Содержание к диссертации
Оглавление , , 2
Список сокращений. 4
Введение 5
Обзор литературы 8
Введение 8
Общие свойства ретровирусов 5
Строение ретровирусного вириона 11
Строение генома ретровирусов 14
Жизненный цикл ретровирусов 19
Взаимодействие ретровирусов с клеточным рецепторами и проникновение
в цитоплазму. 21
Обратная транскрипция и интеграция в геном 23
Транскрипция провируса, синтез вирусных белков и сборка вириона 27
Взаимодействие вирусов с клеточными рецепторами и синцитиеобразование 44
Группы интерференции ретровирусов семейства MLV. 46
История открытия ретровируса М813 54
Материалы и методы ; 56
Материалы 56
Методы работы с клеточными культурами эукариот 57
Пересев клеток. 58
Криоконсервация клеток. 59
Са2+-фосфатная трансфекция 59
Определение титра ретровирусного вектора 63
Анализ синцитиеобразования 64
Трансформация и селекция клеток Е. Coli, выделение плазмиды 70
Анализ геномной ДНК методом Саузерна 75
Анализ РНК методом Нозерн - блоттинга 76
Результаты и обсуждение 85 Характеристика ретровируса М813 85
Определение спектра хозяев М813 85
Определение группы интерференции вируса М813 90
Морфологическая характеристика ретровируса М813 95
Определение индексов слияния фибробластов мыши Scl, экспрессирующих ретровирусы разных групп интерференции MLV, при действии ретровируса М813 96
Определение условий, необходимых для синцитиеобразования под
действием вируса М813 100
Определение наличия в геноме мыши Mus musculus эндогенных ретровирусов, родственных ретровирусу М813, методом Саузерн блоттинга 107
Определение экспрессии ретровирусов М813 и R704 с помощью Нозерн блотт-гибридизации , 110
Определение спектра хозяев ретровируса R704 113
Определение группы интерференции ретровируса R704 114
Выводы 118
Список литературы 119
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение ретровирусов в настоящее время представляет собой значительный интерес как для фундаментальной биологии, так и для ее прикладных областей, таких как генная терапия.
Для фундаментальной биологии данная область интересна тем, что ретровирусы широко распространены в природе, геномы человека и многих видов животных содержат большое количество эндогенных ретровирусов и ретровирусо-подобных элементов, функции которых окончательно не выяснены. Кроме того, ретровирусы являются единственными представителями РНК-содержащих онкогенных вирусов (все остальные онкогенные вирусы - ДНК-содержащие). В процессе изучения онкогенных ретровирусов (вируса саркомы Раусса) были открыты вирусные онкогены. Исследования, посвященные вирусным онкогенам, привели к открытию клеточных генов - регуляторов клеточного цикла и деления клеток. Изучение ретровирусов и особенностей их жизненного цикла привело к открытию в 1970 году обратной транскриптазы - фермента, способного осуществлять синтез ДНК на матрице РНК. Это открытие перевернуло так называемую «Центральную догму» молекулярной биологии об однонаправленности генетической информации в направлении ДНК — РНК — белок, поскольку показало наличие потока информации от РНК к ДНК.
Для генной терапии интерес к ретровирусам обусловлен тем, что на основе ретровирусов созданы эффективные системы переноса и экспрессии генов. Особенностями ретровирусов, которые реализуются в этих системах -способность генома ретровирусов (в виде ДНК-провируса) интегрировать в геном зараженной клетки, простота генетической организации (а, следовательно, и простота генно-инженерных манипуляций с геном), отсутствие цитолитического действия (зараженные клетки, как правило, не гибнут). Кроме того, при использовании ретровирусных систем переноса генов не наблюдается иммунного ответа на них, поскольку возможно полностью исключить вирус-специфические белки (развитие иммунного ответа на аденовирусные векторы - одно из самых серьезных препятствий на пути их использования, так как уже были случаи развития анафилактических реакций со смертельными исходами).
Данная работа посвящена характеристике одного из представителей семейства ретровирусов, группы вирусов лейкозов мышей - ретровируса М8ЇЗ. Этот ретровирус был открыт в 1977 году при скрининге различных видов животных на наличие эндогенных ретровирусов, однако детально он исследован не был. Интерес к этому ретровирусу возник в 1997 году из-за оказавшегося позже неверным предположения об использовании им Pitl в качестве рецептора для заражения клеток.
Цели и задачи исследования
Основной целью данного исследования является характеристика ретровируса М813. Для достижения поставленной цели надо было надо было решить следующие задачи:
1. Определить спектр хозяев данного ретровируса
2. Определить группу интерференции данного ретровируса
3. Провести морфологическую характеристику данного ретровируса
4. Определить способность данного ретровируса вызывать слияние клеток с образование синцитиев
5. Определить условия, при которых происходит образование синцитиев при контакте данного ретровируса с клетками
Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии Института Молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ Научная новизна
В работе проведена характеристика ретровируса М813. Показано, что данный ретровирус относится к группе экотропных ретровирусов мышей. Обнаружено, что ретровирус М813 не относится ни к одной из описанных до сих пор групп интерференции ретровирусов группы MLV и является представителем новой группы интерференции и использует уникальный клеточный рецептор для заражения клеток. Проведенное исследование морфологии ретровируса М813 свидетельствует о том, что он является ретровирусом С-типа.
Обнаружена и описана способность ретровируса М813 вызывать образование синцитиев при контакте с клетками ряда линий. Впервые определены условия индукции синцитиев - это наличие рецептора для ретровируса М813 на клеточной поверхности и экспрессия белков других ретровирусов семейства MLV в клетках.
