Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Фотодинамическое действие света 9
1.1.1 Механизмы фотосенсибилизированных реакций 9
1.1.2 Гибель клеток при ФД воздействии 12
1.1.3 Фотодинамическая терапия 16
1.2 Глиальные клетки и нейроглиальные взаимодействия 18
1.2.1 Центральная нервная система 19
1.2.2 Периферическая нервная система 23
1.3 Межклеточная химическая сигнализация 25
1.3.1 Аденилатциклазный путь 26
1.3.2 Тирозинкиназный путь 28
2. Материалы и методы 32
2.1 Объект исследования 32
2.2 Регистрация импульсной активности рецептора растяжения 34
2.3 Фотодинамическое воздействие 36
2.3.1 Фотосенсибилизаторы и источники света 36
2.3.2 Общее и локальное фотодинамическое воздействие 39
2.4 Ингибирование импульсной активности нейрона 42
2.5 Модификация путей химической сигнализации 42
2.6 Флуоресцентно-микроскопическое исследование 43
2.6.1 Локализация фотосенсибилизаторов в изолированном механорецепторе 43
2.6.2 Определение типов и динамики гибели клеток 44
2.7 Статистическая обработка результатов 45
3. Результаты исследований 46
3.1. Спектральные характеристики фотосенсибилизаторов 46
3.2. Локализация фотосенсибилизаторов в изолированном механорецепторе 46
3.3. ФД воздействие Фотосенса 55
3.3.1. Реакция механорецепторного нейрона 55
3.3.2. Реакция глиальных клеток 59
3.4. ФД воздействие рибофлавина 66
3.4.1. Реакция механорецепторного нейрона 66
3.4.2. Реакция глиальных клеток 70
3.5. Роль нейрона в реакции глиальных клеток на ФД воздействие 71
3.5.1. Инактивация нейрона локальным интенсивным ФД воздействием 72
3.5.2. ФД-индуцированная гибель глиальных клеток в механорецепторе с инактивированным нейроном 76
3.6. О роли импульсной активности нейрона в выживаемости глиальных клеток 80
3.6.1. Роль функционального состояния нейрона в поддержании выживаемости глиальных клеток в изолированном механорецепторе 80
3.6.2. Роль импульсной активности нейрона в выживаемости фотосенсибилизированных глиальных клеток 81
3.7. Участие процессов сигнальной трансдукции в реакции нейрона и глиальных клеток на ФД воздействие 85
3.7.1. Роль аденилатциклазного сигнального пути 85
3.7.2. Роль тирозинкиназного сигнального пути 87
Выводы 106
- Глиальные клетки и нейроглиальные взаимодействия
- Регистрация импульсной активности рецептора растяжения
- Локализация фотосенсибилизаторов в изолированном механорецепторе
- Участие процессов сигнальной трансдукции в реакции нейрона и глиальных клеток на ФД воздействие
Введение к работе
Актуальность работы. Фотодинамический (ФД) эффект лежит в основе фотодинамической терапии (ФДТ), успешно применяемой в онкологии для разрушения злокачественных опухолей, в том числе опухолей головного мозга (Dougherty et al., 1998; Popovic et al., 1996; Friesen et al., 2002). Однако, в ходе ФДТ могут повреждаться и здоровые ткани, окружающие опухоль, включая периферические нервные элементы. Поэтому важно изучать реакции здоровых, неопухолевых клеток на ФД воздействие. Особую актуальность имеет исследование механизмов и закономерностей ФД воздействия на нейроны и глиальные клетки (ГК), поскольку утрата нервных клеток невосполнима, а для их нормального функционирования необходима поддержка окружающей глии (Николлс и др., 2003). Отдельные стороны ФД воздействия на нейроны исследованы сравнительно подробно (Pooler, Valenzeno, 1979; Wang-Bennett, 1990; Yoshida et al., 1992a; Uzdensky, Mironov, 1999; Uzdensky et al., 2000). Был проведен ряд исследований ФД воздействия на глиомы - злокачественные опухоли глиального происхождения (Muller, Wilson, 1990; Popovic et al., 1996; Madsen et al., 2003). Однако, изучению ФД воздействия на нормальные, неопухолевые глиальные клетки посвящены лишь единичные работы (Yoshida et al., 19926; Jou et al., 2002).
В последнее время появилось множество данных указывающих на тесное взаимодействие между нейронами и глиальными клетками (Coles, Abbott, 1996; Haydon, 2000). Несмотря на то, что многие аспекты нейроглиальных взаимодействий остаются невыясненными, известно, что при различных повреждающих воздействиях ГК способны поддерживать выживаемость нейронов, и наоборот - нейроны могут поддерживать выживаемость окружающей глии (Largo et al., 1996; Корр et al, 1997). Это может быть
существенным фактором, определяющим реакцию нейронов и ГК на ФД воздействие и ранее остававшимся без внимания исследователей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение фотодинамического повреждения нейронов и окружающих их глиальных клеток и выяснение роли происходящих при этом неироглиальных взаимодействий.
Основные задачи исследования заключались в следующем:
Изучить гибель нейронов и глиальных клеток при ФД воздействии.
Выяснить роль неироглиальных взаимодействий в выживаемости ГК.
Исследовать участие аденилатциклазного и тирозинкиназного сигнальных путей в реакциях нейронов и глиальных клеток на ФД воздействие.
Сравнить ФД эффективность разных фотосенсибилизаторов.
Научная новизна. Впервые изучено ФД воздействие на нормальные, неопухолевые глиальные клетки, поддерживающие естественные связи с нейронами. Установлено, что в фотосенсибилизированном механорецепторе речного рака сенсорный нейрон участвует в поддержании выживаемости окружающих ГК: избирательная инактивация нейрона усиливает ФД-индуцированный апоптоз глии. Показано, что импульсная активность нейрона не влияет на выживаемость ГК, тогда как ферменты аденилатциклазного и тирозинкиназного сигнальных путей участвуют в ФД-индуцированной инактивации механорецепторных нейронов и сателлитных ГК. Обнаружено, что следствием ФД воздействия является не только гибель глиальных клеток, но и глиоз - увеличение относительной численности ГК вокруг тела нейрона.
Практическая значимость. Данные о реакциях глиальных клеток на ФД воздействие могут учитываться при оптимизации методов ФДТ опухолей мозга и других онкологических заболеваний. Сведения о том, что фармакологические модуляторы ряда сигнальных ферментов усиливают или ослабляют ФД повреждение нейронов и ГК могут использоваться при
разработке методов повышения эффективности ФДТ или защиты здоровых нейронов и ГК. Материалы работы используются в учебном процессе при чтении курса лекций по фотобиологии на кафедре биофизики физического факультета РГУ. Результаты работы использованы при выполнении грантов РФФИ№ 02-04-48027 и 03-04-06101.
Основные положения, выносимые на защиту.
ФД воздействие вызывает гибель глиальных клеток, окружающих механорецепторный нейрон речного рака, в результате некроза или апоптоза; вместе с этим увеличивается численность глиальных клеток, окружающих тело фотоповрежденного нейрона.
Механорецепторный нейрон поддерживает выживаемость глиальных клеток при ФД воздействии: его избирательная инактивация усиливает ФД-индуцированный апоптоз глиальных клеток.
Импульсная активность нейрона не влияет на выживаемость ГК, тогда как ферменты аденилатциклазного и тирозинкиназного сигнальных путей участвуют в ФД-индуцированной инактивации механорецепторных нейронов и сателлитных ГК.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ряде всероссийских и международных конференций: 13і , 14і International Congress on Photobiology (San Francisco, 2000; Jeju, 2004); 3r European Biophysics Congress (Munich, 2000); VI, VII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Moscow-Pushchino, 2000; Kaliningrad, 2003); 29th-32nd Annual Meeting of the American Society for Photobiology (Chicago, 2001; Quebec, 2002; Baltimore, 2003; Seattle, 2004); 9th, 10th Congress of European Society for Photobiology (Lillehammer, 2001; Vienna, 2003); III Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); 10 Annual International Laser Physics Workshop (Moscow, 2001); Saratov Fall Meeting IV-V "Optical Technologies in Biophysics and Medicine" (Saratov, 2002,2003); IX International Conference "Laser Applications in Life Sciences" (Vilnius, 2002);
Международной конференции по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, 2002); VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease (Berlin, 2003). Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей в реферируемых журналах, 7 статей в сборниках и 19 тезисов.
Глиальные клетки и нейроглиальные взаимодействия
При ФДТ воздействию могут подвергаться не только опухолевые, но и нормальные клетки, в том числе элементы нервной системы - нейроны и окружающие их глиальные клетки. Поэтому важно изучать особенности реакций этих клеток на ФД воздействие. Отдельные стороны реакций нейронов на ФД воздействие довольно хорошо изучены (Pooler, 1972; Pooler, Valenzeno, 1979; Wang-Bennett, 1990; Yoshida et al., 1992, Uzdensky, 1996, 1997; Uzdensky, Mironov, 1999; Uzdensky et al., 2000, 2001, 2002; Bragin et al., 2002, 2003). Однако ФД воздействие на глиальные клетки, которые являются важным функциональным элементом нервной системы, практически не изучено. Существуют лишь единичные работы, посвященные ФД воздействию на нормальные неопухолевые ГК (Yoshida et al., 1992; Jou et al., 2002). Важность исследования ФД воздействия на ГК обусловлена еще и тем, что глиомы - опухоли мозга глиального происхождения - плохо поддаются традиционным методам лечения и ФД воздействие является перспективным методом их терапии (Muller, Wilson, 1990; Popovic et. al., 1996; Friesen et al., 2002). Число глиальных клеток, окружающих нейроны, по меньшей мере, в 10 раз больше, чем самих нейронов, а объем нейроглии составляет около половины всего объема нервной ткани. Термин глия (греч. "связующее") был впервые использован Вирховым для описания элементов нервной ткани, которые не имели характера нейронов (Николлс и др., 2003). 1.2.1 Центральная нервная система Глиальные клетки центральной нервной системы сильно дифференцированы. В ЦНС на основании морфологических и функциональных признаков различают 3 типа ГК: астроциты, олигодендроциты и микроглиоциты (Рис. 1.2). Астроциты составляют приблизительно 40-50% популяции всех глиальных клеток. Для них характерно наличие большого количества отростков, которые лучеобразно отходят от клеточного тела (Немечек и др., 1978). Такие отростки называются главными. Расположенные на поверхностях главных отростков щелевые контакты (Wolff, 1970), обладающие повышенной проницаемостью для ионов и малых молекул (Kanno, Loewenstein, 1964), связывают астроциты в синцитиумы (Giaume, McCarthy, 1996). Помимо главных отростков, по всей поверхности астроцитов отходят ламеллярные отростки, которые своей формой и расположением приспосабливаются к топологии окружающих их элементов нервной ткани. Ламеллярные отростки астроцитов оборачивают соматическую и дендритную мембраны нейронов, на участках свободных от синаптических терминалей (Aldskogius, Kozlova, 1998). Установлено, что экспрессия и проницаемость щелевых контактов астроцитов управляется веществами, выделяемыми нервными клетками.
В свою очередь, степень связи между астроцитами может играть роль в поддержании уровня импульсной активности нейронов (Giaume, McCarthy, 1996). Топология астроцитов, контактирующих с одной стороны с кровеносными сосудами, а с другой, с нейронами (Рис. 1.2), позволила Гольджи в 1883 году выдвинуть гипотезу о том, что астроциты снабжают нейроны питательными веществами. Однако, несмотря на общепринятость этой гипотезы, а также на наличие белков, доставляющих глюкозу из кровяного русла в астроциты (Vannucci et al., 1997), гипотеза Гольджи до сих пор не имеет прямого экспериментального подтверждения (Николлс и др., 2003). Считают, что астроциты способствуют поддержанию гомеостаза микроокружения нейронов, оптимизируя условия для нервной и синаптической передачи (Montgomery, 1994). В частности, они способны поглощать излишки нейромедиаторов в окружении нейронов, защищая последние от чрезмерной стимуляции (Kimelberg, Norenberg, 1989). Для выполнения этой функции астроциты оснащены рецепторами нейромедиаторов (Kimelberg, 1995). На тесное функциональное взаимодействие астроцитов и нервных клеток указывает также наличие на поверхности астроцитов рецепторов факторов роста (Raivich, Kreutzberg, 1994;Rudgeetal., 1994). Олигодендроциты составляют примерно такую же часть глиальных клеток, что и астроциты. Основная их роль - образование миелина в центральной нервной системе (Aldskogius, Kozlova, 1998). Функцией миелина, в свою очередь, считают электрическую изоляцию отдельных аксонов, а также ускорение проведения нервных импульсов за счет реализации сальтаторного принципа (Оке, 1969). Существуют также сателлитные олигодендроциты, которые не образуют миелиновых оболочек, окружая тела нейронов в сером веществе. Одной из их функций является регуляция микроокружения вокруг нейронов (Ludwin, 1984, 1997). Количественное соотношение между нейронами и миелин-образующими олигодендроцитами определяется аксо-глиальными взаимодействиями на этапе развития ЦНС (Barres, Raff, 1999). Олигодендроциты, установившие контакт с аксоном, выживают и начинают миелинизацию, а не установившие - погибают от апоптоза (Barres et al, 1992; Hardy, Reynolds, 1993; Trapp et al., 1997). Этот процесс управляется нейрегулинами - факторами роста, выделяемыми нервными клетками (Barres, Raff, 1999; Park et al., 2001), что дополнительно указывает на тесную функциональную связь нейронов и ГК. Олигодендроциты, как и астроцита, образуют друг с другом щелевые контакты, обладающие повышенной проницаемостью (Butt, Ransom, 1989; Robinson et al, 1993; Venance et al, 1995). Подобные контакты были обнаружены между телами олигодендроцитов и астроцитов, а также их отростками (Waxman, Black, 1984; Giaume, Venance, 1995). Таким образом, астроциты и олигодендроциты, называемые вместе клетками макроглии, образуют общую глиальную сеть, так называемый панглиальный синцитий.
Предполагают, что такая гетероклеточная сеть глиальных клеток способствует буферизации К+ вокруг миелинизированных аксонов (Zahs, 1998). Помимо клеток макроглии в ЦНС различают еще один тип глиальных клеток - микроглиоциты. Они имеют меньшие размеры по сравнению с макроглией, а их численность составляет 5-10% от общей популяции ГК. Микроглия не имеет преимущественной локализации в ЦНС: в интактной нервной системе клетки микроглии, обладающие ветвящимися отростками, равномерно рассеяны в сером и белом веществе. Они происходят из костного мозга и принадлежат к системе одноядерных клеток-фагоцитов (Davis et al., 1994; Ulvestad et al., 1994). Функции микроглии в интактной взрослой нервной системе не совсем ясны. Однако, учитывая, что в состоянии покоя эти клетки обладают высокой подвижностью и способностью к фагоцитозу, можно предположить, что они играют сторожевую роль, как патруль, который обходит ткани, чтобы в случае необходимости активироваться и ликвидировать угрозу. Когда их вмешательства недостаточно, они митотически делятся либо им на помощь приходят новые фагоцитирующие элементы из крови (Немечек и др., 1978). Предполагают, что микроглия может выполнять также трофическую функцию для нейронов (Elkabes et al., 1996). Несмотря на свою защитную функцию, клетки микроглии в определенных условиях могут представлять опасность для нейронов. Чрезмерная активация микроглии, приводящая к генерации ею активных форм кислорода, цитокинов и протеолитических ферментов, может служить причиной прогрессирующей гибели нейронов при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера и синдром Дауна (Dickson et al., 1993; McRae et al., 1997). 1.2.2 Периферическая нервная система В периферической нервной системе (ПНС), в отличие от ЦНС, глиальные клетки менее дифференцированы. Единым глиальным элементом в ПНС являются шванновские клетки, которые образуют оболочки периферических нервных волокон и окружают терминали мотонейронов (Немечек и др., 1978; Николлс и др., 2003). В области периферических ганглиев, где шванновская глия окружают тела нейронов, она принимает более "эпителоидную" форму в виде сателлитных клеток. Эти клетки не экспрессируют миелинового белка шванновских клеток, поэтому их выделяют в отдельный фенотип (Kleitman, Bunge, 1995). Зачастую термин "сателлитные глиальные клетки" используют для обозначения глиальных клеток в целом, подразумевая их роль клеток-спутников нейронов в центральной и периферической нервных системах. Шванновская глия, совмещая функции различных типов ГК центральной нервной системы, также тесно взаимодействует с нервными клетками.
Регистрация импульсной активности рецептора растяжения
Механорецептор речного рака выделяли под контролем бинокулярного микроскопа по методике Wiersma et al. (1953). Рецепторные мышцы вырезали вместе с кусочками сегментов хитинового панциря к которым они прикреплены. Отпрепарированный МРО переносили в ванночку с 2 мл физиологического раствора ван Харревельда для холоднокровных животных (mM: NaCl - 205; КС1 -5.4; NaHC03 - 0.24; MgCl2 - 5.4; СаС12 - 13.5; рН 7.2-7.4). Кусочки панциря насаживали на иглы, одна из которых неподвижна, а вторая может перемещаться относительно первой, регулируя, таким образом, растяжение рецепторных мышц. Схема экспериментальной установки приведена на Рис. 2.2. Потенциалы действия (ПД), генерируемые нервной клеткой, отводили внеклеточно от аксона с помощью заполненного физиологическим раствором стеклянного присасывающегося электрода и усиливали усилителем биопотенциалов УУ-90 (ИЭМ, Ленинград). Частоту нервных импульсов измеряли частотомером МФУ-1 (ИЭМ, Ленинград) и непрерывно регистрировали на самописце Н-339 (ЗИП, Краснодар). Кроме того, для регистрации динамики частоты ПД также использовали программно-аппаратный комплекс на базе персонального компьютера и аналогово-цифрового преобразователя L-761 (Л-Кард, Москва). Генерацию импульсов контролировали на экране осциллографа. Растягивая рецепторные мышцы, устанавливали исходную частоту генерации импульсов медленно адаптирующегося нейрона около 10 Гц. После установки препарата 20-30 минут проводили контрольную регистрацию частоты ПД. Затем препарат фотосенсибилизировали и регистрировали импульсную реакцию нейрона во время воздействия. Для получения экспериментальных данных было использовано более 600 механорецепторных нейронов. 2.3 Фотодинамическое воздействие 2.3.1 Фотосенсибилизаторы и источники света Для исследования ФД эффекта, инициируемого в нейронах и ГК фотосенсибилизированными реакциями преимущественно 1-го или 2-типа, в качестве фотосенсибилизаторов использовали рибофлавин (Reanal, Венгрия) или Фотосенс (НИОПИК, Москва), соответственно. Известно, что рибофлавин (Рис.2.3), генерирующий при освещении в основном супероксид-анион радикалы, является фотосенсибилизатором 1-го типа (Girotti, 1990; Schmidt, Butler, 1976; Schmidt, 1984). Тогда как Фотосенс относится к фотосенсибилизаторам 2-го типа, поскольку ди- три- и тетра-алюмофталоцианины (AlPcSn, где п=2, 3 или 4; среднее п=3,1; Рис- 2.4), входящие в его состав, являются эффективными генераторами синглетного кислорода (Rosenthal et al., 1986; Rosenthal, 1991; Langlois et al., 1986; Wagner etal., 1987). Спектры поглощения фотосенсибилизаторов регистрировали на спектрофотометре СФ-2000-02 (ОКБ "Спектр", Санкт-Петербург), а спектры флуоресценции на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама (Люмэкс, Санкт-Петербург) совместно с Брагиным Д.Е. Для инициирования ФД действия Фотосенса использовали гелий-неоновый лазер ЛГН-111 (Полярон, Львов, СССР), излучающий красный свет с длиной волны 632,8 нм и плотностью мощности 0,3 Вт/см2. Для ФД воздействия рибофлавина использовали лампу накаливания со светофильтром СЗС-9 (ЛОМО, Ленинград).
Спектр лампы со светофильтром (Рис. 2.5) определяли путем нахождения отдельных точек спектральной кривой при помощи спектрофотометрической насадки ФМЭЛ-1У4.2 (ЛОМО, Ленинград). Ширина спектрального максимума на половине высоты составила 90 нм (460-550 нм), а интенсивность излучения лампы составила 0,25 Вт/см2. Мощность источников оптического излучения измеряли с помощью прибора ИМО-2Н (Эталон, Волгоград). 2.3.2 Общее и локальное фотодинамическое воздействие Через 30 минут после контрольной регистрации частоты ПД, генерируемых нейроном, в экспериментальную ванночку добавляли Фотосенс или рибофлавин. В большинстве опытов после 30-минутной инкубации с фотосенсибилизатором изолированный механорецептор подвергали общему ФД воздействию, облучая тело нейрона вместе с дендритами, частью аксона и рецепторных мышц. Диаметр луча He-Ne лазера, используемого для индукции ФД действия Фотосенса, составлял 4 мм. Диаметр светового пятна в плоскости препарата от лампы накаливания (использовалась совместно с рибофлавином), фокусировавшейся с помощью линзы, составил 10 мм. Динамику частоты ПД нейрона непрерывно регистрировали вплоть до необратимого прекращения импульсации. По частотограмме определяли фазы (возбуждения и торможения) импульсной реакции нейрона и его время жизни при ФД воздействии. Необратимое прекращение импульсации рассматривали как показатель функциональной смерти нейрона. Для изучения роли нейрона в ФД-индуцированной инактивации ГК, в отдельной серии экспериментов общему ФД воздействию препарата предшествовала избирательная ФД инактивация нервной клетки. Для этого после 30 минутной инкубации препарата с Фотосенсом (10"7 М) тело нейрона облучали сфокусированным лучом He-Ne или полупроводникового лазера. Наведение и фокусировку лазерного луча на тело нейрона осуществляли с помощью микроскопа МБР-1 с объективом 8х (ЛОМО, Ленинград). Луч лазера вводили в оптическую систему микроскопа с помощью опак-иллюминатора (Рис. 2.6). Как видно из рисунка, фокус лазерного луча, собираемого объективом, лежит несколько выше предметной плоскости микроскопа. Это обусловлено принципиальной особенностью оптической схемы микроскопа. Для коррекции этого небольшого расхождения вводили поправку в отсчет микровинта вдоль оси Z или использовали рассеивающую линзу, установленную на выходе полупроводникового лазера. He-Ne лазер использовали без коррекции фокусировки. Локальное облучение тела нейрона длилось 10 минут. После чего препарат подвергали общему ФД воздействию в течение 30 минут. Столько же времени подвергались ФД воздействию контрольные препараты, нейроны которых не были предварительно инактивированы. Для исследования роли импульсной активности нейрона в выживаемости ГК изолированного МРО, рецепторные нейроны после установки в экспериментальную ванночку приводили в состояние покоя, сокращая рецепторные мышцы и лишая тем самым механорецепторы адекватной стимуляции. Эксперимент продолжался 6 или 12 часов. В течение этого времени нейроны в контрольных препаратах, медленно адаптируясь, продолжали генерировать ПД с начальной частотой около 10 Гц. В другой серии экспериментов изучали роль импульсной активности нейрона в выживаемости ГК при ФД воздействии. Для этого за 30 минут до ФД воздействия Фотосенса (10" М) импульсную активность блокировали местным анестетиком лидокаином в концентрации 0,2-0,4 %. Таким образом, последующему 30 минутному ФД воздействию подвергали препараты с "молчащими" нейронами.
В контрольных препаратах импульсную активность нейронов не блокировали - они продолжали генерировать ПД во время ФД воздействия, которое вне зависимости от времени инактивации нейрона продолжали 30 минут. 2.5 Модификация путей химической сигнализации Взаимодействия между нейронами и ГК могут осуществляться посредством обмена различными молекулярными сигналами (Coles, Abott, 1996; Kury et al., 2001). С целью изучения роли аденилатциклазной и тирозинкиназной сигнальных систем в реакции нейронов и ГК на ФД воздействие мы использовали фармакологические модуляторы активности ключевых ферментов этих сигнальных путей. Концентрации модуляторов подбирались таким образом, чтобы эти вещества не оказывали влияния на импульсную активность нейрона в течение 2-3 часов. В опытах модуляторы добавляли в экспериментальную ванночку за 30 минут до ФД воздействия. Контролем служили фотосенсибилизированные нейроны, не обработанные модуляторами активности ферментов. Для повышения активности аденилатциклазы (АЦ) использовали широко используемый в экспериментах активатор этого фермента форсколин (Laurenza, 1989; Barber, Goka, 1985). Мы использовали форсколин (Alomone labs., Израиль) в концентрации 10 мкМ. В качестве ингибитора аденилатциклазы использовали MDL-12330A. Это соединение, известное также как RMI-12330A, проникая в клетку быстро и необратимо ингибирует АЦ (Guellae-n et al., 1977). Мы использовали MDL-12330А (ICN, США) в концентрации 50 нМ. Для ингибирования тирозинкиназ, участвующих в тирозинкиназном пути передачи информации в клетке, использовали генистеин. Он широко используется для ингибирования рецепторной тирозинкиназы фактора роста эпителия (Akiyama et al., 1987; O Dell et al., 1991; Migita et al., 1994). Мы использовали генистеин (Alomone labs., Израиль) в концентрации 50 мкМ. Продолжительность действия химического сигнала передаваемого с помощью тирозинкиназ повышается при низкой активности тирозинфосфатаз
Локализация фотосенсибилизаторов в изолированном механорецепторе
Спектр поглощения Фотосенса в растворе ван Харревельда, использовавшегося в наших опытах, имел максимумы 350, 605 и 674 нм (Рис. 3.1а), а спектр поглощения рибофлавина - 368 и 442 нм (Рис. 3.16). В наших экспериментах для ФД воздействия Фотосенса и рибофлавина мы использовали источники излучения со спектральными максимумами 633 и 490 нм, соответственно. Экстинкции сенсибилизаторов на этих длинах волн составляли примерно 20 и 60 % от максимального поглощения (Табл. 3.1). Спектр поглощения гиперицина в растворе человеческого сывороточного альбумина (для предотвращения агрегации) приведен на Рис. 3.3а. Он имел полосы поглощения 330 , 560 и 600 нм (282 нм - поглощение альбумина). Спектр флуоресценции Фотосенса имел "красный" максимум на длине волны 684 нм (Рис. 3.2 а). Флуоресценция рибофлавина имела максимум в зеленой области спектра на длине волны 520 нм (Рис. 3.2 б). Флуоресценция гиперицина имела максимумы 608 и 648 нм (Рис. 3.3 б). 3.2. Локализация фотосенсибилизаторов в изолированном механорецепторе Поскольку генерируемый при ФД воздействии, цитотоксический синглетный кислород диффундирует за время жизни на расстояние не более 10-20 нм(Moan, 1990; Krasnovsky, 1998), то первичные мишени фотоповреждения в клетке определяются местами внутриклеточной локализации фотосенсибилизатора. В изолированном МРО Фотосенс (10 М) локализовался преимущественно в тлиальных оболочках, окружающих механорецепторный нейрон (Рис. 3.4 а, в). Флуоресценция Фотосенса в теле нейрона была слабее. В зоне аксонного холмика она была наибольшей. Слабое голубое свечение в перикарионе нейрона (Рис. 3.4а), вероятно, представляет собой флуоресценцию восстановленных пиридиннуклеотидов, локализующихся преимущественно в митохондриях и флуоресцирующих в диапазоне 450-480 нм (Карнаухов, 1969). Картина распределения экзогенного рибофлавина (Рис. 3.5 б) совпадала с распределением эндогенных флуорохромов - флавинов и пиридиннуклеотидов, локализующихся в богатой митохондриями и цистернами ЭР околоядерной области МРН (Рис. 3.5 а). Это позволяет заключить, что рибофлавин сенсибилизировал в основном богатую мембранными структурами область перикариона МРН. Гиперицин (Hyp) и его водорастворимая форма (Hyp-S) локализовались преимущественно в глиальной оболочке изолированного МРО (красная флуоресценция на Рис. 3.6а и З.бд, соответственно). RGB-разложение этих изображений выявило красную компоненту, соответствующую флуоресценции гиперицина (Рис. З.бг и З.бз), в перикарионе нейрона, содержащем большое количество- мембранных структур, цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭР) и аппарата Гольджи.
Зеленая эмиссия в перикарионе нейрона (Рис. З.бв и З.бж), очевидно, представляет собой собственную флуоресценцию эндогенных флавинов, локализующихся преимущественно в митохондриях и флуоресцирующих в диапазоне 520-540 нм (Карнаухов, 1969). ФД действие Фотосенса в концентрации 10"5 М в большинстве опытов (63 %) вызывало учащение импульсации МРН, приводящее затем к резкому необратимому прекращению генерации ПД (реакции В-типа, Рис. 3.7а). Такие реакции могли быть результатом повреждений плазматической мембраны, ее деполяризации и развивающегося деполяризационного блока (Uzdensky et al., 2002). О повреждении ПМ нейрона и развитии некроза в ходе такого интенсивного ФД воздействия свидетельствовала наблюдаемая сразу же после облучения окраска ядра МРН пропидиум-иодидом, который не проникает в клетки с интактной ПМ (Рис. 3.8, 3.9). Мы ни разу не наблюдали характерной для апоптоза фрагментации ядра нейрона. ФД воздействие с меньшей концентрацией Фотосенса (10 М) приводило в большинстве опытов (71 %) к постепенному торможению и необратимому прекращению импульсной активности МРН (реакции Т-типа, Рис. 3.76). Такие тормозные реакции могли быть опосредованы СгС , выходящим из фотоповрежденных Са +-депонирующих органелл -митохондрий и ЭР (Uzdensky et al., 2002; Bragin et al., 2003). Также как и в случае ФД воздействия 10"5 М Фотосенса мы не наблюдали характерной для апоптоза фрагментации ядра нейрона. Низкоинтенсивное ФД воздействие Фотосенса (10"7 М) вызывало повышение проницаемости ПМ для пропидиум-иодида и некроз МРН через 100 минут после прекращения облучения (Рис. 3.9). Такой тип гибели нейрона был характеризован нами как замедленный некроз (Uzdensky et al., 2002). ФД воздействие Фотосенса (10" М) вызывало гибель глиальных клеток, как в результате некроза, так и апоптоза. Это проявлялось в увеличении процента ГК с поврежденной ПМ и ядрами, флуорохромированными пропидиум-иодидом - некроз (Рис. 3.10), и в увеличении количества глиальных клеток с фрагментированными ядрами -апоптоз (Рис. 3.12). Достоверное увеличение процента некротических ГК наблюдалось уже через час после облучения препарата (Рис. 3.11). Далее, в "темновых" условиях, процент некроза глии продолжал расти, достигая к 8 часам после воздействия в среднем 50 %. В течение этого времени доля некротических ГК в контрольных препаратах, не подвергавшихся воздействию, оставалась неизменной. ФД-индуцированный некроз практически всех глиальных клеток наблюдался примерно через 12 часов. Число апоптозных ГК оставалось незначительным (1-2 на препарат) в течение первых 4 часов после ФД воздействия, но существенно возрастало в следующие 4 часа (Рис. 3.13). Через 8 часов после ФД воздействия наблюдали в среднем по 30 апоптозных ядер ГК на препарат. В МРО, не подвергавшихся ФД воздействию, мы не наблюдали апоптоза ГК в течение 8 часов после изоляции препарата (Рис. 3.13). Помимо индукции гибели ГК ФД воздействие Фотосенса также вызывало увеличение относительной (на площади 10000 мкм ) численности ядер глиальных клеток (Рис. 3.14). Увеличение численности ядер глии наблюдалось через 6 часов после ФД воздействия вокруг тела нейрона, но не аксона (Рис. 3.15). Рис. 3.10 ФД-индуцированный некроз глиальных клеток, окружающих аксон МРН. (а) - контрольный препарат без воздействия; (б) - препарат через 8 часов после ФД воздействия Фотосенса (10" М). Окраска Hoechst 33342 и ПИ. Масштабный отрезок - 50 мкм.
Участие процессов сигнальной трансдукции в реакции нейрона и глиальных клеток на ФД воздействие
Избирательная инактивация нейрона усиливала ФД-индуцированный апоптоз ГК, окружающих проксимальный участок аксона. (Колосов, 2004). То есть, нейрон защищал окружающие глиальные клетки от фотоиндуцированного апоптоза. Такое влияние могло быть связано с выделением нейроном трофических факторов, распознаваемых глиальными клетками. Такими факторами могут быть нейрегулины - факторы роста глии (Корр et al., 1997). Известно, что факторы роста распознаются рецепторными тирозинкиназами (РТК) и инициируют внутриклеточные сигнальные каскады, регулирующие выживаемость и деление клеток (Зинченко и др., 2003). Поэтому мы исследовали участие тирозинкиназ/тирозинфосфатаз (РТК/ТРФ) в реакции МРН и окружающих его ГК на ФД воздействие. В межклеточных нейроглиальных взаимодействиях могут также участвовать низкомолекулярные сигналы, такие как глутамат (Gafurov et al., 2001) и аденозин (Stevens et al., 2002), распознающиеся рецепторами связанными с G-белками. Последние модулируют активность аденилатциклазы (АЦ), которая генерирует цАМФ, регулирующий многочисленные внутриклеточные процессы. Поэтому мы также изучили роль аденилатциклазного пути в реакциях нейронов и глиальных клеток на ФД воздействие. 3.7.1. Роль аденилатциклазного сигнального пути Для изучения роли аденилатциклазного сигнального пути в реакциях МРН и ГК на ФД воздействие мы использовали ингибитор аденилатциклазы MDL-12330A (Guellaen et al., 1977) или ее активатор форсколин (Seamon et al., 1981). Концентрации этих веществ были подобраны так, чтобы в темноте они не влияли на импульсную активность нейрона в течение 2-3 часов. В темноте MDL-12330A и форсколин постепенно тормозили импульсную активность МРН вплоть до ее полного прекращения в среднем через 3,5 и 5,5 часов при концентрациях 50 нМ или 10 цМ, соответственно (Табл. 3.8). Оба модулятора активности аденилатциклазы качественно не изменяли динамику биоэлектрической реакции нейрона на ФД воздействие.
Однако, ингибирование АЦ с помощью MDL-12330A ускоряло ФД- индуцированное торможение и последующее прекращение нейронной активности. Это достоверно сокращало время жизни фотосенсибилизированного нейрона (Фотосенс, 10" М) на 33 %, тогда как активация АЦ форсколином, наоборот, увеличивала время жизни на 27 % (Табл. 3.8). Следовательно, повышение производства цАМФ аденилатциклазой способствует защите нейрона от ФД инактивации. В темноте оба модулятора АЦ не нарушали целостность плазматической мембраны МРН и не вызывали характерного для некроза флуорохромирования ядра нейрона пропидиум-иодидом (Табл. 3.9). Ингибирование АЦ с помощью MDL-12330A снижало процент ФД-индуцированного некроза нейронов, а активация АЦ форсколином не изменяла его (Табл. 3.9). Как и в предыдущих экспериментах, мы не наблюдали характерной для апоптоза фрагментации ядер нейронов ни при действии модуляторов АЦ в темноте, ни при их сочетании с ФД воздействием. Ни ингибитор аденилатциклазы MDL-12330A (50 нМ), ни ее активатор форсколин (10 цМ) не вызывали некроза или апоптоза ГК через 6 часов пребывания изолированного механорецептора в темноте (Табл. 3.10, 3.11). При ФД воздействии ингибирование АЦ достоверно снижало процент некротических глиальных клеток (Табл. 3.10). Активация АЦ не влияла на процессы фотоиндуцированного некроза, но устраняла апоптогенный эффект ФД воздействия на ГК (Табл. 3.11). Таким образом, ингибирование аденилатциклазы защищало глиальные клетки от ФД-индуцированного некроза, а активация - от апоптоза. Ингибитор АЦ проявлял тенденцию к снижению, а активатор - к увеличению числа глиальных клеток вокруг тела ФД-поврежденного нейрона (Табл. 3.12). Эти различия становились значимыми, при сравнении этих опытов между собой (43 против 37 %), что позволило сделать предположение об участии аденилатциклазы в ФД-индуцированном глиозе (Uzdensky et al., 2005). 3.7.2. Роль тирозинкиназного сигнального пути Межклеточные молекулярные сигналы, управляющие метаболизмом, выживаемостью, ростом и делением клеток, такие как факторы роста, распознаются рецепторными тирозинкиназами. Многие нерецепторные тирозинкиназы также играют важную роль в сигнальной трансдукции, выступая в качестве каталитической субъединицы в составе бимолекулярных рецепторных тирозинкиназ (Зинченко и др., 2003; Крутецкая и др., 2003). Для исследования роли тирозинкиназ в реакции нейрона и ГК на ФД воздействие мы использовали их ингибитор генистеин (Akiyama et al., 1987). Внутриклеточная сигнализация с участием тирозинкиназ обычно осуществляется при участии тирозинфосфатаз (ТРФ), которые, дефосфорилируя белки, модифицированные тирозинкиназами, обрывают действие сигнальных каскадов.
Для исследования роли тирозинфосфатаз в реакции нейрона и ГК на ФД воздействие мы использовали ингибитор ТРФ ортованадат натрия, который ингибирует тирозинфосфатазы и тем самым продлевает фосфорилированное состояние тирозина в клеточных белках (Swamp et al., 1982; Huyer et al., 1997). Нейрон, обработанный 50 цМ генистеина, работал в темноте более 2 часов (Табл. 3.8). При этой концентрации генистеин ускорял ФД-индуцированное торможение импульсации и на 20 % сокращал время Жизни фотосенсибилизированных нейронов (Табл. 3.8). В то же время, ингибирование тирозинкиназ ослабляло ФД-индуцированное повреждение ПМ нейрона, способствующее проникновению в клетку маркера некроза пропидиум-иодида. Процент ФД-поврежденных некротических нейронов в присутствии генистеина составил всего 17 %, по сравнению с 47 % в опытах без ингибирования тирозинкиназ (Табл. 3.9). Таким образом, ингибирование тирозинкиназ способствовало торможению нейронной активности и инактивации нейрона, но, с другой стороны защищало нейрон от некроза, возможно, стабилизируя ПМ. Ингибитор тирозинфосфатаз ортованадат натрия в концентрации 500 цМ инактивировал МРН примерно за три часа (Табл. 3.8). В отличие от генистеина он замедлял ФД-индуцированное торможение импульсной активности нейронов и увеличивал время их жизни на 48 % (Табл. 3.8). При этом наблюдалась тенденция к снижению доли некротических нейронов с поврежденной плазматической мембраной с 60 % до 46 % (р 0.05; Табл. 3.9). Как и в предыдущих экспериментах, мы не наблюдали характерной для апоптоза фрагментации ядер нейронов ни при ингибировании тирозинкиназ или тирозинфосфатаз в темноте, ни при последующем ФД воздействии. Ни ингибитор тирозинкиназ генистеин, ни ингибитор тирозинфосфатаз ортованадат натрия, не влияли на некроз и апоптоз глиальных клеток в темноте (Табл. 3.10, 3.11). В отличие от нейронов, генистеин также не влиял на эти процессы и в фотосенсибилизированных ГК (Табл. 3.10, 3.11). Однако, ортованадат натрия достоверно снижал процент некротических глиальных клеток с поврежденной плазматической мембраной (Табл. 3.10). Оба ингибитора не изменяли численность ГК вокруг сомы нейрона (Табл. 3.12). Таблица 3.8 Влияние модуляторов аденилатциклазы, тирозинкиназ и тирозинфосфатаз на время жизни нейрона при ФД воздействии Фотосенса (10"7 М)
