Введение к работе
Актуальность проблемы.
Дофамин по химической структуре относится к биогенным аминам, конкретно к катехоламинам. Как гормон, выделяемый эндокринными железами и другими тканями, дофамин оказывает сложное и многогранное гуморальное регулирующее воздействие на организм в целом либо на определённые органы и системы-мишени (Goldstein et. al., 1995; Missale et al., 1998; Mezey et. al., 1998, 1999). Поэтому гормональные нарушения носят системный и комплексный характер, их вред проявляется на организменном уровне. В центральной нервной системе дофамин, играя роль нейротрансмиттера и нейромодулятора, участвует в контроле двигательной активности (Clark et al., 1991; Furmidge et al., 1991; Pereda et al., 1992, 1994), эмоций (Nieoullon, Coquerel, 2003; Salqado-Pineda et al., 2005), нормального поведения (Toates, 1998; Ikemoto, Panksepp, 1999; Ann, Salamone et. al., 2003; Phillips, 2007). Нарушение функционирования дофаминергической системы в мозге приводит к развитию различных патологических состояний, таких как наркомания, паркинсонизм, шизофрения, сумеречные состояния и некоторые другие (Угрюмов, 2007, Nestler, 2004). Согласно классической и общепринятой точки зрения, широко освещенной и интенсивно исследуемой в настоящее время, мишенью действия дофамина считаются специфические рецепторы, расположенные на плазматической мембране нейрона (Раевский 1976; Missale et al., 1998; Шабанов, 2004). Лигандные взаимодействия нейротрансмиттера с ними влечет за собой изменение баланса ионов в цитоплазме, приводящее к активации клетки. Согласно другой точке зрения нейрогрансмиттеры, в частности, дофамин, способны в дополнение к их взаимодействию с рецепторами влиять на клетку трофическим образом, минуя рецепторы. Предполагается, например, что, растворяясь в липидах плазматической мембраны, они могут изменять ее физико-химические свойства, в том числе влиять на лигандные и канальные характеристики встроенных в нее рецепторов (Cantor, 2003; Milutinovic et al., 2007). Взаимодействуя с некоторыми цитозольными белками, такими как оф-пептид, а-синуклеин или актин, катехоламины могут вызывать изменения функциональной активности клеток, влияющей на их жизнеспособность (Павлик и др., 2004; Li et al., 2004). Гипотеза о трофическом взаимодействии дофамина с определенными субстратами клетки пока разработана крайне слабо, большинство ее аспектов лишь теоретически обозначено, все они требуют экспериментальной проверки и подтверждения с привлечением комплексных подходов, использующих применение различных методов и разных объектов исследований.
Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было комплексное морфофункциональное исследование влияния дофамина на живые клетки и на искусственные модельные системы для определения клеточной мишени действия нейротрансмиттера. Были поставлены следующие задачи: 1. Изучить морфофункциональные эффекты аппликации на маутнеровские нейроны золотой рыбки дофамина и определить его внутриклеточные мишени. 2. Изучить биофизическими методами поведение дофамина в модельных системах, в частности, его взаимодействие с выделенным глобулярным (Г-) актином, влияние на плоскую билипидную мембрану, способность воздействовать на агрегатное состояние актина, предварительно заключенного в тонкостенные липосомные везикулы. 3. Изучить взаимодействие дофамина с культивируемыми фибробластоподобными клетками линии ВНК-21, определить его эффект на выживаемость и ультраструктуру клеток, а также выявить внутриклеточную локализацию с помощью цитохимической реакции Фалька для выявления катехоламинов.
Научная новизна. Впервые поставлен вопрос о трофическом действии дофамина на живую клетку и получены комплексные экспериментальные доказательства того, что в качестве основной клеточной мишени дофамина выступает цитозольный актин. Об этом свидетельствуют следующие установленные фундаментальные факты. При аппликации на живой нейрон дофамин вызывает гипертрофию синаптических специализированных контактов, построенных из филаментозного (Ф-) актина. Такой же эффект оказывает на нейроны аппликация дигидропиримидинтиона, производного дофамина, обладающего таким же, как и дофамин, полимеризующим эффектом на Г-актин. При этом есть основание
считать, что дигидропиримидинтион, по-видимому, не обладает сродством к дофаминовым рецепторам и переносчикам из-за того, что его наиболее важные для взаимодействия с рецепторами функциональные группы (ОН и NH2) максимально заблокированы, а также стерически затруднены. Блокада дофаминовых рецепторов не предотвращает вызванную дофамином полимеризацию актина. При взаимодействии in vitro с дофамином Г-актин превращается в Ф-актин. Впервые показано, что дофамин проникает через искусственную фосфолипидную мембрану, в принципе не имеющую ни рецепторов, ни переносчиков, причем в концентрации, способной вызвать полимеризацию актина по другую сторону мембраны. Впервые с помощью цитохимической реакции Фалька, параллельного ультраструктурного анализа и метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определено, что дофамин способен проникать в живую клетку и полимеризовать цитозольный актин, встраиваясь в структуру формируемых нитей.
Научно-практическая значимость работы. Проведенное исследование имеет важное общебиологическое значение, расширяя представления о взаимодействии биогенных аминов с клеткой. Дофамин химически очень близок по структуре и свойствам к таким катехоламинам как адреналин и норадреналин, которые являются гормонами системного действия. По аналогии с дофамином, можно предположить, что биогенные амины помимо своего лигандного взаимодействия с рецепторами также обладают свойством трофически влиять на цитозольный актин клеток. Попадая в кровь, они способны изменять функциональную активность ее форменных элементов. При общей оценке гормонального статуса организма этот ранее не известный эффект теперь представляется необходимым учитывать, во всяком случае, намечена перспектива исследовать такое влияние катехоламинов на клетки, ткани и органы. Просматривается прикладной аспект обнаруженного свойства дофамина взаимодействовать с актином живой клетки. Этот катехоламин можно использовать в качестве молекулярного инструмента для исследования роли актина в функциональных проявлениях клетки. В том числе, в патологически измененной функции, учитывая данные о повреждающем действии дофамина на клетки ВНК-21, которые являются трансформированными и могут рассматриваться как модель опухолевой клетки.
Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на V международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения -2006» (Санкт-Петербург, 21-23 мая 2006г); на XX юбилейном съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 4-8 июня 2007г); на 11-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007г); на школе-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия - 2007» (Пущино, 10-12 декабря 2007г); на 3-м и 4-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 12-20 июня 2007г и 10-20 июня 2008г); на 9-ой и 10-ой международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы». (Донецк, 23-25 мая 2007г и июнь 2008г); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2-4 июня 2009г); XV международной конференции по Нейрокибернетике. (Ростов-на-Дону, 23-25 сентября 2009г).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 5 статей в рецензируемых журналах, 4 из которых входят в регламентированный список ВАК, и 3 статьи в сборниках работ.
Структура и объем диссертации
