Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. История вопроса 34
1.2. Диагностика патологических тканей и злокачественных новообразований по флуоресценции эндогенных и экзогенных флуорохромов 43
1.3. Фотодинамическая диагностика и терапия поверхностного рака мочевого пузыря 47
1.4. Низкоинтенсивная фототерапия болезней различной этиологии 57
1.4.1. Анализ биофизических и физиологических механизмов формирования клинических эффектов 57
1.4.2. Фотоакцепторы и их роль в спектральнозависимых биологических и терапевтических эффектах 59
1.4.3. Эффекты в биологических тканях зависящие от дозы излучения... 68
Глава 2. Экспериментальная техника и методики клинических исследований
2.1. Экспериментальная техника 72
2.2. Высокочувствительная стробируемая телевизионная система регистрации изображений и спектров 75
2.3. Источники излучения 79
2.4. Преобразование излучения ХеСІ на длине волны 308 нм при ВКР в парах металлов 83
2.5. Преобразование высококогерентного излучения XeCl-лазера при ВКР в газообразном водороде 84
2.5.1. Экспериментальная установка 86
2.5.2. Экспериментальные результаты 87
2.5.3. Обсуждение 96
2.6. Универсальный спектральный блок 99
2.7. Методы обработки и анализа спектров и изображений тканей 100
2.7.1.Спектроскопические методы обработки результатов измерений 100
2.7.2. Система и программы обработки, запоминания и анализа данных 102
2.8. Подготовка биологического материала для измерений 106
2.9. Методика обработки результатов 107
Глава 3. Исследование спектральных характеристик цельной крови и её компонентов
3.1. Методика и техника исследований спектральных характеристик крови... 112
3.2. Спектры поглощения и флуоресценции цельной крови и форменных элементов 115
3.3. Спектры поглощения и флуоресценции сыворотки, плазмы и разведённой цельной крови нормальных и больных доноров 120
3.4. Спектры люминесценции образцов цельной крови и её компонентов в видимой области под действием световых, электронных и рентгеновских пучков 124
3.5. Спектры поглощения крови и её компонентов в инфракрасной области.. 128
3.6. Результаты исследования спектральных характеристик мембран эритроцитов 130
3.7. Исследования изменений спектральных характеристик крови in vitro при воздействии излучения He-Ne-лазера с 632.8 нм 133
ГЛАВА 4. Условия синтеза и накопления порфиринов в культуре клеток миелолейкоза линии к-562 в культуре при использовании 5-АЛК
4.1. Материалы и метод 139
4.2. Результаты и обсуждение 141
Глава 5. Биофизические механизмы взаимодействия низкоинтенсивного лазерного излучения красного диапазона спектра с кровью
5.1. Материалы и методы исследований 148
5.2. Исследование системы регуляции агрегатного состояния крови 152
5.3. Основные механизмы генерации активных форм кислород 153
5.3.1. Фотодиссоциация молекул оксигемоглобина 153
5.3.2. Фотодинамический эффект 154
5.3.3. Фотогальванический эффект 155
5.4. Динамика изменения продуктов фотоокислительных процессов в ходе лазерной терапии 157
5.5. Поведение системы антиоксидантной защиты при проведении лазерной терапии 159
5.6. Реакция системы регуляции агрегатного состояния крови 161
5.6.1. Параметры PACK при ЛТ 161
5.6.2. Параметры PACK при увеличении времени облучения 163
5.7. Морфофункциональные и цитохимические характеристики периферического звена эритрона 165
5.8. Изменение систем клеточного и гуморального иммунитета при ЛТ 167
5.9. Исследование функциональной активности и цитохимических характеристик нейтрофилов в ответ на ЛТ 170
5.10. Состояние вегетативной нервной системы и гормонального статуса при проведении ЛТ 176
5.11. Широкополосные источники электромагнитного излучения красного диапазона в комплексной терапии язвенной болезни 180
5.12. Прогнозирование результатов ЛТ 190
5.13. Краткое обсуждение полученных результатов 193
Глава 6. Спектральные характеристики слизистой желудка в норме и при злокачественных новообразованиях
6.1. Материалы и методы 196
6.2. Спектры поглощения слизистой желудка 198
6.3. Спектры флуоресценции слизистой желудка в норме и при аденокарциноме при одночастотном возбуждении 199
6.4. Спектры флуоресценции слизистой желудка при многочастотном возбуждении 205
Глава 7. Трансуретральная диагностика и резекция слизистой мочевого пузыря
7.1. Техника и методика исследований 211
7.2. Трансуретральная резекция слизистой мочевого пузыря под контролем экзогенной флуоресценции 216
7.3. Исследование несенсибилизированных (естественных) спектральных характеристик слизистой мочевого пузыря в норме и при злокачественных новообразованиях 217
7.4. Прижизненная спектрометрическая диагностика злокачественных опухолей мочевого пузыря с помощью излучения ртутной дуговой лампы 226
Заключение 235
Литература 234
Приложение 280
- Диагностика патологических тканей и злокачественных новообразований по флуоресценции эндогенных и экзогенных флуорохромов
- Высокочувствительная стробируемая телевизионная система регистрации изображений и спектров
- Спектры поглощения и флуоресценции цельной крови и форменных элементов
- Результаты и обсуждение
Диагностика патологических тканей и злокачественных новообразований по флуоресценции эндогенных и экзогенных флуорохромов
В тканях организма содержится много органических соединений, обладающих собственной флуоресценцией в УФ-, видимой, ИК-областях спектра. Среди них большой интерес для диагностики злокачественных опухолей представляют аминокислоты с бензольным кольцом: фенилаланин, тирозин и триптофан, флуоресцирующие в области 280-450 нм, ферменты дыхательной цепи: восстановленные формы пиридиннуклеотидов (НАДН, НАДФН) и окисленные формы флавопротеидов (ФП), флуоресцирующие, соответственно, в сине-зеленой (400-500 нм) и желто-зеленой (500-600 нм) областях спектра, соединения порфиринового ряда, излучающие в красной и ближней ИК-областях спектра. Эти вещества участвуют в таких сложных биохимических процессах, как клеточное дыхание, гликолиз, циклы Кребса и Кельвина, окисление жирных кислот и т.д. Можно отметить, что практически любые нарушения клеточного метаболизма отражаются в динамике изменения концентрации НАДН, ФП, цитохромов и порфиринов, проявляются в изменениях интенсивности флуоресценции этих молекул уже на ранних стадиях патологического процесса.
Попытки определения злокачественных новообразований, в том числе на ранних стадиях, с помощью спектрометрических методов предпринимались неоднократно. Однако эти работы были, скорее, случайными и спорадическими, чем закономерными и системными. При этом исследователи исходили из априорного убеждения о том, что между спектральными характеристиками нормальных и злокачественных тканей существует значительная разница в интенсивностях и форме (виде) спектров. Анализ научной литературы показывают, что до 50-х гг. прошлого столетия для
определения злокачественных опухолей использовались в основном спектры поглощения и отражения злокачественных тканей, а также их спектры оптического вращения плоскости поляризации. После открытия в начале 50-х гг. чувствительных ФЭУ для исследовании спектральных характеристик гораздо чаще стали использоваться спектры флуоресценции биотканей. В эти годы было обнаружено селективное накопление в опухолях таких люминесцирующих веществ, как порфирины, акридиновый оранжевый, акрихин, флуоресцеин (натриевая соль). Например, было установлено, что после одноразового внутривенного введения флуоресцеина у здорового человека краситель выделяется полностью за 50-70 часов, у больных злокачественной опухолью флюоресценция обнаруживается еще и через 2000 часов, это время значительно сокращается, если применяется вместо флуоресцеина акрихин [15, 16]. Накопление в злокачественных опухолях вводимых флуоресцентных веществ пытались использовать для целей диагностики. В Институте грудной хирургии АМН СССР больные раком принимали флуоресцеин (1 г. щелочного раствора) за 3,5-4 часа до операции; благодаря этому на операционном столе при освещении УФ-лучами у оперируемого выявлялась граница между светящейся пораженной и здоровой частью легкого: непораженные опухолью ткани флуоресцировали серовато-голубым светом, а раковые опухоли - желтовато-коричневым [17, 18]. При операциях требуется большая освещенность оперируемого органа УФ светом. Карякиным А.В. совместно с Пентюриным был разработан необходимый для этого осветитель. Люминесцентно-флуоресцентный метод был применен в нейрохирургии. Метод позволяет определить границы злокачественной опухоли в мозгу и контролировать радикальность ее удаления. Специальные исследования посвящены изучению флуоресценции красителей (флуорохромов), пригодных для диагностики опухолей центральной нервной системы [19, 20]. При операциях гортани применено внутривенное введение раствора риванола для усиления контраста в цвете люминесценции между злокачественной опухолью и здоровой тканью [21, 22], подробно рассмотрены возможности использования наблюдения люминесценции опухолей для контроля правильности их удаления на ранних стадиях рака гортани. Флуоресцентные красители — флуорохромы — находят широкое применение при использовании наблюдений под микроскопом для диагностических целей. Были разработаны люминесцентно-гистологические методы диагностики рака глотки и гортани [23, 24]. Много внимания уделяется использованию наблюдений собственной флуоресценции как диагностического признака раковых заболеваний. Так, например, в ряде работ авторы наблюдали у больных злокачественными новообразованиями флуоресценцию пораженных тканей, мочи и крови, отличающейся большой яркостью и цветом свечения по сравнению с этим показателем здоровых людьми. По Роффо [25], свечение пораженной кожи позволяет проводить раннюю диагностику предраковых состоянии. Ферруфино [26] считал, что этим путем обнаруживается предрасполагающее к раку повышенное содержание холестерина в кожных инфильтратах. Как диагностический признак рака описана более яркая флуоресценция мочи больных [27-29], флуоресценция красного цвета генеталий женщин [30— 32], кожи и т.д. Следует подчеркнуть, что данные отдельных авторов нередко находятся между собой в противоречии. Например, Розенталь [33] указывает, что практическая ценность желтого свечения при кожных поражениях, о которых писал Роффо, не подтвердилась, не оправдались и другие диагностические признаки. Такое расхождение результатов наблюдении отдельных авторов понятно, если учесть, что в указанных методах диагностики на малом количестве материала ограничиваются констатацией качественных различии флуоресценции тканей или биологических жидкостей, у больных раком по сравнению со здоровыми. Факторы же, обуславливающие эти различия, остаются невыясненными.
Высокочувствительная стробируемая телевизионная система регистрации изображений и спектров
В работе рассмотрена система регистрации на основе микроканального усилителя яркости, супервидикона и запоминающей электронно-лучевой трубки. Экспериментально оценены эффективность счета квантов, интенсивность шумовых отсчетов и частотно-контрастные характеристики. Изложен алгоритм работы, представлено техническое исполнение.
В задачах технического зрения весьма часто встречается необходимость регистрации изображений слабой светимости. Например, в спектроскопии такие проблемы возникают при исследовании веществ по спектрам комбинационного рассеяния и флуоресценции. Подобные случаи встречаются в физике плазмы, астрономии, медицине, биологии, экологии при лазерном зондировании атмосферы и океана, при наблюдении объектов через атмосферу и плотные рассеивающие среды.
Аппаратурное исполнение высокочувствительных систем регистрации может быть различным [14, 15, 16]. Наибольшие возможности будет иметь система, в которой решение задачи накопления и обработки сигнала возложено на персональные компьютеры и программы обработки и распознавания изображении. Однако в ряде случаев целесообразно эксплуатировать более простые и сравнительно доступные системы наблюдения. В данной главе представлены некоторые физические характеристики и техническое исполнение алгоритма работы простой системы для регистрации изображений, как в токовом, так и в режиме счета фотонов.
Система регистрации была выполнена на основе микроканального усилителя яркости (УЯ), высокочувствительной телевизионной передающей трубки (ТПТ) и запоминающей электронно-лучевой трубки (ЭЛТ), Чувствительность этого устройства по световому потоку достигает предельных значений за счет способности УЯ, сочлененного с ТПТ, регистрировать одноэлектронные события. Временное стробирование регистратора осуществлено с помощью импульсного питания микроканальной пластины
(МКП) УЯ. Минимальная экспозиция, определяемая генератором строб-импульсов, равна 100 не. Запоминающая ЭЛТ способна накапливать изображение сотен ТВ-кадров и считывать суммарный сигнал в телевизионном стандарте. В качестве источников облучения (освещения) и возбуждения флюоресценции тканей и текст-объектов применялись как коммерческие импульсные полупроводниковые лазеры, генерирующие свет в красном и ближнем ИК диапазонах спектра, так и разработанные или модернизированные нами источники импульсного лазерного излучения, работающие в широком диапазоне спектра (250 - 630 нм).
Испытание и исследование системы регистрации в ИК области спектра проводилось на установке, структурная схема которой представлена на рис. 2.1, в режиме регистрации отраженного от текст-объекта сигнала. Инжекционный импульсный лазер (1) типа ЛПИ-103, запускаемый кадровыми синхроимпульсами (КСИ), генерировал импульсы излучения на длине волны 0,9 мкм, длительностью т»100 не, энергией Ел 5 Ю-6 Дж с углом расходимости 2а « 40. Излучение лазера освещало тест-объект (3) (размером 435 х 170 мм) в виде миры Фуко с переменной пространственной частотой. Изображение тест-объекта на фотокатоде УЯ (б) строилось светосильным объективом (4), просветленным в ближней ИК-области спектра с фокусным расстоянием F « 148 мм и диаметром Do6« 100 мм. С целью уменьшения помех, создаваемых видимой частью излучения окружающего фона, перед объективом устанавливался полосовой инфракрасный фильтр ИКС-5, либо спектральный прибор для выделения заданной области длин волн. Используемый в установке микроканальный УЯ имел электронно-оптическое увеличение 0,9+1,1 разрешающую способность для центра поля зрения в статическом режиме 22,6штр/мм, многощелочной катод с рабочим диаметром БфК »17мм. В течение времени существования переотраженного тест-объектом лазерного сигнала на МКП УЯ, находившуюся под постоянным напряжением UK 300 В, подавался импульс напряжения длительностью ти« 100 нс, амплитудой UK« 700 В, переводящий его в режим регистрации одноэлектронных событий.
Для токового режима работы его амплитуда составляла 450 В. Это напряжение формировалось высоковольтным генератором строб-импульсов (11% также запускаемым от КСИ. Блок задержки и деления частоты (10) позволял компенсировать временные задержки, связанные с распространением сигнала до тест-объекта и обратно, а также с формированием импульса излучения лазера и выхода микроканального УЯ на номинальный режим работы. Этот блок позволял также согласовать частоты кадров КСИ и частоты следования лазерных импульсов. Возникающее на экране УЯ изображение переносилось сдвоенными объективами типа «Гелиос-44-2» (7) на фотокатод супервидикона ЛИ-702 (3) (9). В качестве базовой системы для монтажа супервидикона была использована серийная прикладная телевизионная установка ГГГУ-50 (8). Сигнал с выхода установки подавался либо на видеовход видеоплаты персонального компьютера (12), либо на мишень запоминающей ЭЛТ, входящей в состав серийно выпускаемого устройства памяти УП-4. Последнее устройство позволяло производить одно- и многокадровую (до 500 ТВ-кадров) запись ТВ-сигналов, их хранение, а также воспроизведение (считывание) с помощью видеоконтрольного устройства (ВКУ) (13). В первых моделях установки для обработки экспериментальных результатов в состав установки входила система ввода и обработки изображения (СВОИ) [17], позволяющая запоминать в памяти до четырех полукадров изображения в телевизионном стандарте форматом 256x256x6 бит.
Спектры поглощения и флуоресценции цельной крови и форменных элементов
Как следует из этого рисунка, в спектрах поглощения исследуемых образцов, наблюдаются сильные полосы поглощения оксигемоглобина (417, 543 и 578 нм), метгемоглобина (630 нм), дезоксигемоглобина (569, 762 нм) и гемина (650-660 нм) (положения максимумов полос поглощения показаны стрелками). В этом случае, при облучении крови He-Ne-лазером, с длинноволновой стороны этих полос поглощения могут наблюдаться полосы флуоресценции с максимумами, лежащими в красной области спектра. Действительно, на рис. 3.2 представлены спектры флуоресценции цельной крови (1), плазмы (2) и сыворотки (3) крови при их облучении излучением He-Ne-лазера. Как следует из этого рисунка, спектры флуоресценции имеют один широкий максимум в области 700 нм, совпадающий для всех трех случаев, на фоне которой наблюдается слабая узкая полоса флуоресценции на длинах волн близи 675 -ь 680 нм. Положение максимума полосы флуоресценции (700 -г 710 нм) и ее вид совпадают с аналогичными характеристиками электронно-колебательной полосой флуоресценции 0- 1 протопорфирина IX при возбуждении последнего излучением He-Ne-лазера. Слабая узкая полоса флуоресценции с максимумом на длинах волн близи 675 + 680 нм может принадлежать димерным формам протопофирина IX, так как эти молекулы имеют полосы поглощения и флуоресценции на указанных длинах волн [33]. Основная полоса флуоресценции этой молекулы имеющий максимум вблизи длины волны 635 нм обрезалась запирающим светофильтрами, не пропускающими возбуждающее излучение He-Ne-лазера. Для выяснения относительного вклада отдельных клеточных популяции в спектральные характеристики крови мы измерили спектры поглощения и флуоресценции лейкоцитарной и тромбоцитарной фракций. Спектры поглощения отмытых лейкоцитов, тромбоцитов и мембран эритроцитов, измеренные в интересующем нас диапазоне длин волн от 500 до 650 нм, сильно различаясь в оптической плотности, достаточно схожи по форме (см. рис. 3.3). Они представляют собой, плавно спадающие в длинноволновую сторону спектральные кривые, имеющие сравнительно небольшие полосы поглощения с максимумами вблизи длин волн 530-540, 570-580, 595, 610, 617-625, 630-640 нм. Эти полосы поглощения принадлежат, в основном, известным полосам поглощения порфиринсодержащих субстратов. Заметим здесь, что флуоресценцию жидких образцов не разведенной цельной крови, в силу очень высокого коэффициента поглощения гемоглобинами света в видимой области, можно наблюдать только при возбуждении и регистрации флуоресценции: 1) в окне прозрачности крови 600— 1400 нм, а также в случае 2) высушенных (обезвоженных) образцов цельной крови. Очевидно, что интенсивность флуоресценции целых живых клеток эритроцитов, как и цельной крови, в силу эффекта реабсорбции света гемоглобинами, также должна быть незначительной. Действительно, нам не удалось зарегистрировать флуоресценцию эритроцитов в растворителях (в том числе в сыворотке и плазме) при концентрациях сравнимых с их количеством в нормальной крови, даже при максимальной чувствительности системы регистрации. Поэтому в нашей работе мы исследовали спектры флуоресценции жидких растворов крови путем последовательного добавления капель цельной крови к чистым образцам сыворотки и плазмы, спектральные характеристики которых были измерены (смотрите следующий параграф).
Результаты и обсуждение
При оценке влияния различных доз 5-АЛК на выживаемость клеток мие-лолейкоза К-562 и интенсивность флуоресценции протопорфирина IX (ПП IX) в суспензии клеток нами установлено, что добавление 5-АЛК в среду культивирования в дозах от 0,4 до 15 мМ приводит к дозозависимому увеличению числа погибших клеток (рис. 4.1) и снижению интенсивности флуоресценции ПП IX (рис. 4.2). В экспериментах с краткосрочной инкубацией клеток было показано, что 5-АЛК в концентрации до 5 мМ не оказывает существенного ци-тотоксического действия (см. рис. 4.1), при этом интенсивность флуоресценции ПП IX возрастает, достигая максимума при 5 мМ (см. рис. 4.2) и продолжительности инкубации 4 ч (рис. 4.3).
В области высоких концентраций (выше 10 мМ) происходит увеличение числа погибших клеток до 20% и снижение интенсивности флуоресценции 1111 IX. При увеличении срока инкубации до 24 ч максимальная интенсивность флюоресценции ПП IX в суспензии клеток наблюдается при концентрации 5-АЛК 2,5 мМ, а при максимальной дозе 5-АЛК (15 мМ) интенсивность флуоресценции снижается в 3,5 раза (рис.4.2, б). Эффект темновой фототоксичности 5-АЛК начинает проявляться при использовании 5-АЛК в дозе 8 мМ. Возрастает гибель клеток, достигая уровня 43%. При максимальной дозе 5-АЛК (15 мМ) количество погибших клеток составило 86% (рис.4.1, б). Этот факт можно объяснить тем, что с увеличением содержания 5-АЛК в среде роста происходит уменьшение рН, приводящее к нарушению процессов нормального функционирования клеток и кислотному разрушению плазматических мембран клеток.
Зарегистрированный диапазон нетоксичных доз 5-АЛК и оптимальное время инкубации -4 ч соответствует данным литературы, полученным для других типов злокачественных клеток. В связи с этим в дальнейших опытах мы применяли 5-АЛК в концентрации до 5 мМ, культивирование клеток проводили в течение 4 ч.
Сравнительные исследования in vitro по изучению накопления ПП IX клетками костного мозга, нормальными лимфоцитами, лимфоцитами, активи- рованньши митогеном ФГА и клетками миелолейкоза К-562, показали исключительно высокую степень избирательности накопления данного вещества в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками.
На основе измерения спектров флуоресценции образцов микрокультур, указанных выше, обнаружено, что полоса флуоресценции в красной области спектра с максимумом интенсивности вблизи длин волн 630 нм и слабой широкой полосой в области 690 нм, наблюдается только в суспензии клеток миелолейкоза К-562 (рис. 4.4). Полоса флуоресценции в длинноволновой области с максимумом на X 675 нм характерна для димерных форм молекул І 111 IX и регистрируется при относительно высоких концентрациях этих молекул как в супернатанте так и в клетках. Для того чтобы выделить вклад различных молекулярных компонент, нами было проведено сравнительное изучение спектральных характеристик суспензии опухолевых клеток в среде инкубации, су-пернатанта и клеток, отмытых от среды инкубации (рис. 4.5).
На этом рисунке видно, что суммарный спектр суспензии опухолевых клеток в среде инкубации состоит из полос флуоресценции с максимумами интенсивности на длине волны 625 нм, совпадающим со спектром супернатанта, и на длине волны 635 нм, совпадающим со спектром излучения отмытых клеток. Первый максимум флуоресценции характерен для молекул протопорфирина IX в водном растворе, а второй - для этих же молекул, находящихся в клетках [16,17]. Следует заметить, что незначительный вклад флуоресценции в данной области спектра на длинах волн 618—623 нм могут вносить гидрофильные молекулы уропорфирина и копропорфирина. Эти молекулы являются предшествующими 1111IX метаболитами в синтезе гема, и поэтому их спектры флуоресценции наблюдались нами лишь в первые часы (1-3 ч.) инкубирования клеток в присутствии 5-АЛК. На рис. 4.6 показан спектр возбуждения флуоресценции суспензии опухолевых клеток в среде инкубации, который имеет основной максимум при 400-410 нм и четыре менее интенсивных пика в области 500-620 нм, что характерно для соединений порфириновой природы [17].
