия сетчатки, там снова превращается в 11-г/иоретиналь и возвращается обратно в фоторецепторную клетку для соединения с молекулой родопсина.
В патологических ситуациях механизм удаления ретиналя из фоторецепторной мембраны нарушается, и он может накапливаться в липидном бислое. Там он способен связываться с одним из мембранных фосфолипидов — фосфатидилэтаноламином, образуя сначала N-ретинилиден-этаноламин, а затем -бис-ретинилиден-этаноламин (А2Е). В конечном итоге это приводит к гибели клеток и развитию возрастной деградации сетчатки глаза, болезни Штаргардта, различных ретинопатии и других опасных заболеваний зрения. Помимо этого, А2Е и другие продукты взаимодействия ретиналя с белками и липидами мембран дисков, фоторецепторных клеток в ходе их обновления фагоцитируются клетками пигментного эпителия сетчатки, но перерабатываются лишь частично и накапливаются в виде гранул так называемого «пигмента старости», или липофусцина.
Известно, что гибель клеток в ходе развития заболеваний сетчатки в первую очередь обусловлена разрушением их мембран. По этой причине наибольший интерес представляют исследования воздействия ретиналя и компонентов липофусцина на биологические мембраны в темновых условиях и при освещении.
Полученные на сегодняшний день данные о воздействии продуктов зрительного цикла на мембраны в большинстве своем носят качественный характер и свидетельствуют, как правило, только о наличии деструктивного эффекта и гибели клеток сетчатки. В то же время, механизмы разрушения мембран можно изучать на модельной системе. Наиболее удобной моделью является бислойная липидная мембрана (БЛМ). Преимущество такой системы - контролируемый состав и набор методов, позволяющих изучать физические механизмы разрушения, что и составило предмет данной работы.
Основным объектом исследования является БЛМ, сформированная по методике Мюллера-Рудина из смеси липидов в растворителе. Выбор объекта обусловлен тем, что на БЛМ можно с достаточно высокой точностью проводить прямое измерение целого ряда электрохимических и механических параметров мембраны, таких как проводимость, емкость, поверхностное натяжение, время жизни в различных условиях и изменение разности граничных потенциалов. Эти и другие характеристики липидного бислоя, доступные для измерения на БЛМ, как правило, трудноопределимы на биологических мембранах. Важным преимуществом БЛМ является также возможность исследовать зависимость эффектов от липидного состава воздействия А2Е и ретиналя при их асимметричном встраивании, т.е. при введении в бислой только с одной стороны.
В данной работе впервые используется БЛМ как модель биологической мембраны для исследования воздействия побочных продуктов зрительного цикла на липидный бислой. Ранее исследования токсичности этих соединений проводились только на живых клетках, либо изучались их фотохимические свойства в различных растворителях, и только в нескольких работах были получены данные об их воздействии на липосомы.
Впервые было изучено влияние А2Е на стабильность мембран методом электрического пробоя, что позволило количественно оценить изменение таких параметров, как поверхностное натяжение мембраны, линейное натяжение спонтанно образующихся пор, количество дефектов и скорость изменения радиуса дефекта при наличии в составе мембраны бис-ретинилиден-этаноламина.
Впервые было измерено изменение граничного потенциала, возникающего на БЛМ при встраивании в нее ретиналя, и проведено сравнение влияния А2Е и ретиналя на профиль распределения электрического поля в мембране.
Впервые было показано влияние липидного состава мембраны на количество ретиналя, накапливающего в БЛМ, а также на его патогенное воздействие на мембрану.
Используемый в работе метод фотоинактивации грамицидинового канала использован впервые для исследования фотореакционной способности А2Е и ретиналя.
Достоверность результатов работы и обоснованность выводов обеспечивается тем, что использованные методики и модели успешно использовались ранее для исследования свойств БЛМ и воздействия на них различных биологически активных веществ — ионофоров, фотосенсибилизаторов, липофильных ионов.
Теория необратимого электрического пробоя БЛМ, взятая за основу для оценки влияния А2Е на микроскопические структурные параметры мембраны, была разработана еще в 80-е годы и неоднократно проверялась экспериментально в нашей и других лабораториях.
Применяемый в работе метод фотоинактивации грамицидинового канала успешно применялся ранее в лаборатории, возглавляемой Ю.Н.Антоненко, в исследованиях активности фотосенсибилизаторов и кинетики формирования самих каналов.
Результаты данного исследования важны для понимания механизмов воздействия ретиналя и А2Е на мембраны клеток сетчатки. Полученная новая информация о процессах, лежащих в основе гибели клеток и патогенеза заболеваний зрения, может быть использована для поиска более эффективных
способов их профилактики и лечения. Разработанные в ходе выполнения работы методики при исследовании деструктивного воздействия ретиналя и А2Е могут быть полезны в дальнейшем для изучения взаимодействия других соединений с БЛМ.
Зрительный цикл и накопление его побочных продуктов в сетчатке
Непосредственно после фотоизомеризации, перед выходом в мембрану диска, ретиналь некоторое время остается нековалентно связанным с «выходным» сайтом родопсина, где он находится до тех пор, пока новая молекула 11-г/г/с-ретиналя не свяжется с Lys-296 в хромофорном центре опсина. Там он может быть восстановлен до ll-z/z/оретинола NADPH-зависимым ферментом ретинолдегидрогеназой (RDH) [18,26].В палочках это специфическая форма фермента, называемая также RDH8 [27], в то время как в колбочках экспрессируется другой белок, восстанавливающий ретиналь - retSDRl [28]. При быстром поступлении нового ll-z/z/c-ретиналя, полностью-трянс-ретиналь может высвобождаться из «выходного» сайта сразу, еще до того как успевает восстановиться до ретинола. В этом случае ретиналь оказывается на внутренней стороне мембраны диска, где он не доступен для RDH до тех пор, пока не произойдет его «перескок» на наружную сторону. Находясь на внутренней стороне мембраны диска, ретиналь способен обратимо взаимодействовать с присутсвующим там в избытке фосфатидилэтаноламином (РЕ), образуя в качестве продукта N-ретинилиден-фосфатидилэтаноламин (NRPE) [29-31] [32,33]". NRPE доступен для специфического «АТФ-связывающего кассетного переносчика» (ABCR) — крупного трансмембранного белка, расположенного в области краевых «петель» диска наружного сегмента, который переносит NRPE на наружную, или цитоплазматическую, сторону мембраны, затрачивая при этом энергию гидролиза молекулы АТФ [34].
В работах [29, 30,35] было обнаружено, что отсутствие или дефицит ABCR у мышей, нокаутных по соответствующему гену, приводит к замедлению выхода ретиналя и NRPE из фоторецепторных дисков, и данная стадия зрительного цикла становится лимитирующей для восстановления транс-рєтиналя до транс-ретинола. Более того, среди людей, страдающих пигментным ретинитом, палочко-колбочковой дистрофией и возрастной макулярной деградацией, была обнаружена высокая частота мутаций гена, кодирующего ABCR [36-39]. Известно также, что нарушение функционирования этого белка является основной причиной развития болезни Штаргардта. Это рецессивная форма деградации сетчатки, при которой происходит прогрессирующая потеря центрального зрения и быстрое накопление в RPE-клетках флуоресцирующих отложений, носящих название «пигмента старости», или липофусцина [40]. Подробнее химический состав и биологическая роль этого пигмента будут рассмотрены ниже. Сейчас отметим лишь, что в процессе нормального обновления эпителия сетчатки кончик наружного сегмента палочки отламывается и фагоцитируется расположенными под ним клетками RPE, накопление же липофусцина происходит как раз в результате неполного «переваривания» дисков наружного сегмента [41,42].
После восстановления ретинолдегидрогреназой, процесс превращения полностью-трянс-ретинола в ll-z/wc-ретинол, способный снова связаться с молекулой опсина, сложен и состоит из нескольких стадий (рис. 1.2.1) [25,43-49]. Прежде всего, ретинол должен быть доставлен в клетки пигментного эпителия (RPE-клетки), через межфоторецепторный матрикс. Этот процесс осуществляется так называемым межфоторецепторным ретинолсвязывающим белком (IRBP), который также защищает полностью-тирянс-ретинол от нежелательных на данном этапе процессов изомеризиции и окисления [50]. В клетках пигментного эпителия ретинол связывается с клеточным ретинол-связывающим белком (CRBP), и с помощью фермента лецитин-ретинолацилтрансферазы (LRAT) в эндоплазматическом ретикулюме RPE-клеток ацилируется с образованием сложных эфиров - полностью-итрянс-ретинилпальмитата или стеарата [51].
Гидролиз и изомеризация ретинилпальмитата и ретинилстеарата осуществляются еще одним белком, специфичным для клеток пигментного эпителия - RPE65 [54-56]. Этот фермент способен легко взаимодействовать с полностью-гаранс-ретинилпальмитататом, полностью-транс-ретинолом, 11-цис-ретинолом, но очень слабо с 11-г/ис-ретинилпальмитатом. В отсутствие или при нарушении функций RPE65 фермента в клетках пигментного эпителия происходит накопление запасов эфиров полностью-гаранс-ретинола, но 11-г/ис-ретиналь не образуется [57,58]. Мутации по RPE65 являются в 10% случаев причиной развития слепоты в раннем возрасте или сразу после рождения - так называемого амавроза Лебера [59,60].
Следующим этапом зрительного цикла является связывания образовавшегося в результате описанных выше реакций гидролиза и изомеризации 11-г/ис-ретинола с клеточным ретиналь-связывающим белком - CRABP, который является переносчиком субстрата для 11-г/ш ретинолдегидрогеназы (RDH5) [61,62]. Этот NADH-зависимый фермент высокоспецифичен, и более активно окисляет ретинолы, нежели восстанавливает ретинали, причем 9-г/г/оретинол и \\-цис-ретинол являются для него более предпочтительными субстратами, чем полностью-транс-реттпоп [ 63 ]. Мутации по RDH5 у людей приводят к развитию дистрофий сетчатки, в частности к «синдрому пятнистой сетчатки» (fundus albipunctatus) — редкой форме нарушения сумеречного зрения, обусловленной задержкой регенерации зрительных пигментов палочек и колбочек, а также к рецессивной дистрофии колбочек [64-66]. Помимо RDH5, ту же функцию в клетках пигментного эпителия выполняет другой фермент - мембранный белок RDH11, используюший в качестве кофактора NADPH.
На завершающем этапе зрительного цикла 11-г/ис-ретиналь должен покинуть RPE-клетку и межфоторецепторному пространство и снова достичь мембраны фоторецепторной клетки. Этому процессу сопуствует колокализация нескольких белков, в том числе CRABP, RDH5 и IRBP, в апикальной части пигментного эпителия [61,67-69]. Известно, что сам 11-г/г -ретиналь в межфоторецепторном пространстве связан с IRBP [ 70 ], но нарушение синтеза этого белка не влияет на скорость регенерации родопсина, что говорит о возможности выполнения транспортной функции другими, альтернативными белками, например альбумином. Путь 11-г/г/оретиналя от плазматической мембраны к поверхности диска наружного сегмента изучен слабо. Предполагают, что этот процесс зависит от других белков, косвенно участвующих в транспорте ретиноидов, таких как периферина- белка, предположительно играющего структурную роль в наружном сегменте фоторецепторных клеток. Известно, что нарушение его синтеза приводит к ретинопатиям и замедленной темновой адаптации.
Снова оказавшись в мембране диска наружного сегмента, 11-г/мс-ретиналь диффундирует до тех пор пока не сталкивается с молекулой опсина. В результате такого столкновения он нековалентно связывается с «входным» сайтом белка, после чего образует Шиффово основание с Lys-296. Так родопсин восстанавливает активное состояние, снова приобретая способность воспринять квант света, и зрительный цикл на этом замыкается. 1.2.2. Биосинтез бис-ретинилиден-этаноламина из фосфатидилэтаноламина и свободного транс-ретияаля. Накопление липофусцина.
Ретиналь обладает высокой реакционной способностью, и его появление в свободном состоянии может приводить к образованию ряда побочных продуктов, особенно в тех случаях, когда нарушается своевременное выведение ретиналя из мембран дисков фоторецепторных клеток.
Эксперименты на липосомах. Получение спектров поглощения ретиналя
Липосомы изготавливались из тех же липидов, которые использовали для формирования БЛМ - DPhPC и DOPC. Липид растворяли в хлороформе (10 мг/мл), который после растворения высушивали в пробирке под струей аргона, так чтобы липид оставался в виде тонкого на ее стенках. Пробирку интенсивно встряхивали с буферным раствором (10 мМ КС1, 1 мМ HEPES, рН 7.5, 1 мг сухой массы липида на 1 мл буфера) в течение 5-10 минут для получения взвеси мультиламеллярных липосом. После встряхивания полученную суспензию 19 раз пропускали через экструдер с диаметром фильтра 100 нм для получения суспензию моноламеллярных липосом, которую впоследствии разбавляли еще в 200 раз для снятия спектров поглощения.
Для получения спектров использовали флюориметр «Флюорат 02 Панорама» («Люмэкс»), работающий в режиме снятия спектров поглощения и подключенный к АЦП компьютера. В кварцевую кювету наливали буферный раствор (1 мл), снимали спектр его поглощения (нулевую линию), после чего вместо буферного раствора ту же кювету заполняли суспензией липосом, в которую также в соответствующих опытах добавляли 1-5 мкл спиртового раствора ретиналя (конечная концентрация ретиналя в кювете составляла 16 мкМ в буфере). Во всех экспериментах нулевая линия (спектр поглощения буферного раствора без добавок) вычиталась из полученного спектра ретиналя с липосомами. Для освещения кюветы использовали ту же ртутную лампу, что и при наблюдении фотоэффектов в опытах с БЛМ (описание лампы приведено выше, в разеделе 2.1.3).
Для определения времени жизни к БЛМ прикладывалась внешняя разность потенциалов {рис.3.1.1а), и измерялся ток через мембрану (рис.3.1.16). Момент лавинообразного увеличения тока свидетельствовал о разрушении мембраны в результате ее электрического пробоя. Время жизни БЛМ во внешнем поле измерялось с момента включения внешнего поля до момента ее разрушения. Подобные измерения проводились при различных значениях приложенной разности потенциалов, и по результатом всех опытов строилась зависимость среднего времени жизни (каждая точка - результат усреднения по 5-10 измерениям), либо десятичного логарифма среднего времени жизни, от приложенного напряжения. Полученные кривые сравнивали для мембран различного состава - с добавлением А2Е в мембранообразующую смесь и без него (контрольная кривая).
Была построена зависимость среднего времени жизни мембраны, сформированной из насыщенного незаряженного липида DPhPC, от приложенного напряжения (рис.3.1.2), без А2Е (кривая 1) и в его присутствии (кривая 2). Бис-ретинилиден-этаноламин добавлялся предварительно в раствор липида в декане, так что его мольная доля пигмента от общего количества липида составляла 5%. По данным, представленным на рисунке, видно, что добавление А2Е в раствор липида не приводит к уменьшению стабильности мембраны - кривая 2 отличается от контрольной кривой не более чем на погрешность измерения. Был сделан вывод, что. среднее время жизни БЛМ, сформированной из DPhPC, не зависит от наличия бис-ретинилиден-этаноламина.
Подобные измерения были проведены на БЛМ, сформированных из ненасыщенного незаряженного липида DOPC (рис.3.1.3). В интервале напряжений от 400 до 800 мВ наблюдалось незначительное уменьшение времени жизни - в среднем на 1 мс, что при высоких значениях приложенной разности потенциалов (выше 700 мВ) уже не превышало погрешность измерения. При более низких значениях приложенного напряжения (до 400 мВ) результаты измерений с DOPC были плохо воспроизводимы (не показано на рисунках).
Следует отметить, что средние времена жизни мембран, сформированных из DOPC, были даже в отсутствие А2Е на порядок ниже таковых для DPhPC. Это объясняется тем, что диолеоиловые мембраны сами по себе менее стабильны и легче разрушаются. DOPC, в отличие от DPhPC, содержит двойные связи в углеводородных «хвостах» и в процессе эксперимента может окисляться кислородом воздуха.
Таким образом, во внешнем электрическом поле стабильность БЛМ, сформированных из липидов с незаряженными полярными группами - DPhPC и DOPC, в присутствии А2Е либо не нарушается вообще (в случае DPhPC), либо уменьшаются крайне незначительно, на величину сравнимую с погрешностью измерения (в случае DOPC). То есть детергентный эффект с данными липидами обнаружен не был.
Фото динамическое воздействие А2Е на мембраны и встроенные в них полипептиды
Результаты исследований, описанные в разделе 3.1, как и работы других авторов, свидетельствуют о том, что молекулы А2Е, благодаря своей амфифильности и наличию положительного заряда, способны даже в отсутствие освещения оказывать на искусственные и биологические мембраны детергентное (темновое) воздействие, которое в некоторых случаях приводит к необратимому нарушению структуры липидного бислоя. Однако этим токсичное действие А2Е не исчерпывается. Существуют данные, указывающие на участие А2Е в не только в темновом, но и в фотодинамическом (происходящем под действием света) разрушении мембран, белков и нуклеиновых кислот, приводящем к гибели клеток зрительного эпителия [72,150,153,154,190]. Предлагаемые в настоящей работе модели фотодинамического разрушения БЛМ различного липидного состава и фотоинактивации грамицидинового канала, как простейшего искусственного аналога мембранного белка, были использованы впервые для изучения механизмов патогенного воздействия А2Е. Эти результаты могут быть полезны как для проверки литературных данных о фотосенсибилизации А2Е и фоторазрушении мембран и мембранных белков, так и для получения более точных данных о возможных механизмах возникновения дегенеративных заболеваний сетчатки, индуцированных освещением в присутствии А2Е.
В данной части работы А2Е добавляли не в раствор липидов, до формирования мембраны, как это делалось в разделе 3.1, а в водный раствор ячейки, когда мембрана уже сформирована, и только с одной стороны БЛМ - противоположной источнику света (г/г с-отсек ячейки), после чего пигмент из водного раствора адсорбировался на липидном бислое. Такое нововведение было продиктовано несколькими причинами. Во-первых, это позволило регистрировать встраивание А2Е по изменению разности граничных потенциалов при его асимметричной адсорбции из водного раствора и оценивать его реальное количество в липидном бислое.. В результате оценки количества молекул пигмента, встроенного в БЛМ, по вызываемой им разности граничных потенциалов, было обнаружено, что оно при таком способе введения в бислой оказывается не меньше, чем при его введении в мембранообразующую смесь — до 20% А2Е в составе сформированной БЛМ. Во-вторых, при этом расходуется намного меньше вещества, и оно адсорбируется асимметрично только с одной стороны бислоя, что более удобно для исследования фотоэффектов.
Наиболее удобным способом изучения фотодинамического воздействия вещества на БЛМ является измерение его времени жизни в темноте и при освещении. Время жизни БЛМ при освещении измерялось с момента начала освещения, а в темновых условиях - с момента формирования мембраны, до ее разрыва. Согласно полученным нами ранее данным, адсорбция А2Е с одной стороны БЛМ и последующее освещение вызывают появление асимметрии граничных потенциалов на ее границах, что в условиях короткозамкнутой цепи приводит к возникновению электрического поля внутри мембраны. Чтобы избежать этого, эксперимент проводили в условиях компенсации внутримембранного поля (КВП). Зависимость разности граничных потенциалов («потенциал адсорбции» А2Е) на БЛМ (D0PC), от времени, после добавления в один из отсеков ячейки А2Е. Стрелками отмечены момент добавления пигнмента в раствор, момент включения и пробой мембраны.
БЛМ формировали из раствора липида (DPhPC либо D0PC) в декане, после чего в один из отсеков вводили спиртовый раствор А2Е (начальная концентрация А2Е в ячейке - 4 мкМ), параллельно измеряя разность граничных потенциалов методом КВП. Достижение разности граничных потенциалов стационарного уровня 60-80 мВ свидетельствовало об окончании адсорбции А2Е (рис. 3.2.1). После этого включали постоянное освещение мембраны, и измеряли время до ее разрыва. Среднее времени жизни мембраны рассчитывалось по результатам 5-10 экспериментов для каждого случая - при освещении и в темноте, в присутствии А2Е и без А2Е, для каждого из двух исследуемых липидов. Выяснилось, что БЛМ, сформированные из DPhPC, практически не разрушались в присутствии А2Е ни в темноте, ни при освещении - их время жизни всегда составляло более 2 часов и не зависело от добавления пигмента (не показано на рисунках).
Среднее время жизни мембран из DOPC, не содержащих А2Е тоже составляло более 2 часов и не зависело от освещения. Мембраны из DOPC, на которые предварительно адсорбировался пигмент, напротив, при освещении оказывались значительно менее стабильными, тем в темноте. Время жизни таких БЛМ в отсутствие освещения составило в среднем около 80 минут, а при освещении видимым светом - 18 минут (диаграмма нарис. 3.2.2). То есть, при наличии А2Е в составе мембран, сформированных из ненасыщенного липида, время жизни уменьшалось под действием света в 4 раза, в то время как мембраны из насыщенного липида не разрушались при освещении в присутствии А2Е.
Наиболее вероятной причиной нарушения стабильности БЛМ, сформированной из DOPC, в присутствие А2Е, является окисление ненасыщенных липидов активными формами кислорода, образующимися при освещении пигмента. Это согласуется с литературными данными о фототоксичности компонентов липофусцина, которая может быть причиной гибели клеток зрительного эпителия сетчатки [149, 151 ]. При этом А2Е ведет себя как слабый фотосенсибилизатор.
Следует отметить, что, независимо от липидного состава БЛМ, под действием непрерывного освещения после окончания адсорбции пигмента снова наблюдалось возрастание разности граничных потенциалов, а затем ее уменьшение, вплоть до момента разрыва мембраны (рис.3.2.1). Если во время роста потенциала свет выключали, потенциал сначала продолжал расти с большей скоростью, а затем выходил на стационарный уровень. Последующее включение света приводило к уменьшению потенциала (данные не приведены). Это может быть связано с фотохимическими превращениями А2Е, которые требуют отдельного исследования. Рост потенциала, предположительно, обусловлен образованием некого промежуточного соединения, впоследствие превращающегося в эпокси-А2Е [152, 191 ], который гидрофилен и поэтому частично может выходить из мембраны обратно в водный раствор.
Из полученных в данном разделе результатов можно сделать вывод о том, что А2Е оказывает фотодинамическое воздействие на БЛМ, и эффект сильно зависит от липидного состава - время жизни при освещении уменьшалось только при формировании мембран из DOPC. Таким образом, решающую роль здесь играет наличие двойных связей в углеводородных хвостах липида, из которого сформирована мембрана, в то время как при детергентном воздействии А2Е (см. раздел 3.1) этот фактор играл второстепенную роль. Предположительно, фототоксичный эффект обусловлен окислением ненасыщенных липидов активными формами кислорода (синглетным кислородом, супероксиданионрадикалом), генерируемыми адсорбированным на мембране пигментом под действием света. Для получения более подробной информации о механизмах фотодеструктивного воздействия А2Е необходимо использование более точных количественных методов, например метода фотоинактивации грамицидинового канала.
Фотодеструктивное воздействие ретиналя на БЛМ и встроенные в нее мишени
Была изучена способность полностью-гарсшоретиналя оказывать воздействие на время жизни мембран различного липидного состава в темноте и при освещении видимым светом. Время жизни мембраны измерялось с момента ее формирования до момента разрушения, который регистрировался по лавинообразному увеличению проводимости. В отличие от описанных в разделе 3.2.1 экспериментов с А2Е, в случае ретиналя не было необходимости в компенсации внутримембранного поля при его адсорбции на БЛМ. Это связано с тем, что, как было показано в разделе 4.1, ретиналь распределяется в мембране симметрично и не вызывает значительной асимметрии граничных потенциалов. Таким образом, возможность электрического пробоя под действием внутримембранного поля в случае ретиналя исключена. Разность же граничных потенциалов порядка 1.5-2.5 мВ, обнаруженная в разделе 4.1.1 (см. также рис. 4.1.4), не способна вызывать электрический пробой и оказывать заметного воздействия на время жизни БЛМ. По этой причине измерения в данной части работы на протяжении всего эксперимента измерялись только емкость и проводимость мембраны, без регистрации величины внутримембранного поля.
БЛМ формировались как из насыщенного (DPhPC), так и ненасыщенного (DOPC) липидов. После формирования мембраны по методике Мюллера-Рудина, спиртовой раствор ретиналя добавлялся в ячейку (концентрация в ячейке - 80мкМ), в один из ее отсеков. Через 45-60 минут (время, достаточное для встраивания ретиналя из раствора, согласно данным/л/с.4.7.1 я рис.4.1.3) включали освещение и ждали разрушения мембраны. Как и в случае А2Е, в отсуствие освещения время жизни БЛМ измерялось с момента ее формирования.
Мембраны, сформированные из насыщенного липида (DPhPC), не разрушались ни при освещении, ни в темноте, независимо от присутствия ретиналя. Их проводимость в присутствии ретиналя тоже не увеличилась, т.е. как и в предыдущем разделе, детергентный эффект в данных условиях обнаружен не был (не показано на рисунках). И только БЛМ из ненасыщенного липида (DOPC) разрушались в присутствии ретиналя при освещении примерно втрое быстрее, чем в темноте (13 и 40 мин соответственно). Подобный результат был получен ранее с А2Е, где при освещении среднее время жизни также заметно уменьшалось на мембранах из DOPC, но не из DPhPC (см. раздел 3.2.1 и рис.3.2.2), с той лишь разницей, что ретиналь не вызывал увеличения проводимости БЛМ до ее разрушения. Наиболее вероятно, что при встраивании в мембрану ретиналя, как и А2Е, становится возможным фотодинамическое разрушение мембран, обусловленное окислением липидов, имеющих двойные связи в углеводородных цепях, активными формами кислорода. Это предположение и обнаруженный эффект согласуются с данными работ [94,95,112,116,195]. Механизм фотоокисления мембранных липидов в присутствии ретиналя требует дальнейшего изучения на других модельных системах, а для более детального количественного анализа интенсивности фотодинамического воздействия ретиналя на БЛМ был использован метод фотоинактивации грамицидинового канала, аналогично тому как это было сделано ранее в случае А2Е.
Судя по приведенным в разделе 4.2.1 результатам, ретиналь под действием света может понижать стабильность мембран, что, предположительно, обусловлено окислением ненасыщенных липидов активными формами кислорода. Известно, что подобная опасность возникает и применительно к мембранным белкам, функции которых могут нарушаться в присутствии ретиналя [116].
Аналогично проведенным исследованиям с А2Е (раздел 3.2.2), была изучена фотоинактивация грамицидина и в присутствии ретиналя. Регистрировалась зависимость проводимости БЛМ от времени {рис.4.2.2) После добавления грамицидина в оба отсека ячейки наблюдался рост проводимости до нескольких десятков нСм, свидетельствующий о его встраивании в БЛМ и формировании каналов (объединении мономеров грамицидина в димеры). После достижения стационарного уровня проводимости в ячейку добавляли ретиналь и через 40-60 мин включали освещение. Как и ожидалось, освещение приводило к значительному уменьшению проводимости, причем эффект был обратимым: после выключения света происходило частичное восстановление проводимости за счет встраивания в мембрану неповрежденного грамицидина из раствора.
Для того чтобы оценить количественно скорости фотоинактивации грамицидинового канала в разных условиях и сравнить механизмы фотодинамического воздействия ретиналя и А2Е, для каждого случая рассчитывали величину обратного характерного времени экспоненты, аппроксимирующей кинетику уменьшения проводимости. В случае ретиналя значение обратного характерного времени экспоненты оказалась примерно в 3 раза выше, чем рассчитанное ранее для А2Е (см. табл.4.2.1 и раздел 3.2.2).
Принимая во внимание полученные результаты и известную способность ретиналя к генерации активных форм кислорода под действием света, естественно предположить, что процесс фотоинактивации грамицидинового канала обусловлен именно этой причиной. Чтобы проверить это предположение, мы ввели ретиналь в ячейку с БЛМ, модифицированной грамицидином, и затем освещали ее, когда в растворе присутствовали азид натрия либо супероксиддисмутаза. При наличии азида проводимость мембраны после включения света практически не уменьшалась (обратное характерное время составляло менее 0.3 минут, либо фотоинактивации вообще не наблюдалось), т.е. его присутствие вызывало полное ингибирование фотоинактивации грамицидинового канала. Это свидетельствует о том, что фотодинамическое воздействие ретиналя на грамицидин может быть опосредовано появлением синглетного кислорода. В присутствии СОД также происходило значительное (хотя и неполное) ингибирование процесса фотоинактивации.
Для оценки вклада синглетного кислорода и супероксиданионрадикала в фотоинактивацию грамицидина, обусловленную каждым из двух фотосенсибилизаторов, были рассчитаны показатели относительного ингибирования фотодинамического воздействия - относительное уменьшение скорости фотоинактивации грамицидина в присутствии азида натрия либо СОД, выраженное в процентах (рис.4.2.3). Оказалось, что в случае А2Е азид натрия вызывает уменьшение скорости фотоинактивации приблизительно на 62%, а супероксиддисмутаза - на 32%. В случае ретиналя в присутствии азида скорость фотоинактивации уменьшалась на 97%, а в присутствии супероксиддисмутазы - на 8%. Более высокая степень ингибирования эффекта ретиналя в присутствии азида и СОД по сравнению со степенью ингибирования воздействия А2Е свидетельствует о том, что генерируемые ретиналем синглетныи кислород и супероксиддисмутаза вносят более значительный вклад в фотоокисление грамицидина, и в исследуемой модельной системе ретиналь при освещении генерирует большее количество АФК. Освещение А2Е в составе БЛМ тоже генерирует синглетныи кислород и супероксиданионрадикалы, но в меньшем количестве, причем воздействие А2Е обусловлено преимущественно супероксидным анионрадикалом (его относительный вклад в фотодинамическое воздействие примерно в 2 раза выше, чем вклад синглетного кислорода). Возможно, при освещении А2Е в составе БЛМ задействованы также и другие механизмы фотоокисления, т.к. оба тушителя вызывали лишь частичное ингибирование эффекта.
