Введение к работе
Актуальность проблемы. Хроническое увеличение уровня циркулирующих в крови липидов и свободных жирных кислот (ЖК) является одним из основных риск-факторов развития ожирения, диабета 2 типа и ряда сердечно-сосудистых заболеваний (Desvergne et al, 2004, McGavock et al, 2006). При микровезикулярном стеатозе в печени срочная мобилизация ЖК может быть причиной гибели клеток мозга (печеночные энцефалопатии, синдром Рейе и Рейе-подобные заболевания). В остром варианте при переходе от ишемии пораженного участка к его реперфузии при инфаркте или инсульте, резкое накопление ЖК и их производных - ацил-КоА и ацилкарнитинов -рассматривается как один из главных механизмов поражения клеток сердца и мозга (Katz, 1982 Corr et al, 1984, Liedtke, 1988 Weiss et al, 2003., Phillis et al, 2002).
К числу наиболее токсичных жирных кислот относятся насыщенные -миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С16:0) и ненасыщенные - олеиновая (С18:1), арахидоновая (С20:4) кислоты.
Хорошо известны протонофорные эффекты насыщенных ЖК, а также способность ЖК стимулировать формирование митохондриальной поры (тРТР) (Wojtczak et al, 1998, Bernardi et al, 2002). Также имеются данные, что апоптоз клеток, вызванный длинноцепочечными ЖК, опосредован действием их активированных производных {El-Assaadet al, 2003, Hardy et al, 2003).
Накопление Ca2+ в митохондриях (MX), в присутствии избытка ЖК, с последующей деполяризацией MX, возникновением тРТР и выбросом Са2+, НАДН и цитохрома С, рассматривается как основной механизм дисфункции MX, обуславливающий гибель клеток вследствие некроза или апоптоза {Bernardi, 2002, Trost and Lemasters, 1996, 1997, Penzo et al, 2002). Другие авторы (Abdul-Ghani, et al, 2008, Tominaga et al, 2008) постулируют первичную роль дисфункции митохондрий при избытке не только свободных ЖК, но и длинноцепочечных ацилкарниитинов и ацил-КоА.
Регуляция системы [3-окисления ЖК устроена таким образом, что при избыточной мобилизации ЖК в системе может возникать феномен автоингибирования (Dynniket al, 1984). В результате ингибирования ключевых реакций производными лекарственных препаратов может усиливаться феномен автоингибирования р-окисления ЖК с накоплением КоА-производных, с последующим каскадом ингибирования и других метаболических и сигнальных систем печени, сердца и мозга (Дынник и др., 2005). Помимо митохондриальных ферментов мишенью производных длинноцепочечных ЖК являются почти все Са2+-транспортирующие системы клетки. Показано, что ацилкарнитины длинноцепочечных ЖК могут ингибировать или непосредственно активировать Са2+-каналы плазмалеммы (Spedding and Mir, 1987, Wu and Corr, 1992). Ацил^ KoA или их комплексы с буферным белком АСВР, а также ацилкарнитины' способны активировать Са +-каналы саркоэндоплазматического (СР/ЭР) ретикулума: рианодиновые каналы (RyR) (Fulceri et al, 1994, Dumonteil et al,
1994, el-Hayek et al, 1993, Yamada et al, 1994) и 1Рз-чувствительные каналы (IP3R) (Fulceri et al, 1993). В зависимости от концентрации, ацилкарнитины могут стимулировать или подавлять активность Са2+-транспортирующих АТФаз (Adams et al, 1979, Dumonteil et al, 1994). В некоторых работах показано, что длинноцепочечные ацилкарнитины способны вызывать кальциевую перегрузку клеток (Netticadan et al, 1999).
Таким образом, в литературе имеются данные, указывающие на потенциальные мишени действия ЖК и их производных при накоплении в клетках. Но сведения о временной организации этих процессов, и о том, какие из них являются первостепенными и критическими, фрагментарны. Отчасти это может быть связано с широким использованием модельных систем (исследования на микросомах, суспензиях митохондрий, пермеабилизованных клетках). По нашим представлениям, такой упрощенный подход накладывает ограничения на возможность перенесения результатов исследований на уровень целой клетки.
Цель исследования. Целью данной работы является выяснение механизмов токсического действия патофизиологических доз длинноцепочечных ацилкарнитинов на культуры клеток различных типов.
Основные задачи исследования.
Выявление причин увеличения концентрации ионов кальция в цитозоле клеток при действии патофизиологических доз ацилкарнитинов.
Установление роли митохондрий в процессе развития токсического эффекта длинноцепочечных ацилкарнитинов.
Определение механизмов возникновения неспецифической проницаемости плазмалеммы клеток при действии токсичных доз ацилкарниитнов.
Научная новизна работы. В настоящей работе показано, что длинноцепочечные ацилкарнитины - пальмитоилкарнитин (PC) и миристоилкарнитин (МС) в концентрациях 10-50мкМ приводят к дестабилизации кальциевого гомеостаза возбудимых и невозбудимых клеток за счет активации кальциевых каналов саркоэндоплазматического ретикулума (СР/ЭР) с последующим нарушением проницаемости плазмалеммы. В кардиомиоцитах ацилкарнитины вызывают рост [Са2+], после лаг-фазы, сопровождающийся развитием гиперконтрактуры и последующим возникновением неспецифической проницаемости плазмалеммы для ионов Са2+, Na+ и молекул флуоресцентного зонда. В невозбудимых клетках (АКЭ, НЕр-2, астроциты) увеличение [Ca2+]j происходит без лаг-фазы и усиливается за счет входа Са2+ из внеклеточной среды через SOC-каналы. Наиболее резистентными к воздействию ацилкарнитинов являются гепатоциты. Наблюдаемый токсический эффект специфичен для PC и МС и не возникает при действии соответствующих ЖК, а также ацилкарнитинов с меньшей длиной углеродной цепи.
При действии ацилкарнитинов не происходит гиперпродукции АФК в клетках. Роль потенциал-зависимых Са2+-каналов, а также реверсии Na+/Ca2+-обменника сарколеммы кардиомиоцитов и нейронов в увеличении [Са2+]; является минорной.
Впервые показано перераспределение Са2+ из СР в MX сразу после добавления ацилкарнитинов во время лаг-фазы в кардиомиоцитах. При этом MX ограничивают рост [Са +]j, исполняя роль Са2+-буфера, а истощение Сабвуферной емкости MX приводит к увеличению [Ca2+]j.
На суспензиях MX показано, что ацилкарнитины оказывают бифазный эффект на энергетику MX - малые дозы ацилкарнитинов оказывают стимулирующий субстратный эффект, а большие дозы PC или МС приводят к деэнергизации MX. Нами впервые показано, что эти эффекты воспроизводятся на целых клетках.
Показано, что формирование митохондриальной поры (тРТР) не имеет решающего значения в развитии некроза клеток при действии патофизиологических доз PC или МС: присутствие циклоспорина А не влияет на наблюдаемый эффект, a MX сохраняют высокие значения мембранного потенциала (МП), по крайней мере, до нарушения целостности плазмалеммы.
Впервые показано, что длинноцепочечные ацилкарнитины стимулируют образование микродоменов с высоким содержанием Са2+ в кардиомиоцитах, которые могут способствовать возникновению автокаталитического цикла активации Са2+-зависимых фосфолипаз (cPLA2, PLC, PLD), с последующим истощением структурных фосфолипидов мембран, возможным накоплением токсичных продуктов фосфолипаз и развитием неспецифической проницаемости плазмалеммы. Показано, что подавление активности фосфолипаз cPLA2 и PLC предотвращает нарушения целостности плазматической мембраны клеток, вызванные ацилкарнитинами.
Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют глубже понять процессы, связанные с развитием острых токсических эффектов длинноцепочечных ЖК и их активированных производных при синдроме Рейе и Рейе-подобных заболеваниях, а также при реперфузии тканей в постинфарктный или постинсультный период. Кроме того, результаты данной работы могут расширить круг потенциальных мишеней для действия фармакологических препаратов при указанных расстройствах.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2007, 2009), на конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008), на XII и XIII международных Путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пушино, 2008, 2009), а также на международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2008).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 13 печатных работах, из них 2 статьи в реферируемых журналах, 5 статей в сборниках и 6 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на ^істраницах с использованием .^'рисунков j. таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержитя&Г ссылок.
