Участие АТФ-рецепторов в восприятии клетками неспецифических физических и химических воздействий Ли Вячеслав Вячеславович

Содержание к диссертации

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Пуринергические рецепторы. 9

1. Классификация пуринорецепторов. 9

2. РгХ рецепторы. 11

3. P2Y рецепторы. 13

4. Система передачи сигнала с P2Y рецепторов. 16

5. Механизмы десенситизации рецепторов. 17

6. Внутриклеточный рН и Ыа⁺/Н⁺-обменник. 17

7. Изменение объема клеток при активации пуринорецепторов. 18

2. Функции экстраклеточной АТФ.

2.1. Участие АТФ в синаптнческой передаче сигнала. 20

2.2.Участие АТФ в апоптозе. 21

3. Участие пуринорецепторов в изменение формы и агрегации тромбоцитов. 22

4. Участие АТФ в активации и усилении секреции. 23

1. Са²⁺-зависимая секреция. 26

2. Участие различных каналов в секреции. 26

3. Механизмы регуляции секреции. 28

3. Механизмы освобождения АТФ. 29

4. АТФ-проницаемые каналы. 29

5. Транспортеры адениновых нуклеотидов. 30 3.3 Освобождение АТФ посредством экзоцитоза. 31

4. Освобождение АТФ при различных физических и химических

воздействиях

6. Освобождение клетками АТФ при рецептор-зависимой активации. 33

7. Освобождение АТФ при гипотоническом набухании. 34

8. Освобождение АТФ при механической стимуляции. 36

9. Освобождение АТФ при ранении и гипоксии. 36

10. Освобождение АТФ при действии сапонинов. 38

11. Освобождение АТФ при воздействии ингибиторов КМ. 38 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

12. Получение клеток. 41

13. Измерение [Са²⁴] j. 41

14. Измерение светорассеяния клеток, 43

15. Измерения АТФ с использованием люциферин-люциферазной реакции. 43

16. Измерение процесса секреции с использованием акридинового оранжевого методом флуоресцентной микроскопии. 44 2. 6. Используемые среды. 44

2.7. Используемые реактивы. 44
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Метод малоуглового светорассеяния. 45

17. Зависимость интенсивности светорассеяния от концентрации клеток АКЭ. 46

18. Изменение светорассеяния при набухании клеток. 48

19. Изменение светорассеяния при агрегации клеток. 51

20. Математический анализ данных. 53

2. Изменение светорассеяния и Са сигнал в клетках АКЭ при действии АТФ, сапонина, рН и ингибитора калмодулина R24S71.

2.1. Активация АТФ-рецептора вызывает кратковременный Са²⁺ сигнал

и обратимое изменение светорассеяния в клетках АКЭ. 56

2.2. Гексокиназа и сурамин подавляют Са²⁺ сигнал и сокращение

клеток в ответ на АТФ. 58

3. Гексокиназа и сурамин ингибируют РВД при гипотоническом набухании. 59

4. Сапонин вызывает кратковременный Са²⁺ сигнал и обратимое изменение светорассеяния в клетках АКЭ. 60

5. Гексокиназа и сурамин снимают Са²⁺ сигнал и сокращение клеток

в ответ на сапонин. 63

2.6. Гексокиназа и сурамин подавляют Са²⁺ сигнал и изменение
светорассеяния клеток при изменении рН среды. 64

7. Иономицин вызывает изменения концентрации Са²⁺, и изменения светорассеянии, которые ингибируются гексокиназой. 66

8. Ингибитор калмодулина R24187 вызывает мобилизацию Са²⁺, изменение светорассеяния, которые так же ингибируются гексокиназой и сурамином. 68

3. R24571 индуцирует кратковременный вход Са²⁺ в клетки. 71
3.1. Вход Са²⁺ и изменения светорассеяния, активируемые R24571, ингибируются
нордигйдрогуаретиковой кислотой (NDGA) и дигидрокверцетином. 74

4. Измерение уровня АТФ при помощи люциферин-люциферазной реакции. 78

5. Освобождение акридинового оранжевого при действии АТФ, сапонина и R24187. 80

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 82

ВЫВОДЫ 84

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 98

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

[Ca¹⁺]j - концентрация свободного Са²⁺ в цитоплазме;

АС - аденилатциклаза;

Ach-ацетилхолин;

Ар_ХА - диаденозин-полнфосфаты;

АА - арахидоновая кислота (5,8,11,14-эйкозатетраеновая кислота);

ABC белки - АТФ-связывающие кассетные белки;

CFTR - трансмебранный регулятор кистозного фиброза;

ChTX- харибдотоксина;

DAG - диацилглицерол;

FCCP - карбонилцианид-р-трифторметоксифенилгидразон;

FMLP-

Рига^/АМ-^р-СЗ-карбонилоксагаол^-ил^б-аминобензафуран-З-окси^-^'-амино^'-

метилфенокси)-этил-Ы',К^,^^,,К'-тетрауксусная кислота} ацетоксиметиловый эфир;

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота;

1Рз- инозитол-1,4,5-трифосфат;

IUPHAR - Комитет по номенклатуре и квалификации пуринорецепторов;

NDGA - нордигидрогуаретиковая кислота;

NK - клетки-киллеры;

NO- оксид азота;

PDE-фосфодиэстераза;

pHj - внутриклеточный рН;

Р1Р₂ — фосфатидилинозитолбифосфат;

РКА - протеинканаза А;

РКС - протеинканаза С;

PLA2 - фосфолипаза Аг;

PLC - фосфолипаза С; <

PLD - фосфолипаза D;

РМА — форбол-меристат-ацетат;

RVD - регулируемое уменьшение объёма;

RVI - регулируемое увеличение объёма;

TL - Т-лимфоциты;

TNF-a - фактор некроза опухоли;

ТРА - 12-а-тетрадеканоил форбол-13-ацетат;

VIP- вазоактивный кишечный полипептид;

VSOAC- объём-чувствительные анионные каналы;

АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха;

АТФ, АДФ - аденинтри- и дифосфорная кислота;

ЛОГ- липокснгеназа;

НА - порадреналин;

СР - светорассеяние;

ФА - фосфатидовая кислота;

ФХ - фосфотидилхолин.

ЭР - эндоплазматический ретикулум.

Введение к работе

Адениновые нуклеотиды и в частности АТФ представляют собой новый класс сигнальных молекул (Ogilvie et al, 1996). В течение многих лет внимание исследователей было сосредоточено большей частью на участии АТФ в клеточном метаболизме как источника энергии. Затем было получено большое количество экспериментальных доказательств, указывающих на то, что АТФ играет важную роль во многих других биологических клеточных процессах. В частности, было показано, что АТФ и другие адениновые нуклеотиды являются регуляторами таких клеточных процессов, как рост и дифференциация клеток, клеточная смерть, высвобождение гормонов, неиротрансмиттеров и цитокинов (Ralevica V. and Burnstock G., 1998). Различные биологические ответы на АТФ опосредуются различными рецепторами, находящимися на поверхности клеток, которые активируются при связывании с АТФ или другими нуклеотидами. Физиологическая функция этих рецепторов мало изучена. В последние годы явно возросло внимание к пуринорецепторам, их функциям и механизмам освобождения пуринов из клеток. Это связано с обнаружением пуринорецепторов на разных типах клеток; включая эндотелиальные, эпителиальные, эндокринные, костные, иммунные, опухолевые клетки, клетки поджелудочной железы и печени, и участием этих рецепторов в контроле их многочисленных функций.

АТФ занимает особое место в инициации, усилении и развитии секреции, поскольку она часто входит в состав секретируемых гранул, а её выход и взаимодействие с пуринорецепторами на поверхности клеток может генерировать дополнительный Са ⁺ сигнал и активировать секрецию. В настоящее время показано, что АТФ, наряду с классическими трансмиттерами, нейропептидами и окисью азота, является котрансмиттером в периферической и центральной нервной системе.

Освобождение АТФ из клеток и его использование в качестве агониста пуринорецепторов происходит при активации рядом гормонов, факторами роста, инсулином, стимуляторами митогенеза, секреции и хемотаксиса многих клеток, включая лимфоциты, макрофаги (Abbracchio, М.Р. and Burnstock G., 1998). Количество освобождаемой АТФ сильно различается между клеточными линиями. Для обеспечения освобождения АТФ наиболее вероятен механизм экзоцитоза. Нейроны, хромаффинные и секреторные клетки контролируют освобождение АТФ, неиротрансмиттеров и других экстраклеточных медиаторов после упаковки в специализированные гранулы, называемые синаптическими везикулами и хромаффинными гранулами (Sorensen and Novak, 2001). Стимуляция хромаффинных клеток приводит к транспорту гранул к цитоскелету, слиянию гранул с плазматической мембраной и освобождению содержимого в экстраклеточное пространство.

Большинство сообщений об индукции секреции АТФ связано с активацией клеток агонистами рецепторов (Novak, 2003). Однако АТФ может освобождаться и при воздействии неспецифических физических и химических факторов, при ранении и гипоксии (Ralevica V. and Burnstock G., 1998). Набухание многих клеток в гипотонических условиях вызывает выброс АТФ, которая рецептор-зависимо принимает участие в регуляции объема клеток посредством механизма, известного как регуляторное изменение объёма, или RVD (regulatory volume decrease) и, таким образом, выступает в качестве аутокринного регулятора клеточного объема в гипотонических условиях (Taylor et al, 1998).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что сапонин в низких концентрациях Ю^-6 - 10"³% не индуцирует неспецифической проницаемости мембран, а вызывает генерацию Са²⁺ сигнала - мобилизуя ионы Са²⁺ из эндоплазматического ретикулума (ЭР) и активирует вход Са²⁺ снаружи в клетках асцитной карциномы Эрлиха (Abdrasilov et al, 1996). Механизм такой активации до сих пор не изучен. Возможно, что при действии сапонина также происходит секреция АТФ. Но сам механизм освобождения АТФ до сих пор невыяснен.

Давно известны несколько феноменов связанных с так называемым рН парадоксом, природа которых до настоящего времени не выяснена. Нами был открыт феномен активации Са³⁺ сигнализации при сдвиге рН среды в щелочную область на клетках АКЭ. Показано, что сдвиг рН на 0.1-0.2 ед. среды инкубации приводит к транзитной активации пуринорецептора, образованию 1Рз и мобилизации Са²⁺. Мы предполагаем, что в генерации данного Са²⁺ сигнала также принимает участие освобождающаяся АТФ.

Также известно, что ингибиторы калмодулина (КМ) стимулируют секрецию АТФ в тромбоцитах человека (Luckhoff А,1991), секрецию инсулина и АТФ из $-клеток поджелудочной железы (Kindmark Н, 1991) и секрецию ренина из клеток почки (Park C.S, 1986). Молекулярный механизм участия КМ в регуляции секреции не известен. Роль КМ в регуляции цитозольного Са²⁺ также остается в большой степени не известной. Ингибиторы КМ повышают уровень внутриклеточного Са²⁺, подавляя Са²⁺ АТФ-азу плазматической мембраны, активируя мобилизацию из внутриклеточных структур и вход Са²⁺ снаружи (Watanabe Н, 1999).

Настоящая работа посвящена изучению участия пуринорецепторов в восприятии клетками неспецифических физических и химических воздействий, таких как гипотоническое набухание клеток, изменение рН среды в щелочную область на 0,1-0,2 единицы, действие низких доз сапонина, иономицина и ингибитора калмодулина R24571. В рассмотренных примерах неспецифической активации клеток центральным событием является освобождение клетками АТФ, которая взаимодействует с пуринорецепторами и вызывает генерацию Са ⁺ сигнала. Генерация Са²⁺ сигнала приводит к активации Са²⁺ зависимых К* и СГ каналов, транспорт которых и сопутствующее движение воды приводит к изменениям объёма клеток. Целью работы было изучить механизм выхода АТФ из клеток.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

Разработать методику количественного определения изменения объёма клеток с использованием малоуглового светорассеяния как при рецептор-зависимой активации клеток, так и их агрегации.

Исследовать механизм освобождения АТФ из клеток при действии низких концентраций сапонинов, при сдвиге рН среды в щелочную область, при гипотоническом шоке, при действии ингибитора калмодулин R24571 и действии иономицина.

Исследовать участие пуринорецепторов в генерации Са сигналов и изменении объёма при действии низких концентраций сапонинов, при сдвиге рН среды в щелочную область, при гипотоническом шоке, при действии ингибитора калмодулин R24571 и действии иономицина.

Похожие диссертации на Участие АТФ-рецепторов в восприятии клетками неспецифических физических и химических воздействий

Секреторная активность иммунокомпетентных клеток в условиях воздействия низкоинтенсивными электромагнитными излучениями крайне высокой частоты Синотова Оксана Александровна

Клеточно-молекулярные механизмы фотоповреждения нервных и глиальных клеток лазерным микрооблучением и фотодинамическим воздействием Узденский Анатолий Борисович

Исследование и оптимизация трансфекции, транспорта макромолекул и цитотоксичности, вызванных воздействием ультразвука и электрического поля на клетки и ткани Зарницын Владимир Григорьевич

Механизмы модуляции работы ионотропных рецепторов ацетилхолина и АТФСкоринкин Андрей Иванович

Механизмы модуляции работы ионотропных рецепторов ацетилхолина и АТФСкоронкин Андрей Иванович

Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клеткиИванов Дмитрий Сергеевич

Сравнительная характеристика эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки in vitroУдарцева, Ольга Олеговна

Последствия повреждения генетического аппарата клеток при воздействии на организм экстремальных факторов Костюкова Светлана Владиленовна

Антиоксидантная система защиты клеток при воздействии ксенобиотиковБатиров, Бабир Мехманович

Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки Иванов Дмитрий Сергеевич