Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ 8
1.1. Актуальность проблемы 8
1.2. Цели и задачи работы 9
1.3. Научная новина. Положения, выдвинутые на защиту 10
1 .4. Практическая значимость , 11
1.5. Апробация работы : ] 2
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 13
2.1. Химические реактивы 13
2.2. Объект исследования 13
2.3. Регистрация импульсной активности механорецепторного нейрона 15
2.4. Лазерное микрооблучение нейрона 15
2.5. Фотодинамическое воздействие 18
2.6. Фотосенсибилизаторы 19
2.7. Исследование физико-химических характеристик фотосенсибилизаторов 22
2.S. Фармакологическая модификация реакции нейрона на фотодинамическое воздействие 23
2.9. Цитохимическое изучение активности сукцинатдегидрогеназыв микрооблученных нейронах 25
2.10. Общая дегидрогеназная активность (МТТ-тест) 26
2.11. Исследование фотоиндуцированных ультраструктурных изменений в механорецепторном нейроне 26
2.12. Флуоресцентно-микроскопические исследования 27
2.13. Определение АТФазной активности в гомогенатах мозга крыс 28
2.14. Статистическая обработка результатов 30
3. ДЕЙСТВИЕ ВИДИМОГО СВЕТА НА НЕРВНЫЕ КЛЕТКИ 31
3.1. Фотобиологические реакции нервных клеток. Обзор литературы 31
3.1.1. Действие видимого света на пигментированные нейроны 32
3.1.2. Действие видимого света на непигментированные нейроны 36
3.1.2.1. Синяя и зеленая области спектра 37
3.1.2.2. Красная область спектра 39
3.1.3. Лазерное микрооблучение клеток 42
3.2. Реакция механорецепторных нейронов рака на лазерное микрооблучение 48
3.2.1. Динамика импульсной реакции нейрона
3.2.2. Накопление необратимых фотоиндуцированных изменений в нейроне 48
3.2.3. Спектры действия импульсной реакции нейрона на лазерное микрооблучение 51
3.2.4. Зависимость реакции нейрона от интенсивности лазерного микрооблучения 52
3.2.5. Микрооблучение фото сенсибилизированного нейрона 57
3.2.6. Модификация импульсных ответов нейрона биоэнергетическими ингибиторами 59
3.2.7. Ультраструктурные изменения в нейроне, подвергнутом лазерному микрооблучению 63
3.2.8. Ингибирование сукцинатдегидрогеназы в нейроне, подвергнутом лазерному микрооблучению 73
3.2.9. Модификация реакции нейрона на лазерное микрооблучение перехватчиками свободных радикалов 77
3.2.10. Инактивация АТФаз в нервной ткани лазерным облучением 80
3.2.11. Участие ионов Са2+ в реакции нейрона на лазерное микрооблучение 80
3.3. Возможный механизм реакции непигментированного нейрона на синее лазерное микрооблучение 81
3.4. Заключение 84
4. КЛЕТОЧНО-МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 86
4.1. История фотодинамической терапии 86
4.2. Фотодинамический эффект 87
4.3. Фотодинамическая терапия 96
4.4. Клинические применения фотодинамической терапии 99
4.5. Фотосенсибилиззаторы 104
4.6. Внутриклеточная локализация фото сенсибилизаторов 106
4.7. Фотодинамическое воздействие на клеточные структуры 111
4.7.1. Плазматическая мембрана 111
4.7.2. Лизосомы ИЗ
4.7.3. Митохондрии П4
4.7.4. Ядро П6
4.8. Механизмы гибели фото сенсибилизированных клеток 116
4.9. Фотодинамическое воздействие на нервные клетки 120
5. ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ НА ИЗОЛИРОВАННЫЙ НЕЙРОН. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 122
5.1. Биоэлектрические реакции нейрона на ФД воздействие 122
5.2. Концентрационные кривые и сравнение фотосенсибилизаторов 123
5.3. Фотодинамическое действие на нейрон различных производных гематопорфирина 126
5.4. Фотодинамическое действие на нейрон протопорфирина IX 128
5.5. Фотодинамическое действие на нейрон различных производных дейтеропорфирина IX 132
5.5.1. Физико-химические свойства производных дейтеропорфирина IX 132
5.5.2. Динамика импульсных ответов нейронов на фотодинамическое воздействие производных дейтеропорфирина IX 133
5.5.3. Концентрационные зависимости импульсных ответов нейронов на фотодинамическое воздействие производных дейтеропорфирина IX 135
5.6. Фотодинамическое действие на нейрон производных хлориновев 138
5.6.1. Физико-химические свойства производных хлоринов 139
5.6.2. Динамика импульсных ответов нейронов на фотодинамическое воздействие производных хлоринов 140
5.6.3. Концентрационные зависимости импульсных ответов нейронов на фотодинамическое воздействие производных хлоринов 145
5.7. Фотодинамическое действие на нейрон фталоцианиновых сенсибилизаторов 150
5.7.1. Физико-химические свойства фталоцианиновых сенсибилизаторов 151
5.7.2.. Динамика импульсных ответов нейронов
на фото динамическое воздействие фталоцианиновых сенсибилизаторов 151
5.7.3. Концентрационные зависимости импульсных ответов нейронов на
фото динамическое воздействие фталоцианиновых сенсибилизаторов 156
5.8. Спектральные свойства, фото стабильность и действие на клетки гиперицина и его водорастворимой формы 160
5.8.1. Спектральные свойства и фото стабильность гиперицина в растворе и в клетках 163
5.8.1.1. Спектры поглощения света гиперицином 163
5.8.1.2. Спектры флуоресценции гиперицина 163
5.8.1.3. Спектры флуоресценции гиперицинав культивируемых раковых клетках... 174
5.8.1.4. Обсуждение 174
5.8.2. Локализация гиперицина в клетках 176
5.8.2.1, Локализация гиперицина в опухолевых клетках 176
5.8.2.2. Локализация гиперицина и Hyp-S в рецепторе растяжения рака 180
5.8.3. Темновая токсичность гиперицина и Hyp-S 181
5.8.4. Фототоксичность гиперицина и Hyp-S. 183
5.8.4.1. Фотодинамическое действие гиперицина на опухолевые клетки 183
5.8.4.2. Динамика импульсных ответов нейронов на фотодинамическое воздействие гиперицина и Hyp-S 183
5.9. Фотодинамическое действие на нейрон экзогенного рибофлавина 188
5.10. Фотодинамическое действие на нейрон других фото сенсибилизаторов 195
5.10.1. Метиленовый синий 195
5.10.2. Янус зеленый В 195
5.11. Заключение 197
6. КЛЕТОЧНО-МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФОТОСЕНСА НА ИЗОЛИРОВАННЫЙ НЕЙРОН 201
6.1. Локализация Фотосенса в рецепторе растяжения рака 201
6.2. Влияние излучения гелий-неонового лазера и темнового действия Фотосенса на импульсную активность нейрона 201
6.3. Импульсные реакции нейрона на фотодинамическое воздействие Фотосенса 203
6.4. Участие активных форм кислорода в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие 206
6.5. Изменения морфологии ядер механорецепторных нейронов 208
6.6. Динамика нарушения проницаемости плазматической мембраны 215
6.7. Ультраструктурные изменения рецептора растяжения при фото сенсибилизации Фотосенсом 216
6.8. Фотоиндуцированное изменение активности сукцинатдегидрогеназы и общей дегидрогеназной активности в рецепторных нейронах 227
6.9. Субстратно-ингибиторный анализ участия биоэнергетических процессов в реакции
нейрона на фотодинамическое воздействие 230
6.10. Участие ионов Са2+ в импульсной реакции нейрона на фотодинамическое воздействие 235
6.11. Участие процессов сигнальной трансдукции в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие 241
6.11.1. Протеннкиназа С 242
6.11.2. Фосфатидилинозитол 3-киназа 247
6.11.3. Аденилатциклаза 248
6.11.4. Тирозинкиназа 250
6.11.5. Протеинфосфатаза 252
6.12. О механизме реакции нейрона на ФД действие Фотосенса 252
6.12.1. Локализация Фотосенса в рецепторе растяжения рака 253
6.12.2. О роли активных форм кислорода в ФД повреждении нейрона 254
6.12.3. Структурные изменения в фотосенсибилизированных нейронах 255
6.12.4. ФД воздействие на биоэнергетические процессы 256
6.12.5. Участие ионов Са +в фототорможении и смерти нейронов 259
6.12.6. Участие процессов сигнальной трансдукции в реакции нейронов на ФД воздействие 264
6.12.7. Механизм фотоповреждения нейронов при слабом ФД воздействии 270
6.12.8. Механизм фотоповреждения нейронов при интенсивном ФД воздействии., 274
6.13. Выводы 276
7. ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НА ГЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ 277
7.1. Введение 277
7.2. Локализация Фотосенса. Морфология глиальных ядер. Некроз и апоптоз 280
7.3. ФД повреждение глиальных клеток, сенсибилизированных Фотосенсом 280
7.4. Ультраструктурные изменения в глиальных клетках, сенсибилизированных Фотосенсом 283
7.5. Участие процессов сигнальной трансдукции в ФД-индуцированном повреждении глиальных леток 287
7.6. Обсуждение 288
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 296
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Видимый свет - важнейший фактор зарождения и существования жизни на Земле.
Однако, механизмы биологического действия света на живые организмы пока далеки от понимания (Рощупкин, Потапенко, 1977). В организме человека и животных кроме глаз постоянному действию света подвергается кожа и в меньшей степени подкожные мышцы, периферические нервные окончания и кровь. Традиционно считалось, что только ультрафиолетовое излучение может существенно воздействовать на непигментированные клетки животных, не содержащие специальных фоторецепторных молекул (Смит, Хэнеуолт, 1972; Конев, Волотовский, 1974; Трошин, 1979; Владимиров, Потапенко; 1989). С появлением лазеров оказалось, что достаточно интенсивный видимый свет может значительно влиять на биологические ткани, вызывая в них широкую гамму эффектов: от стимуляции метаболических процессов до разрушения биологического материала. Это открыло широкие перспективы использования его в медицине, экспериментальной биологии и сельском хозяйстве (Гамалея, 1972; Инюшин, Чекуров, 1975; Плетнев, 1981, 1996; Крюк и др., 1986; Скобелкин, 1989, Каш, 1998). Для решения этих проблем, а также для разработки гигиенических мероприятий по обеспечению безопасности людей, работающих с лазерами, необходимо всестороннее изучение биологического действия лазерного излучения на объекты разного уровня организации - от биомолекул до целого организма.
Чувствительность клеток и тканей к оптическому излучению может быть искусственно повышена с помощью специальных красителей-фотосенсибилизаторов (ФС). При освещении в присутствии кислорода молекулы ФС генерируют высокотоксичный синглетный кислород, убивающий клетки. Основанный на этом эффекте метод фотодинамической терапии (ФДТ) применяется в онкологии для избирательного разрушения опухолей, селективно накапливающих ФС (Dougherty, 1987; Dougherty et al., 1997; Hasan et al., 2000; Moan, Peng, 2003). Это яркий пример успешного использования биофизических явлений в практической медицине.
Изучение влияния света на нервные и глиальные клетки особенно актуально. Нервная система играет определяющую роль в реакциях организма на внешние воздействия, во взаимодействиях его с окружающей средой. Но имеющиеся в настоящее время сведения не позволяют составить целостное представление о динамике развития реакций нервных клеток на оптические воздействия, об их зависимости от длины волны и интенсивности облучения, о тонких структурных изменениях и биохимических процессах, развертывающихся в облученных клетках, о фотодинамической эффективности разных ФС и механизмах фотосенсибилизации. Особенно мало сведений о фотодинамическом (ФД) воздействии на глиальные клетки, несмотря на их многочисленность в нервной системе и преимущественно глиальное происхождение опухолей мозга, В последние годы показано, что нервные и глиальные клетки тесно взаимодействуют, обмениваясь молекулярными факторами (нейромедиаторами, пептидами, факторами роста), регулирующими их функциональной состояние и взаимно поддерживающими выживаемость. Выяснение реакций нервных и глиальных клеток на ФД воздействие и их взаимодействий расширит применение оптических методов в кейробиологии, нейрохирургии и нейроонкологии.
Использование биофизических методов, таких как лазерное микрооблучение и фотосенсибилизация, дает в руки биологов инструмент для направленного локального и бесконтактного воздействия на отдельные клетки, органеллы или биомолекулы (Гамалея, 1972; Узденский, 1982; Berns, 1974; Ito, 1983; Kesel, Luo, 2001). Этот подход полезен для изучения ряда важных проблем нейрофизиологии, касающихся роли внутриклеточных структур в функционировании нейронов и в их смерти, способов нейропротекции, нейроглиальных взаимодействий при окислительном стрессе. Кроме того, детальное понимание клеточно-молекулярных механизмов лазерного и ФД воздействия на нервные и глиальные клетки позволяет углубить наши представления об общих фотобиологических механизмах повреждения клеток.
Актуальны и практические аспекты данной работы, связанные со сравнительной характеристикой фото сенсибилизаторов и выбором наиболее эффективных из них, выбором оптимальных режимов воздействия, а также с фармакологической коррекцией механизмов и результатов ФДТ.
