Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ЦЕПНОЕ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
1.1. Основные положения теории жидкофазного окисления углеводородов II
1.2. Перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот . 13
1.3. Перекисное окисление фосфолипидов 17
ГЛАВА 2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ТОКОФЕРОЛА 20
2.1. Роль токоферолов в поддержании структурно-функциональной устойчивости биологических мембран 23
2.2. Основные механизмы молекулярного действия токоферола в биологических мембранах 26
2.3. Локализация о(-токоферола в мембране 36
ГЛАВА 3. ЭСТАФЕТНЫЙ МЕХАНИЗМ ПЕРЕДАЧИ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В МЕМБРАННЫХ СИСТЕМАХ .40
3.1. Особенности структурной организации бислойной структуры мембран:
3.1.1. Мембраны - плотно-упакованные системы с высокой локальной концентрацией С-Н-групп 41
3.1.2. Расположение "зоны" двойных связей в бислое 42
3.1.3. Изменение степени упорядоченности бислоя в вертикальном направлении; гетерогенность мембран в латеральном направлении 43
3.2. Эстафетная передача свободных радикалов в мембранных системах 47
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Выделение суммарных липидов мозга крупного рогатого скота 56
4.2. Выделение яичного лецитина 56
4.3. Выделение микросомальной фракции печени крыс 58
4.4. Гидрогенизация яичного лецитина и контроль жирно-кислотного состава 59
4.5. Приготовление пленок и липосом из липида 60
4.6. Модификация мембран липосом, микросом, а также ли-пидных пленок 63
4.7. Очистка препаратов токоферола и фосфатидилионола. 65
4.8. Определение количества токоферола в пробе 68
4.9. Омыление липидов 68
4.10. Инициирование перекисного окисления липидов .68
4.11. Измерение скорости окисления липидов 69
4.12. Калориметрические измерения 69
4.13. Низкотемпературная ЭПР и оптическая спектроскопия 69
4.14. Использование метода остановленной струи для изучения кинетики восстановления ДЖІГ токоферолом и фосфатидилионолом 70
4.15. Определение электрических свойств плоской бислойной мембраны 71
4.16. Статистическая обработка результатов 71
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ НЕ СОДЕРЖАЩИХ КИСЛОРОДА ЛИПИДНЫХ РАДИКАЛОВ В РАЗВИТИИ И ИНГИБИРОВАНИИ ПОЛ В МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАННЫХ СИСТЕМАХ
5.1. Исследование поведения свободно-радикальных центров в замороженных мембранных системах методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии 73
5.2. Изучение роли не содержащих кислорода липидных радикалов в развитии ПОЛ в модельных мембранах при комнатных температурах 79
5.3. Исследование передачи свободно-радикальных центров от молекулы липида на молекулу Л-токоферола 82
5.4. Изучение изотопного замещения в реакциях свободно-радикального превращения -токоферола 102
ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ ФЕНОЛЬНОГО ТИПА СО СЛ0ЖН0-ЭШИРН0Й ГРУППИРОВКОЙ В БОКОВОЙ УГЛЕВОДОРОДНОЙ ЦЕПИ НА ПРИМЕРЕ ФОСФАТИДИЛИОНОЛОВ 109
6.1. Изучение электрон-донорных свойств фосфатидилионолов в реакции одноэлектронного восстановления
6.2. Изучение АО активности фосфатидилионолов, ионола и токоферола в модельных системах:
6.2.1. Термоокисление спиртового раствора яичного лецитина. 112
6.2.2. Термоокисление модельных мембранных систем 114
6.2.3. Ге2+-аскорбат-индуцированное ПОЛ в однослойных ли-посомах из яичного лецитина .120
6.3. Изучение антиокислительной активности фосфатидилионола, модели I и с-токоферола в биологических мембранах 123
ГЛАВА 7. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРТУРБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ИОНОЛА И Ш0СШАТИДИЛИ0Н0ЛА НА ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЛМ 127
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 134
ВЫВОДЫ 139
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 140
- Основные положения теории жидкофазного окисления углеводородов
- Роль токоферолов в поддержании структурно-функциональной устойчивости биологических мембран
- Особенности структурной организации бислойной структуры мембран:
- Выделение суммарных липидов мозга крупного рогатого скота
- Исследование поведения свободно-радикальных центров в замороженных мембранных системах методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии
Введение к работе
Перекисное окисление липидов /ПОЛ/ представляет один из важнейших универсальных процессов повреждения мембранных систем, проявляющийся как в сравнительно простых искусственных системах, так и в многообразных мембранных образованиях живых организмов (Гарусов, 1962; Владимиров, Арчаков, 1972; Козлов, Данилов и др., 1972; Бур-лакова и др., 1975; Logani, Davis, 1980). ПОЛ затрагивает важнейшие физико-химические свойства мембран - проницаемость, вязкость, фазовое состояние и вызывает нарушения, обусловленные искажением белок-липидных взаимодействий в мембранах, приводящие к повреждению мембранно-связанных и растворимых ферментных систем продуктами окислительной деградации липидов. Все эти проявления ПОЛ играют важную роль в формировании многих патологических процессов, возникающих в живых организмах при неблагоприятных условиях и повреждающих воздействиях. В связи с этим молекулярные механизмы процессов ПОЛ представляют значительный интерес, в частности, в связи с разработкой эффективных приемов регуляции этих процессов в искусственных и биологических мембранах.
Значительная роль в поддержании структурно-функциональной целостности мембран принадлежит токоферолам. Нарушение содержания о(-токоферола приводит к широкому спектру патологических состояний, которые несмотря на их разнообразие, по-видимому, обусловлены одной основной причиной - структурно-функциональными нарушениями мембранных образований клетки. Одной из наиболее общепризнанных гипотез биологического действия d-токоферола является гипотеза Таппеля о том, что ^-токоферол /ТФ/ функционирует в качестве антиоксидан-та, инактивируя свободные липидные радикалы (їарреї, 1972). Согласно жидко-фазным представлениям в качестве этих радикалов высту- пают перекисные липидные радикалы, ведущие процесс окисления и локализованные в глубине углеводородной зоны бислоя. Эти представления оказались полезными для интерпретации широкого KDyra явлений, протекающих в биологических мембранах при ПОЛ, а также при разработке принципов регулирования этого процесса в биологических и модельных системах (Владимиров, Арчаков, 1972; Бурлакова и др., I975;Logani, Davis, 1980).
Однако с этих позиций трудно найти надежные ответы, например, на следующие вопросы:
Почему в отличие от предсказаний теории в эксперименте наблюдается четко выраженная зависимость скорости ПОЛ от парциального давления кислорода, в искусственных и биологических мембранах? (Владимиров, Арчаков, 1972; Dirks et.al., 1982)?
Жидкофазная теория связывает ингибирующее действие антиоксидан-тов ІпН с реакцией Ж)г>* + 1пН — ROOH + In". Согласно этой реакции в течение индукционного периода при ингибированном ПОЛ следует ожидать образования гидроперекисей в количествах, эквивалентных израсходованному антиоксиданту. В действительности даже в течение длительного периода торможения окисления липидов в мембранах, когда расходуются значительные количества ингибитора, накопления гидроперекисей липидов либо вообще не удается обнаружить, либо обнаруживаемые количества слишком малы ( Lips, 1957; Bieri, Andersin, I960)?
3. Почему в мембранных системах эффективное ингибирующее действие оказывают соединения, погруженные лишь своими боковыми цепями в углеводородную область мембраны? К таким соединениям относятся токоферолы. Активные группировки этих молекул расположены вблизи поверхности мембраны в районе фосфолипидных головок (Pragata, Bellemare, 1980; Srivastava et.al.,1983). Неясно, каким образом в этом случае достигается взаимодействие ОН-груп-пы хроманового кольца ТФ с перекисными липидными радикалами, возникающими в толще углеводородной зоны мембраны. Возможность объяснить все эти факты появилась в связи с высказанными в литературе (Иванов, 1981, 1982, 1984) предположениями, что в процессах развития и ингибирования ПОЛ принимают участие не содержащие кислорода липидные радикалы R*, способные быстро эстафетным путем перемещаться по углеводородной зоне в энергетически более выгодные положения.
В свете этих представлений молекулярный механизм антиокислительного действия токоферола в мембранных системах может быть рассмотрен как следующий многоступенчатый процесс: I. эстафетная передача не содержащего кислород свободно-радикального центра от молекулы липида на боковую углеводородную цепь молекулы ингибитора, 2. эстафетная передача активного центра по углеводородной цепи ТФ /выход активного центра из углеводородной зоны/, S. реорганизация активного центра в полярной части молекулы антиоксиданта с образованием малоактивного радикала ингибитора и конечных продуктов окислительной деградации.
В связи с этим целью настоящей работы явилась экспериментальная проверка возможности реализации эстафетного механизма АО действия ТФ в мембранных структурах, а именно: изучение роли не содержащих кислорода липидных радикалов /оценка участия реакций внутри- и меж-молекулярной эстафетной передачи свободных радикалов в мембранных системах/ при перекисном окислении липидов и при ингибирова-нии этого процесса ТШ-ом, а также оценка роли боковой углеводородной цепиоі-ТШ в механизме его антиокислительного действия.
Показано, что в процессах развития ПОЛ в липосомах из яичного лецитина при комнатных температурах, важную роль играют не содержащие кислорода липидные радикалы. Методом низкотемпературной ЭПР спектроскопиии мембранных систем после УФ-, Х- и S -облучения при 77 К с последующим их размораживанием в темноте зарегистрировано сужение сигнала ЭПР в диапазоне температур 123*153 К при сохранении количества радикальных центров. Эффект сужения сигнала объясняется, исходя из внутримолекулярной эстафетной передачи свободно-радикальных центров /СР/ в углеводородной зоне бислоя. Приводятся доказательства в пользу последующей'/при t> 153 К/ гибели СР центров /рекомбинации/ за счет их подвижности по механизмам межмолекулярной эстафетной передачи. В мембранах липосом, модифицированных ТФ--ом, в тех же условиях регистрировали трансформацию липидного сигнала ЭПР в сигнал свободного радикала ТФ. Форма ЭПР спектров этого радикала, особенности его поведения при размораживании, а также низкотемпературные спектры поглощения свидетельствуют, что структура свободного радикала «^ -ТФ, возникающего в процессах, сенсибилизированных ненасыщенными липидами, отличается от структуры хромаксильного радикала ТФ /ХРТ/. При относительно высоких температурах / i> 228 К/ сенсибилизированный свободный радикал и-ТФ изо-меризуется в ХРТ. Методом изотопного замещения показано, что антиокислительное действие ТФ сопровождается включением трития в углеводородный скелет окисленной молекулы ингибитора. В реакции взаимодействия ТФ с ДФПГ подобного изотопного замещения не наблюдалось. На примере фосфатидилионолов изучены физико-химические свойства соединений с "изолирующей" сложно-эфирной группировкой в боковой цепи. Показано, что в мембранных структурах антиокислительное действие этих соединений не менее, чем на порядок уступает - 9 -активности ионола, хотя в реакции с ДФПГ или при "гомогенном" окислении их свойства близки. Обнаружено, что ионол в отличие от фосфатидилионола индуцирует появление токовых флуктуации в БЛМ. Совокупность полученных результатов интерпретируются в свете эстафетной передачи свободной валентности из углеводородных цепей ли-пидов в полярную часть молекулы ТФ, функциональной целесообразности локализации активной хромановой группировки d -ТФ на поверхности углеводородной зоны мембран и отсутствия сложно-эфирной группировки в боковой цепи этого антиоксиданта.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГПСС - гидроперекиси.', с системой сопряженных двойных связей. ПОЛ - перекисное окисление липидов. ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты. ЖК - жирные кислоты. НЖК - ненасыщенные жирные кислоты. О2 - синглетный кислород. УФ - ультрафиолет. ТБК - тиобарбитуровая кислота, ТХУ - трихлоруксусная кислота. МДА - малоновый диальдегид. ГЖХ - газожидкостная хроматография. ТФ - токоферол. ТФ-п-хинон - токоферилхинон. И - ионол. Ш - фосфатидилионол. АО /активность/ - антиокислительная. Ор - супероксид-анион-радикал. ОН' - гидроксильный радикал. Тп - температура фазового перехода. УВ - углеводородные /цепи/. РР - пирофосфат.
СР - свободно-радикальные /центры/. ФХ - фосфатидилхолин. МС - микросомы. - II -
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Основные положения теории жидкофазного окисления углеводородов
Современная теория жидкофазного окисления углеводородородов и жиров, основанная на представлениях о цепных разветвленных реакциях (Семенов, 1934), изложена в цикле работ академика Н.М.Эмануэля (Эмануэль, Лясковская, 1961; Эмануэль и др., 1965; Эмануэль и др., 1973). Общая схема этого процесса описывается последовательностью основных элементарных реакций:
0. RH — R к0 - зарождение цепи
1. R + 0g — - R0A кj -іпродолжение цепи
2. Щ + RH — - ROOH + R к2 - J
3. ROOH —=- RO + OH Kg - вырожденное разветвление
4. R. + R- __ молекулярные _ обрыв
продукты I
5. R + ROA — Kg - ] цепей
6. RO + ROA — - к6 - .
7. ROA + InH — ROOH + In KIJ, - ингибирование, где RH и R" - молекула углеводорода и ее свободный радикал; ROA - перекисный свободный радикал; ROOH--.гидроперекись, InH и In - ингибитор и его свободный радикал; к , Ку ... - константы скоростей соответствующих реакций.
Поскольку концентрация кислорода в жидкофазных системах обычно достаточно велика, а реакция I протекает с высокой скоростью8 -Т Т /Кт Ю -10 М с /, присутствием радикалов R в системе пренебрегают, полагая, что ]R j .ТвОЛІ. Отсюда следует, что перекисный радикал является важнейшим в этой системе: только он участвует в реакции продолжения цепи /реакция 2/, взаимодействует с ингибитором /реакция 7/ и участвует в реакциях обрыва цепей /реакция 6/. В этих условиях эффективность антиоксидантов характеризуется параметром Й: где tt/- скорость реакции зарождения цепей. Образующийся радикал ингибитора In /реакция 7/ обычно малоактивен и не способен продолжать цепной процесс. В отсутствие ингибиторов скорость процесса жидкофазного окисления углеводородов (//определяется выражением:
Из этого выражения следует, что когда концентрация кислорода в сис-теме не очень мала/выше 10 М/, то есть когда выполняется условие [R J ; [ROoj (Васильев, Вичутинский, 1962 а и б; Эмануэль и др., 1973, 1975) скорость процесса окисления.не зависит от концентрации кислорода.
Эти представления используются для описания процессов окисления липидов в искусственных и биологических мембранах, составляя основу жидкофазной теории перекисного окисления липидов /ПОЛ/ в биологических мембранных системах ( Владимиров, Арчаков, 1972; Козлов, Данилов, 1972; Бурлакова и др., 1975). Применение теории жидкофазного окисления оказалось полезным для интерпретации широкого круга явлений, протекающих в биологических мембранах при ЮЛ, а также при изучении принципов регулирования этого процесса.
Роль токоферолов в поддержании структурно-функциональной устойчивости биологических мембран
Функциональной устойчивости биологических мембран. Среди обширного числа соединений, чьи функции тем или иным способом в организме связаны с поддержанием структурно-функциональной стабильности биомембран, видное место занимают токоферолы. В организме птиц и млекопитающих встречается в основном d-токоферол /5,7,8-триметилтокол/ (Aaes-Yorgensen,I962). После введения крысам С-ТФ per os наибольшая активность наблюдается в селезенке и надпочечниках, в микросомах и митохондриях печени (Mellors,Barnes 1966 ), а некоторое количество С-ТФ метки, связанной с цитозолом печени может быть обусловлено его адсорбцией ТФ-переносящими белками (catignani, 1975; Catignani, Bierri,I977 ), либо неспецифической сорбцией другими белками. При недостатке ТШ в организме проявляется обширный спектр патологических изменений, связанных с нарушением структурно-функциональной целостности мембран. ТФ оказался эффективным средством, предотвращающим многие нежелательные симптомы, возникающие в клетках при неблагоприятных условиях, сопровождающихся повреждением мембранного аппарата ( Иванов, 1977 ). Токоферолы снижают повышенную чувствительность эритроцитов "Е-дефицитных" животных к действию гемолитических агентов - диалуровой кислоты, перекиси водорода, аскорбата, перекиси НЖК, ретинола (Tsen, Collier, I960; Heikkila е.а., 1971; Stocks,Dormandy, 1971; Shimasaki, Privett, 1975; lino, Sigita, 1978). При этом действие гемолитиков основано на реакциях окисления, вызывающих генерацию свободных радикалов и инициирование ПОЛ эритроцитов, так как во-первых, гемолитический эффект усиливается прооксидантами - диалуровой кислотой, хлорамином и олеиновой кислотой (Lucy,Ding I964 ); во-вторых, степень гемолиза зависит от жирнокислотного состава эритроцитов и увеличивается при увеличении степени ненасыщенности НЖК (Bierri, Poukka, 1970 ; в-третьих, гемолитики вызывают интенсивное накопление ТБК-активных продуктов, уровень которых коррелирует с кинетикой гемолиза (stocks,Dormandy, 1971); в-четвертых гемолизирующие агенты вызывают уменьшение количества НЖК и деградацию эритроцитарных фос-фолипидов (Jakob et.al.,1967 . Инкубация ТФ с отмытыми эритроцитами приводила к защитному эффекту пропорционально их Е-витамин-ной активности (Rose,Grygory, 1952). «t—ТФ влияет и на развитие ШО липидов мембран эритроцитов под действием УФ-облучения. В работе (Roshchupkin е.а., 1975)показано, что введение ТФ в эритроциты до облучения приводит к уменьшению скорости ПФО НЖК в эритроцитах, облучаемых при 254 нм. Облучение УФ "313 нм" или "365 нм" не приводило к образованию ТБК-активных продуктов ПОЛ или регистрируемого гемолиза эритроцитов в течение 24 часов после облучения. В работе (Пеленицын и др., 1975) на эритроцитах при УФ-облучении также показано, что ТФ препятствует фотоокислению мембранных липидов. Снижение АО активности ТФ при торможении ПФО /освещение УФ с Х 350 нм/ по сравнению с системами автоокисления липидов связано с эффектами прямого фотолиза молекулы ТФ (Roshchupkin е.а., 1975; Лордкипанидзе и др., 1978; Лордкипанидзе, 1981; Рощупкин, Лордки-панидзе, 1983). Особенно выражена АОА Л-ТФ при торможении темново-го ПОЛ мембран эритроцитов после УФ-облучения /254 нм/ (Пеленицын, 1975).
Особенности структурной организации бислойной структуры мембран
В последнее время в литературе обсуждается вопрос о том, что своеобразие молекулярной организации мембранных систем /мембраны рассматриваются как плотно-упакованные системы/ может влиять на специфику протекания в них свободно-радикальных окислительных процессов ( Иванов, 1981, 1984). А именно, что в целом окислительные процессы в мембранах имеют много общего с процессами окисления твердых полимеров.
В связи с этим в данном разделе рассмотрим особенности молекулярной организации мембранных систем на примере бислойных структур моно-и мульти- ламеллярных липидных дисперсий - модельных систем, которые используются в экспериментальной части данной работы при изучении молекулярных механизмов АО действия ТФ в мембранных структурах.
В зависимости от температуры, количества адсорбированной воды и ЖК состава, фосфолипиды образуют упорядоченные структуры /ламелляр-ные, мицеллярные, гелевые и гексагональные/ (Финеан, 1970; Williams Chapman, 1970).
В целом для описания УВ области бислоя может быть использовано приближение "метиленового газа".(Ивков, Берестовский, 1981). В экспериментах работы Филлипса (Phillips, 1972) была показана линейная зависимость энтропии "плавления" углеводородных /УВ/ цепей от числа звеньев. Линейная зависимость приращения энтропии от объема означает, что характер распределения системы по состояниям не зависит от длины цепей. Подобная ситуация аналогична ситуации в газе, где линейное возрастание массы газа при -прочих равных условиях, приводит к линейному возрастанию энтропии. То есть увеличение УВ области за счет удлинения цепи эквивалентно добавлению соответствующего числа как бы независимых метиленовых звеньев, каждое из которых с определенной вероятностью может находиться в транс- и гош- состояниях. Получается, что межмолекулярные взаимодействия между звеньями цепей соизмеримы с внутримолекулярными, и в результате звенья ведут себя так, будто они вообще не взаимодействуют /"метиленовый газ"/, а взаимодействие выражается в повышении энергетического уровня гош-сос-тояния. Таким образом, несмотря на малые размеры бислоя, его УВ область можно рассматривать как фазу, состоящую из ансамбля CHg-групп, причем расстояния между соседними ЖК цепями того же порядка что и длина С-С связи в самой УВ цепи.
Выделение суммарных липидов мозга крупного рогатого скота
Общую фракцию липидов экстрагировали из мозга крупного рогатого скота по методу Фолча . (Polch et.al., 1957); предварительно отгомо-генизировав препарат мозга, добавляли к нему 8-10-кратный объем смеси хлороформ:метанол 2:1 /V/V /, Экстракцию проводили на качалке 30 мин., затем добавляли 1/5 часть воды до расслоения. После центрифугирования /8 тыс.а , 10 мин./ отбирали хлороформенную фазу, содержащую общие липиды, и выпаривали ее досуха. Затем препарат переводили в толуол и, продув аргоном, запаивали в ампулы.
4.2. Выделение яичного лецитина.
В работе был использован лецитин из желтка куриных яиц, выделенный по методу Пангборна ( Pangbom, 1951), модифицированному- в нашей лаборатории Кауровым СКауров, 1975) - осаждением фосфатидилхо-лина /Ш./ из суммарных фосфолипидов в виде ШХ-кадмиевого комплекса. Перед выделением необходимые растворители очищали перегонкой. 12 желтков встряхивали в литровом стакане с 400 мл ацетона, затем фильтровали на воронке Бюхнера. Процедуру повторяли 3 раза. Практически белый осадок подсушивали на фильтровальной бумаге до порошкообразного состояния. Суммарные липиды экстрагировали, встряхивая сухой осадок с 800 мл 96% этанола в течение 30 минут в литровой колбе с притертой пробкой на качалке при комнатной температуре. Экстракт отделяли от осадка центрифугированием при 600а в течение 10 минут, сливали в литровый стакан и добавляли при помешивании 15 мл 50% cdCIp. Осаждение ШХ-кадмиевого комплекса проводили при 5-7 в течение часа. Осадок отделяли центрифугированием с охлаждением, затем промывали его несколько раз ацетоном. Сухой осадок растворяли в 100 мл хлороформа, и к образовавшемуся слегка мутному раствору при постоянном перемешивании добавляли 700 мл этанола, содержащего 10 мл 50% CdCIg в Н О. Смесь выдерживали 10 мин. при комнатной температуре, затем повторяли предыдущую операцию, увеличив время кристаллизации до получаса при комнатной температуре. После 3-х осаждений осадок /лецитин-кадмиевый комплекс/ суспендировали в 150 мл петролейного эфира /40-70/, переносили в делительную воронку на I л и добавляли 500 мл 80% этанола, насыщенного петролейным эфиром и содержащего 0,1% СДСІ /80% спиртовая смесь/. Ее приготовление: встряхивали в делительной воронке 80% этанол с 0,1% CdCI и с петролейным эфиром, затем отбирали нижний слой. Содержимое воронки встряхивали до полного растворения. Затем разделяли фазы и отбирали спиртовой экстракт. Петролейную фракцию дополнительно промывали 200 мл 80% спиртовой смесью. Объединенные спиртовые фракции выпаривали на роторном испарителе.до 2/3 объема, оставляли на ночь при +5. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 10 тыс.О 15 минут. /+5/. Для освобождения от Cd + осадок растворяли в 150 мл хлороформа и встряхивали 5 мин. с равным объемом 30% этанола. Cd переходит в разбавленный спирт. Процедуру повторяли 6-7 раз, отбрасывая спиртовую фракцию. Хлороформенный раствор лецитина упаривали досуха, промывали -ацетоном для более полного удаления хлороформа и снова выпаривали. Лецитин растворяли в 100 мл безводного этилового эфира и оставляли на ночь при 3-6. Выпавший осадок отделяли на центрифуге при 10 тыс.а 15 минут при температуре 4. Отбирали супернатант, упаривали досуха его, липидную пленку раст - 58 воряли в этаноле и ампулировали, предварительно продув их аргоном. Выход яичного лецитина 5-7 г.
Исследование поведения свободно-радикальных центров в замороженных мембранных системах методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии
Эстафетная модель антиокислительного /АО/ действия ТФ в мембранных системах предусматривает взаимодействие молекулы ингибитора сне содержащими кислорода липидными радикалами. В связи с этим решалась задача получения экспериментальных доказательств участия не содержащих кислорода липидных радикалов в развитии ПОЛ, а также реализации механизма эстафетной передачи свободно-радикальных /СР/ центров на базе изучения их поведения в замороженных мембранных структурах при постепенном отогревании.
В качестве инициирующих воздействий, вызывающих появление СР в системе, использовали:
1. рентгеновское облучение,
2. УФ-фотолиз липидов, сенсибилизированных продуктами окисления /предварительное термоокисление при 90С, 2 часа/,
3. У-облучение.
УФ-облучение многослойных липосом, сухих липидных пленок из яичного лецитина или суммарных липидов мозга крупного рогатого скота при 77 или 103 К приводит к появлению радикалов, характеризуемых достаточно близкими по форме сигналами ЭПР /Рис.12/, аналогичными приведенным в работах (Исламов, Азизова и др., 1979; Gol danskii, Mikhailov et. al.,I98I; Исомов, 1982). Это сигналы сложной формы -/а-фактор 2,0059, ширина І30-І40 Гс/, которые являются суперпозицией ЭПР сигналов от нескольких парамагнитных центров ( Исламов, Азизова и др., 1979). Наиболее широкая компонента обусловлена сигналом от двух типов алкильных липидных радикалов, более узкий сигнал синглетной формы / дН 30-33 Гс/ - липидным радикалом полнено-вого типа -СН2"СН/-СН=СН/ -СН. В аналогичных условиях облучения количество радикальных центров быстрее возрастало в образцах, приготовленных из предварительно окисленных липидов. В образцах из гид-рогенизованного яичного лецитина1/не содержащего ненасыщенных двойных связей, и, соответственно, слабо поглощающего УФ/ при 77 К наблюдался очень слабый сигнал ЭПР. Эти результаты находятся в соответствии с известным фактом фотосенсибилизирующего действия системы сопряженных двойных связей гидроперекисей липидов при УФ-облуче-нии .(Потапенко, 1974; Roshchupkin е.а., 1975).
При отогревании в темноте образцов липосом и липидных пленок из яичного фосфатидилхолина /ФХ/ мы регистрировали "сужение" сигнала ЭПР в диапазоне температур 123-153 К, характеризуемое отношением высот Ц и ти, /Рис.13 А/. Эффект сужения сигнала ЭПР выражается в исчезновении широких составляющих от двух типов алкильных свободных радикалов. Экспериментально установлено, что общая концентрация радикальных центров в системе при этом остается постоянной /Рис.13 Б/, а форма ЭПР спектров изменяется, приближаясь к синглетной. Так как сужение спектров ЭПР не сопровождалось изменением количества радикалов в образце, оно было отождествлено с результатом действия механизма внутримолекулярной эстафетной передачи СР центров типа ал-кильный - аллильный. Подобные превращения радикалов алкильного типа в аллильные или полиеновые наблюдали в -облученных ненасыщенных углеводородах (Тупиков, Пшежецкий, 1964).
