Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Молекулярные механизмы фотодинамических реакций 4
1. Видимый свет. Хромофоры видимого света 4
2. Реакции I и II типа 5
3. Активные формы кислорода (АФК) 7
4. Определение типа фотодинамических реакций 9 Глава II. Фотодинамические повреждения биомолекул и органелл клетки 10
1. Перекисное фотоокисление липидов 10
2. Фотоповреждение белков 14
3. Фотоповреждение биомембран 16
4. Фотоповреждение нуклеиновых кислот и наследственного аппарата 22
Глава III. Фотовыцветание порфириновых сенсибилизаторов 23
Глава IV. Фотодинамическая инактивация микроорганизмов .
Эндогенные порфирины 27
1. Фотодинамическая антимикробная терапия 27
2. Биосинтез порфиринов 29
3. Регуляция биосинтеза порфиринов 32
Материалы и методы исследования 35
Результаты и обсуждение 41
Глава I. Определение оптимальных условий индуцированного накопления эндогенных порфиринов и их фотоинактивирующей эффективности в клетках дрожжей 41
Глава II. Фотовыцветание эндогенного протопорфирина IX 58
Глава III. Фотодинамическое повреждение субклеточных структур дрожжей с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX , 65
Выводы 75
Список литературы
- Активные формы кислорода (АФК)
- Фотоповреждение биомембран
- Биосинтез порфиринов
- Фотовыцветание эндогенного протопорфирина IX
Активные формы кислорода (АФК)
Известно, что, в отличие от большинства органических молекул, кислород в основном состоянии является триплетным и имеет два неспаренных электрона. При поглощении энергии молекулами кислорода заселяются синглетные уровни l Z&+ и lAg с энергиями 157 кДж/моль и 94,2 кДж/моль соответственно. В конденсированной фазе кислород в состоянии lY,g+ за десятки пикосекунд растрачивает излишек энергии, образуя g, и поэтому не может играть существенной роли в химических и биологических процессах (Красновский (мл.), 1988). Переход из Ag в основное состояние является спин-запрещенным, вследствие чего состояние lAg имеет довольно большое время жизни - около 3 мкс в воде и в 4-50 раз больше в большинстве органических растворителей (Ochsner, 1997).
Синглетный кислород ООг) является весьма реакционноспособным соединением. Следствием эффективного тушения Юг в реакциях с биомолекулами является его короткое время жизни в клеточной среде, варьирующее от 24-130 не в мембранах до 170-320 не в протоплазме (Красновский (мл.), 1998).
Дифузионный радиус синглетного кислорода, составляющий в чистой воде 100-200 нм, в клетке снижается до 45 нм (Ochsner, 1997). Вследствие этого наибольшее деструктивное воздействие оказывается на те макромолекулы и структуры, которые находятся в пределах диффузионного радиуса синглетного кислорода, т.е. вблизи мест локализации фотосенсибилизаторов - генераторов синглетного кислорода. 3.2. Другие активные формы кислорода
Супероксидный анион-радикал ((V), образующийся в реакциях I типа, является относительно долгоживущим ( 2 мс при физиологических рН) активным состоянием кислорода и способен вызывать депротонирование некоторых молекул:
Однако, поскольку О21 характеризуется относительно низкой реакционной способностью, то его повреждающее действие на биоструктуры реализуется главным образом за счет образования других реакционноспособных частиц, в первую очередь гидроксильного радикала ОН-, генерируемого в катализируемых ионами железа реакциях Хабера-Вайса (реакции Фентона):
Высокореакционноспособный ОН- легко взаимодействует с большинством биомолекул, отрывая или присоединяя атом водорода. В воде время жизни ОН- меньше 1 мкс, вследствие чего он, как и синглетный кислород, реагирует с молекулами биосубстрата в ближайшем микроокружении. Еще одна АФК - перекись водорода (Н202) - является продуктом либо дисмутации 02" 02: + Н+ + но2- - Н202 + 02, либо его одноэлектронного восстановления: 02- + е- - 022" +2Н+ - Н202 4. Определение типа фотодинамических реакций
Для того чтобы определить, по какому типу идет фотосенсибилизируемая реакция в биологической системе, используют ряд особенностей Ю2: 1) увеличение времени жизни Ю2 при замене Н20 на D20 до 53 мкс; 2) влияние тушителей Ю2 (азида натрия, гистидина, В-каротина и др.); 3) наличие индуцируемых Ю2 конечных продуктов фотоокисления, отличных от тех, которые получаются с участием свободных радикалов: например, для холестерина это соответственно 5а- и 7а-гидроперекись, для цистеина - цистин и цистеиновая кислота, а для метионина - метионин сульфоксид и метионал. Также возможно использование ловушек свободных радикалов (маннитола для ОН-; бутилированного гидрокситолуина для ROO или RO) (Girotti, 1990, 1992).
Однако следует учитывать, что многие ловушки Ю2 и свободных радикалов не обладают абсолютной специфичностью, например азид способен перехватывать не только Ю2, но и ОН-. Кроме того, некоторые из них, включая азид и маннитол, слишком полярны для взаимодействия с мембранами, в то же время другие (например, бутил ированный гидрокситолушз) при взаимодействии с мембраной могут повредить ее структуру (Girotti, 1992). При использовании D20 необходима эффективная замена Н20 на D20 в реакционной системе. Однако в связи с тем, что участки мембраны, в которых происходят фотосенсибилизированные реакции, возможно, обеднены водой, отсутствие эффекта D20 может быть неверно интерпретировано как неучастие синглетного кислорода в реакции (Smith, 1981).
Вероятность того, по какому типу (I или II) пойдет фотосенсибилизируемая реакция, или, другими словами, с чем провзаимодействует триплетный сенсибилизатор - с биосубстратом или с молекулярным кислородом, определяется природой сенсибилизатора и субстрата, относительными константами скоростей реакций сенсибилизатора с 02 и сенсибилизатора с субстратом, относительными концентрациями кислорода и субстрата, наличием либо отсутствием связи между сенсибилизатором и субстратом, а также внутриклеточной локализацией фотосенсибилизатора (Фут, 1979; Menon et al., 1990; Henderson and Dougherty, 1992). При увеличении концентрации субстрата или комплексировании сенсибилизатора с субстратом до облучения увеличивается вероятность реакций I типа, в которых окисление субстрата происходит лишь в непосредственной близости к сенсибилизатору. Благоприятствовать протеканию реакций по механизму 1-го типа может энергетическая стабилизация генерируемых радикальных пар в полярной среде (Ochsner, 1997). Существенное влияние на преобладание того или иного типа реакции могут оказывать и другие факторы, например, наличие тушителей активных форм кислорода (Фут, 1979).
Фотоповреждение биомембран
Поглощение и флуоресценция порфиринов обусловлены наличием системы двойных связей. Мономеры порфиринов, также как димеры и олигомеры, имеют очень сходные формы спектров поглощения и флуоресценции в разных средах безотносительно природы растворителя или липидного окружения. Отличительным признаком спектра поглощения мономеров свободных порфиринов является резкий максимум вблизи длины волны 400 нм (полоса Соре) и четыре убывающих по интенсивности пика поглощения в области 450-700 нм (Ricchelli, 1995; af Klinteberg et al., 1999); металлопорфирины в этой области имеют две полосы поглощения примерно равной интенсивности (например, Zn-протопорфирин IX - около 540 и 580 нм) (Ferreira and Gong, 1995).
Спектр флуоресценции мономеров свободных порфиринов в области 550-750 нм характеризуется двумя полосами, чьи максимумы зависят от химической структуры порфирина и растворителя (около 620-640 и 660-690 нм). Отношение интенсивн остей этих двух пиков приблизительно 3:1 (van der Meulen et al., 1997; af Klinteberg et al., 1999). Квантовые выходы флуоресценции мономеров карбоксильных порфиринов составляют 0,04-0,09 в гомогенных растворах, 0,09-0,13 в липосомах и 0,07-0,13 в митохондриальных мембранах в зависимости от липидного микроокружения красителя. В спектрах поглощения и флуоресценции более гидрофобных порфиринов наблюдается красный сдвиг (Ricchelli, 1995).
Практически все порфириновые сенсибилизаторы фотолабильны, т.е. при действии света происходит их "фотовыцветание", которое проявляется в снижении поглощения и/или интенсивности флуоресценции. Реакции фототрансформации были детально исследованы для протопорфирина IX ш vitro. При облучении светом в присутствии кислорода протопорфирин IX подвергается двум основным типам фототрансформации. В первом случае происходит фотоиндуцированный разрыв порфиринового хромофора, что приводит к появлению фотолабильного продукта биливердинового типа (Gudgin Dickson and Pottier, 1995), а также продуктов, не поглощающих в видимой области - ди- или монопирролов (Rotomskis et al., 1997). Другой тип фототрансформации протопорфирина IX сопровождается образованием фотопродуктов протопорфирина IX, которые сами сильно поглощают в той же спектральной области, что и протопорфирин IX и также содержат порфириновые хромофоры, определяющие их потенциальную цитотоксичность. Некоторые фотопродукты протопорфирина IX способны фотогенерировать ]02 с выходом, сходным с таковым для протопорфирина IX (Gudgin Dickson and Pottier, 1995).
Были идентифицированы два основных типа порфиринсодержащих фотопродуктов протопорфирина IX. С наибольшим выходом образовывался зеленый "фотопротопорфирин", возникающий в результате циклоприсоединения 102 к винил/эндоциклическому диену, что дает два изомера гидроксиальдегидхлоринового типа. Второй тип фотопродукта возникает в результате циклоприсоединения !02 к одной либо обеим из двух винильных групп. Эта реакция может привести к трем возможным фотопродуктам с винильными группами, замещенными формильными группами в одной либо обеих из двух позиций. Спектры поглощения формилпроизводных протопорфирина IX сходны с протопорфириновым, но несколько сдвинуты в более длинноволновую область. В растворителях выход формилпорфириновых продуктов много ниже выхода хлориновых. Однако, по некоторым данным они преобладают в таких структурах, как липосомы и мицеллы (Gudgin Dickson and Pottier, 1995).
Литературные данные свидетельствуют о том, что фотовыцветание протопорфирина IX в клетках зависимо от кислорода (Moan et al. 1997; Georgakoudi and Foster 1998; Robinson et al., 1998; Sorensen et al., 1998). Кривые снижения интенсивности флуоресценции эндогенного протопорфирина IX описываются кинетикой смешанного порядка (Moan et al., 1997; Loschenov et al., 1999) что, подразумевает участие в фотовыцветании флуоресценции различных механизмов.
Предполагается, что фотоиндуцированное уменьшение интенсивности флуоресценции фотосенсибилизатора, наблюдаемое после облучения клеток, обусловлено несколькими процессами. Падение интенсивности флуоресценции может отражать фотовыцветание порфиринов, снижающее их концентрацию в клетках и проявляющееся в соответствующем уменьшении поглощения ими видимого света в результате фотоиндуцированного разрыва порфиринового хромофора (Moan, 1986; Rotomskis et al., 1997). Снижение интенсивности флуоресценции может быть также следствием образования сохраняющих неповрежденный хромофор нефлуоресцирующих и/или флуоресцирующих отлично от исходного соединения фотопродуктов (Moan and Bagdonas, 1999; Bagdonas et al., 2000) либо агрегатов (Bezdetnaya et al., 1996; Strauss, 1998), или изменения внутриклеточного микроокружения (Moan et al., 1997), что влияет на квантовый выход и спектр флуоресценции порфирина (Brun and Sandberg, 1988; Robinson et al., 1998).
Биосинтез порфиринов
Исследование фотолабильности разных фракций эндогенного протопорфирина IX проводили путем измерения интенсивности его флуоресценции при 635 нм и 625 нм в процессе облучения клеток с соответствующими основными максимумами флуоресценции. В обоих случаях с ростом дозы видимого света мы наблюдали уменьшение интенсивности флуоресценции протопорфирина IX, причем фотовыцветание коротковолновой флуоресценции происходило при больших дозах света, чем длинноволновой (Д6254о/Д63540 =2,73±0,25, где Д4о - доза, приводящая к 40% фотовыцветанию флуоресценции)(рис. 12).
Другое отличие фотовыцветания флуоресценции двух фракций протопорфирина IX состоит в том, что фотовыцветание длинноволновой, но не коротковолновой, флуоресценции сопровождалось появлением нового максимума при 675 нм (рис. 13). Согласно литературными данным (Gudgin Dickson and Pottier, 1995; Robinson et al., 1998; Bagdonas et al., 2000) такой флуоресценцией обладает фотопродукт протопорфирина IX гидроксиальдегидхлоринового типа, образующийся в результате окисления синглетным кислородом нехромофорных винильных групп самой молекулы протопорфирина IX. Действительно, нами показано, что в присутствии тушителя синглетного кислорода азида натрия появления нового максимума -.о 100 625 нм 635 нм
Динамика падения интенсивности флуоресценции ( возб.=405 нм) при 625 и 635 нм в процессе облучения видимым светом (400-600 нм) клеток S.serevisiae, выращенных в присутствии 0,2 мМ 2,2 -дипиридила в условиях повышенной аэрации или гипоксии соответственно. Интенсивность флуоресценции нормирована к исходному уровню интенсивности, принятому за 100%.
Спектры флуоресценции ( возб.=405 нм) клеток S.cerevisiae, выращенных в присутствии 0,2 мМ 2,2 -дипиридила в условиях повышенной аэрации (а) или гипоксии (б), до (1) и после (2, 3) их облучения видимым светом (0,72 Дж/см2); 3-в присутствии 10 мМ азида натрия. при 675 нм не происходило (рис. 13). Вместе с тем азид натрия не полностью предотвращал фото выцветание флуоресценции протопорфирина IX при 635 нм (рис. 13). Это может указывать на то, что образование фотопродукта не является единственным механизмом фотовыцветания длинноволновой флуоресценции протопорфирина IX. Поскольку мы установили, что антиоксидант пропилгаллат, ингибирующий реакции перекисного окисления липидов (Gutteridge and Smith, 1988), значительно (в 1,66±0,10 раза при дозе видимого света 0,36 Дж/см2) снижает эффективность фотовыцветания длинноволновой флуоресценции клеток, можно предполагать участие в нем процессов перекисного фотоокисления липидов (ПФОЛ). В частности, возможна химическая модификация протопорфирина IX в результате его взаимодействия с продуктами ПФОЛ.
Особенности фотовыцветания коротковолновой флуоресценции протопорфирина IX (при 625 нм) можно объяснить исходя из предположения о его связи с белками (см. выше). Так, одной из вероятных причин относительно высокой фотоустойчивости этой фракции протопорфирина IX и отсутствия фотопродукта при выцветании его флуоресценции представляется более эффективный перехват 02 белковыми молекулами, чем протопорфирином IX (Красновский (мл.), 1998). Это может значительно снизить интенсивность фотоокисления молекулы сенсибилизатора и, соответственно, вклад этого процесса в фото выцветание его флуоресценции, а также уменьшить вероятность появления его окисленного фотопродукта.
При фотодинамическом повреждении белков происходит, в частности, окисление их SH-групп (van Steveninck et al, 1985; Silvester et al., 1998), эффективность которого снижается в присутствии дитиотреитола (Ricchelli et al., 1999). Нами установлено, что фотовыцветание коротковолновой (в отличие от длинноволновой) флуоресценции эндогенного протопорфиринаІХ (0,36 Дж/см2) в присутствии дитиотреитола, к уровню интенсивности флуоресценции клеток, облученных без него. при добавлении к клеткам дитиотреитола существенно менее эффективно (рис. 14). Это позволяет предполагать, что фотовыцветание коротковолновой флуоресценции протопорфирина IX может быть опосредовано фотоокислением SH-групп белков. В таком случае возможен отрыв протопорфирина IX от белковой молекулы (Moan, 1986; Brun and Sandberg, 1988; Moan and Berg, 1991; Moan et al., 1997), сопровождаемый образованием в полярной среде его агрегатов, имеющих низкий квантовый выход флуоресценции (Ricchelli, 1995).
В связи с тем что при облучении клеток дрожжей происходит интенсивное выцветание флуоресценции протопорфирина IX, возникает вопрос о том, как оно влияет на процессы их фотоинактивации. Так, в литературе дискутируется вопрос о взаимосвязи процессов фотовыцветания флуоресценции и фотоповреждений, индуцированных сенсибилизатором, и о возможности предсказания эффективности фотодинамической инактивации клеток по динамике выцветания флуоресценции сенсибилизатора. С одной стороны, выцветание флуоресценции сенсибилизатора во время облучения может отражать потерю его фотодинамической активности и приводить к снижению повреждающего действия (Moan, 1986; van der Meulen et al., 1997). Робинсон с соавт. (Robinson et al. 1998, 1999), однако, считают, что быстрое фотовыцветание сенсибилизатора предполагает существование повышенной продукции !02 (или других АФК), опосредующего повреждения биологических структур и, таким образом, может являться показателем эффективной фотодинамической инактивации.
Поскольку исследование фотовыцветания флуоресценции проводилось нами с использованием пасты, а фотоинактивации - суспензии клеток, сравнение дозовых зависимостей соответствующих эффектов было бы некорректно. В то же время, среди факторов, которые могли бы повлиять на изменение динамики фотовыцветания флуоресценции, измеренной на пасте клеток, - только ее недостаточная аэрация по сравнению с аэрацией клеточной суспензии при ее облучении. Однако, недостаточность снабжения кислородом может лишь снизить скорость фотовыцветания. Следовательно, можно считать, что скорость фотовыцветания флуоресценции клеточной суспензии, по крайней мере, не ниже скорости выцветания флуоресценции пасты клеток.
Фотовыцветание эндогенного протопорфирина IX
Определение содержания протопорфирина IX в изолированных из дрожжей, преинкубированных с хелатором, плазматических мембранах показало, что в них происходит некоторое - в 1,8 раза - увеличение уровня фотосенсибилизатора по сравнению с контролем (рис. 16). Накопление протопорфирина IX в плазматических мембранах сопровождается интенсификацией в них ПФОЛ (рис. 16). Фотоокислительные деструктивные процессы вызывают нарушение целостности плазматических мембран дрожжей, о чем свидетельствуют полученные нами данные об увеличении их проницаемости для флуоресцирующего красителя примулина (рис. 18). Столь значительным фотоповреждениям плазматической мембраны предшествуют такие потенциально летальные для клетки события, как повышение ионной проницаемости, ингибирование функций транспортных систем (Kessel and Schulz, 1990; Brim and Sandberg, 1991; Ramstad et al, 1997).
Следует отметить, что определенный вклад в фотодинамическое повреждение митохондрий и плазматических мембран, помимо протопорфирина IX, возможно, вносят порфириновое соединение, флуоресцирующее около 675 нм, и Zn-протопорфирин IX. Сравнимых данных о квантовом выходе синглетного кислорода in vivo для разных порфиринов в литературе нет. Измерения in vitro в разных средах и разными методами приводят к различным результатам. Известно, что наличие в соединении центрального иона металла-парамагнетика снижает эффективность генерации фотосенсибилизатором Ю2 (Ochsner., 1997). В то же время данные Фернандес с соавт. (Fernandez et al, 1997) показывают даже больший квантовый выход
Индуцированное видимым светом увеличение проницаемости плазматических мембран дрожжей S.cerevisiae, выращенных без (1) или в присутствии 0,2 мМ 2,2 -дипиридила (2), для флуоресцирующего красителя примулина (0,5 мМ). генерации l02 Zn-протопорфирином IX, чем протопорфирином IX (0,91 против 0,56), так что в принципе нельзя исключать его активность в качестве фотосенсибилизатора.
Чтобы проверить, не затрагивается ли в процессе облучения клеток S.cerevisiae генетический аппарат, мы использовали мутанты этих дрожжей, дефицитные по двум системам репарации ДНК: пострепликативной рекомбинационной репарации (rad 52), чувствительные к образованию разрывов цепи ДНК (Lisby et al., 2001), и эксцизионной репарации нуклеотидов (rad 3) (Bailis et al., 1995). Как известно, индуцированные активными формами кислорода повреждения ДНК дрожжей включают апуриновые/апиримидиновые участки и разрывы цепи (Swanson et al., 1999; Vance et al., 2001), возникающие в ходе эксцизионной репарации окисленных оснований (Girard and Boiteux, 1997).
Как было установлено в предварительных экспериментах, клетки мутантных по репарации штаммов накапливают протопорфирин IX в той же концентрации, что и дикий штамм. Оказалось, что дрожжи, дефицитные по эксцизионной репарации нуклеотидов (rad 3), ферменты которой наиболее эффективно репарируют такие повреждения ДНК, как димеры и аддукты пиримидиновых оснований, по фоточувствительности практически не отличаются от дикого штамма (рис. 19), т.е. соответствующие повреждения ДНК, по-видимому, не образуются. В то же время дрожжи, дефицитные по пострепликативной рекомбинационной репарации (rad 52), значительно более чувствительны к повреждающему действию видимого света по сравнению с диким штаммом (рис. 19). Это может свидетельствовать о том, что фотоинактивация мутанта rad 52 с индуцированным накоплением протопорфирина IX происходит в результате повреждений ДНК, обычно репарируемых системой пострепликативной рекомбинационной репарации. 1.6- т
Фоточувствительность (ФЧ=1/Оз7) к инактивирующему действию видимого света клеток дикого (711a-adel) и мутантных по эксцизионной (rad 3) и пострепликативной рекомбинационной (rad 52) репарации ДНК штаммов S.cerevisiae, выращенных в присутствии 0,2 мМ 2,2 -дипиридила. D37 - доза видимого света, при которой выживаемость составляет 37%. Каков вклад этих повреждений в фотоинактивацию клеток дикого штамма, оценить трудно, однако следует отметить, что этот вклад может значительно возрастать в условиях энергетического истощения в результате фотоингибирования дыхания (см. выше), поскольку, как известно, процессы репарации ДНК энергозависимы (Solinger et al., 2001).
Помимо протопорфирина IX, локализованного в митохондриях, участие в фотодинамических реакциях может также принимать фракция протопорфирина IX, связанного с растворимыми белками (см. выше). С учетом высоких констант взаимодействия синглетного кислорода с белковыми молекулами (Красновский(мл.), 1998) в этом случае именно эти клеточные компоненты, среди которых могут быть цитоплазматические ферментные системы, в частности ферменты гликолиза и биосинтеза гема (Schoenfeld et al., 1994; Afonso et al., 1998), будут являться первичными мишенями фотодинамического действия протопорфирина IX. В условиях, когда в клетке присутствует как митохондриальный, так и связанный с растворимыми белками эндогенный протопорфирин IX, фотодинамическое действие этих двух фракций сенсибилизатора, возможно, вызывает синергические эффекты, например, за счет одновременного ингибирования митохондриалього дыхания и цитозольных ферментов, осуществляющих гликолиз, что приводит к энергетическому истощению клетки (Shevchuk et al., 1996).
Таким образом, не исключено, что фотодинамическая инактивация дрожжей с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX может быть следствием взаимодействия фотосенсибилизированных деструктивных реакций, протекающих в разных компартментах клетки.
