Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Электронно-возбужденные состояния в бактериальной люминесценции .
1.1. Ферментативные хемилюминесцентные реакции светящихся организмов 15
1.2. Механизмы формирования электронно-возбужденных состояний хемштюминесцентной ферментативной реакции
1.2.1. Химические процессы, предшествующие стадии электронного возбуждения 18
1.2.2. Взаимодействие субстратов 'с ферментами в надмолекулярных структурах 24
1.2.3. Стадия формирования электронно-возбужденных состояний 36
1.3. Возможность заселения высших электронно-колебательных
состояний эмиттера
1.3.1. Закономерности внутримолекулярной миграции энергии возбуждения в эмиттере 43
1.3.2. Формирование электронно-возбужденных состояний в хемилюминесцентных процессах * 63
1.3.3. Заселение высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесцентном процессе 74
1.4. Эффективность элементарных физико-химических процессов в биолюминесцентной реакции 78
1.4.1. Механизмы переноса энергии электронного возбуждения в люминесцентных системах. Природа донора и акцептора 79
1.4.2. Миграция электрона в биолюминесцентных системах 94
1.4.3. Миграция водорода (№=е" + Н^) в биолюминесцентной системе 96
1.5. Применение спектроскопии с временным разрешением для изучения межмолекулярных взаимодействий 101
1.6. Использование системы сопряженных ферментативных реакций качестве люминесцентного биотеста 105
Заключение по 1 главе 122
Глава 2. Методика эксперимента
2.1. Реактивы , 126
2.2. Методы измерения.
2.2.1. Регистрация кинетики биолюминесценции 127
2.2.2. Регистрация флуоресценции при стационарном возбуждении ... 129
2.2.3. Флуоресценция с временным разрешением.., 133
2.2.4. Измерения оптической плотности растворов 140
2.3. Обработка данных.
2.3.1. Обработка данных биолюминесцентного анализа 142
2.3.2. Флуоресценция при постоянном возбуждении 143
2.3.3. Спад флуоресценции и анизотропии флуоресценции 144
2.3.4. Расчет скоростей окисления НАДН 145
2.4. Характеристики исследуемых экзогенных соединений 145
Глава 3. Изучение заселенности электронно- возбужденных состояний эмиттера 150
3.1.. Экспериментальное доказательство заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера с использованием экзогенных молекулярных акцепторов энергии.. 154
3.2. Изучение возможности резонансной миграции энергии в системе: эмиттер биолюминесценции - гидрофобная молекула ... 15
3.3. Дезактивация флуоресцентных состояний эмиттера (Si*) в присутствии молекулярных акцепторов энергии 174
3.4. Внешний эффект тяжелого атома в биолюминесцентной системе. 183
Глава 4. Скорость дезактивации флуоресцентных состояний эмиттера и влияние экзогенных соединений на электроную плотность 193
Глава 5. Скорость доз активации флуоресцентных состояний эмиттера и влияние соединений с различным редокс-потенциалом на перенос водорода (Н> е + Н+) 202
5.1.. Влияние редокс-активных соединений на систему сопряженных реакций, катализируемых НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазой и люциферазой 203
5.2. Кинетические и термодинамические характеристики реакций окисления НАДН экзогенными соединениями. 208
5.3. Действие органических окислителей на процессы миграции водорода в полиферментных биолюминесцентных системах 222
5.4 Присутствие экзогенного низкомолекулярного окислителя в биолюминесцентной системе 237
Глава 6. Исследование взаимодействий экзогенных соединений с ферментами методами спектроскопии с временным разрешением 242
6.1. Взаимодействие с ферментами ксантеновых красителей, включающих атомы галоидов разной массы 243
6.2. Взаимодействие иефлуоресцентных окислителей с ферментами. 252
6.3. Взаимодействия ферментов из набора люминесцентных биотестов с экзогенными флуоресцентными соединениями 266
Глава 7. Применение закономерностей воздействия на иолюминесценцию экзогенных соединений для люминесцентного тестирования 272
7.1. Действие солей металлов на биолюминесцентные системы различной сложности 273
Действие редокс-активных соединений на биолюминесцентные системы различной сложности 280
Заключение 288
Выводы 290
Литература
- Механизмы формирования электронно-возбужденных состояний хемштюминесцентной ферментативной реакции
- Регистрация флуоресценции при стационарном возбуждении
- Изучение возможности резонансной миграции энергии в системе: эмиттер биолюминесценции - гидрофобная молекула
- Действие органических окислителей на процессы миграции водорода в полиферментных биолюминесцентных системах
Введение к работе
Процессы жизнедеятельности организмов всегда сопровождаются слабой и сверхслабой хемилгоминесценцией. Это связано с тем, что в результате реакций окисления в биологических системах формируются электронно-возбужденные состояния молекул продуктов. Малый квантовый выход хемилюминесценции в живых объектах связан с эффективной безызлунательной конверсией возбуждения. Биолюминесценция является частным случаем хемилюминесценции, отличается присутствием биологических катализаторов и характеризуется высокими квантовыми выходами (от 1 до 100%). Формирование возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции является наименее изученной стадией биолюминесцентного процесса.
В настоящее время изучение механизма формирования возбуждения в хемилюминесцентных реакциях осуществляется на основе квантово-химических подходов с учетом анализа скоростей элементарных физико-химических процессов. Наиболее вероятным полагается формирование птг*-состояний с локализацией возбуждения на карбонильных группах. С другой стороны, В 70-х 80-х годах разработана систематика молекул по спектрально-люминесцентным свойствам, в соответствии с которой эмиттеры всех биолюминесцентных организмов принадлежат к V спектрально-люминесцентной группе, молекулы которой характеризуются высокими квантовыми выходами тгл*-флуоресценции и высшими состояния пл*-типа. Именно принадлежность эмиттеров биолюминесценции к данной группе соединений и определяет высокие квантовые выходы излунательной дезактвации возбужденных эмиттеров биолюминесценции. Т.о., интенсивность биолюминесценции определяется, во-первых, высокими скоростями ферментативных биолюминесцентных реакций, и, во-вторых, электронной структурой молекул эмиттеров.
Изучение механизма биолюминесценции предполагает анализ скоростей элементарных физико-химических процессов (миграции энергии, электрона), ведущих к формированию и дезактивации электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции. При этом эффективность излучательной дезактивации флуоресцентных состояний в биолюминесцентном процессе (интенсивность биолюминесценции) является интегральной характеристикой скоростей элементарных физико-химических процессов на всех стадиях биолюшшесцентного процесса: от начальных стадий химических перестроек до формирования и дезактивации электронно-возбужденных состояний.
Для анализа скоростей элементарных физико-химических процессов в биолюминесцентной системе использован метод воздействия на систему рядами гомологичных соединений, различающихся их физико-химическими характеристиками: энергией электронно-возбужденных состояний, квантовым выходом флуоресценции, редокс-потенциалом, количеством гидрофобных заместителей, включением в состав молекулы тяжелого атома и др. Физико-химические характеристики экзогенных соединений определяют их влияние на элементарные физико-химические процессы. Так, скорость межмолекулярной миграции энергии возбуждения определяется относительным положением уровней энергии электронных состояний донора и акцептора; скорость внутримолекулярной миграции энергии зависит от присутствия тяжелого атома; эффективность миграции электрона или водорода в полярной среде (Н = е" + Н+) определяются электронно-акцепторными характеристиками экзогенных молекул; гидрофобные взаимодействия зависят от количества и размера гидрофобных фрагментов в этих соединениях.
Таким образом, развитие теорий хемилюминесценции, строения молекул и межмолекулярной миграции энергии возбуждения определяют основу- для изучения физико-химического механизма формирования возбуждения в биолюминесцентном процессе. Исследование механизма
9 формирования электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера актуально с научной точки зрения.
Анализ закономерностей воздействия экзогенных соединений на биолюминесцентные системы актуален и с практической точки зрения, т.к. результатом его является создание физико-химических основ люминесцентного биотестирования.
Цель исследования. Целью работы является изучение механизма формирования электронно-возбужденных состояний в биолюминесценции на основе закономерностей воздействия рядов соединений с различными физико-химическими характеристиками на биолюминесцентную систему сопряженных ферментативных реакций.
В работе поставлены следующие задачи.
Исследовать элементарные стадии, предшествующие образованию флуоресцентных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции. Экспериментально доказать возможность заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера на основе анализа спектров биолюминесценции в присутствии ароматических соединений с различной энергией флуоресцентных состояний.
Установить зависимость эффективности излучательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера от следующих факторов: эффективности межмолекулярной миграции энергии возбуждения, варьируемой добавлением экзогенных соединений с различными энергиями флуоресцентных (S*i) состояний; эффективности внутримолекулярной миграции энергии возбуждения, варьируемой добавлением экзогенных соединений, включающих атомы галоидов разной массы; влияния катионов металлов с различными электронно-акцепторными свойствами на распределение электронной плотности в биолюминесцентной системе сопряженных реакций;
10 влияния экзогенных окислителей на процессы миграции водорода (Н — е" + Н+) в окислительно-восстановительной реакции с участием НАДН, сопряженной с биолюминесцентной реакцией.
Установить зависимости эффективности взаимодействия экзогенных соединений с ферментами биолюминесцентной, системы реакций от физико-химических характеристик данных соединений.
Разработать физико-химические основы люминесцентного биотестирования для прогнозирования результатов анализа и направленного изменения чувствительности биотестов к определенным группам поллютантов.
Научная новизна. Впервые экспериментально доказана возможность участия высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесцентном процессе. Установлена энергия высших электронно-возбужденных состояний - порядка 26000 см"1. С использованием метода флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением показана возможность межмолекулярной резонансной миграции энергии с высших электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера на экзогенные гидрофобные молекулы.
Впервые эффективность излунательной дезактивации флуоресцентных состояний биолюминесцентного эмиттера связана со скоростями элементарных физико-химических процессов (переноса энергии, электрона, водорода), которые варьировались добавлением экзогенных соединений с заданными физико-химическими характеристиками (энергией электронно-возбужденных состояний, квантовым выходом флуоресценции, редокс-потенциалом, количеством гидрофобных заместителей и т.д.). Установлены зависимости между данными характеристиками экзогенных соединений и изменением скорости и спектральных характеристик биолюминесцентной реакции. Продемонстрирован внешний эффект тяжелого атома в био люминесцентной системе. Показано, что изменение кинетических параметров биолюминесценции (индукционного периода, времени выхода на максимум биолюминесценции) системы сопряженных ферментативных реакций, катализируемых бактериальной люциферазой и НАД(Ф):ФМН-оксидоредуктазой, в присутствии окислителей связаны с влиянием этих молекул на процессы переноса водорода (Н = е" + Н+) в реакции восстановления НАДД сопряженной с биолюминесцентной реакцией. Показано, что основным механизмом влияния катионов металлов на скорость биолюминесцентной реакции является изменение распределения электронной плотности в биолгоминесцентной системе сопряженных реакций. Установлена связь физико-химических характеристик экзогенных соединений (массы галогена в составе молекулы, количества гидрофобных заместителей) с эффективностью взаимодействия этих соединений с ферментами биолюминесцентной системы.
Предложен метод количественного исследования свойств биологических тестовых систем на основе воздействия рядами гомологичных соединений с различными физико-химическими характеристиками. Положения, выносимые на защиту.
Обоснование и экспериментальное доказательство возможности заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера бактериальной биолюминесценции в качестве стадии, предшествующей образованию флуоресцентных состояний эмиттера в биолюминесцентной реакции.
Механизмы воздействия экзогенных соединений на бактериальную биолюминесценцию. Связь физико-химических свойств экзогенных соединений (энергии электронно-возбужденных состояний, электронно-акцепторных характеристикам, количества гидрофобных заместителей, массы галоида в составе молекулы), со скоростями элементарных физико-химических процессов на различных стадиях биолюминесцентного процесса, эффективностью взаимодействия этих соединений с ферментами и скоростью дезактивации флуоресцентных состояний эмиттера.
3. Физико-химический подход для изучения механизма функционирования биологических тестовых систем путем воздействия рядами гомологичных соединений с различными физико-химическими характеристиками: энергией электронно-возбужденных состояний, редокс-потенциалом, гидфобностью и т.д.
Практическая значимость. Полученные в работе закономерности воздействия рядов экзогенных соединений на биолюминесцентные системы представляют собой физико-химическую основу люминесцентного биотестирования и используются при разработке методов целенаправленного изменения чувствительности биолюминесцентных тестовых систем к различным группам поллютантов и прогнозирования результатов люминесцентных биотестов.
Апробация работы. Основные положения работы представлены на 5-ой Всесоюзной конференции по органическим люминофорам (Харьков, 1987); 3-ем Всесоюзном совещания «Люминесценция и развитие ее применений в народном хозяйстве» (Рига, 1989); 4-ой Всесоюзной конференции по фотохимии (Новосибирск, 1989); Совещании по проблемам гидрометеорологического обеспечения народного хозяйства Сибири (Красноярск, 1989); 5-м Всесоюзного совещания по люминесценции (Караганда, 1989); 3-ем Всесоюзном совещании по хемилюминесценции (Рига, 1990); 3-ей Международной конференции по химической инженерии (Прага, 1990); Международного конгресса по аналитической химии (Лондон, 1992); 4-м Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и экологии и его аппаратурное обеспечение" (Клин, 1992), Всероссийской конференции по биотехнологии (Пущино, 1992); Международной конференции по наноструктурам технологиям (Москва, 1993); Международных конференциях по биолюминесценции и хемилюминесценции (Гаваи, США, 1993, Вудс Хол, США, 1996, Болонья, Италия, 1998, Кембридж, Великобритания, 2002); Международных конференциях по экологии (Санкт-Петербург, 1994, Пермь, 2001);
Международной конференции по антиоксидантной терапии (Берлин, 1996); Международным совещаниям по биосенсорам (Лунд, Швеция, 1996, Берлин, Германия, 1998); 9-ой Международной конференции по коллоидным системам (София, Болгария, 1997); Международной конференции по биотехнологии (Будапешт, Венгрия, 1997); 3-м Международном симпозиуме по новым ароматическим соединениям (Гонг-Конг, 1998); Международном биофизическом конгрессе (Дели, Индия, 1999); 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999); Международных симпозиумах по полициклическим ароматическим соединениям (Лион, Франция, 1999, Париж, Франция 200 J); 4-м Съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Белоруссия, 2000); Международной конференции по биологической физике (Токио, Япония, 2001); Международной конференции по химии высокоорганизованных соединений (С.-Петербург, 2001), Международной конференции по фотохимии (Москва, 2001), Международной конференции по Спектроскопии биологических молекул (Сегед, Венгрия, 2003), Международной школе по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Саратов, 2003).
Личный вклад соискателя состоял в проведении основных экспериментальных и теоретических работ по теме диссертации. Автору принадлежит гипотеза активности высших электронно-возбужденных состояний в биолюминесцентном процессе и метод использования рядов гомологичных соединений с различными физико-химическими характеристиками для изучения механизма функционирования ферментативных систем. Экспериментальная проверка гипотезы и использование предложенного метода осуществлялись совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН., кафедры квантовой электроники Красноярского госуниверситета, лаборатории лазерной спектроскопии Новосибирского государственного технического университета, Микроспектроскопического центра Агроуниверситета г.Вагенинген (Голландия).
14 Основная часть результатов была получена в соавторстве с Шигориным Д.Н., Кратасюк В.А., Белобровым П.И., Е.В., Немцевой Е.В., Есимбековой Е.Н., Сизых А.Г., Герасимовой М.А., Кузнецовым A.M.-, Мешалкиным Ю.П. Вклад соавторов отражен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.
Публикации. Основные материалы диссертации изложены в более чем 100 публикациях, 40 из них - статьи в реферируемых российских (советских) и зарубежных изданиях.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №98-02-18054 и №01-03-32843); Российско-голландского гранта NWO-Russia 047-007-005; NATO CoJlaborate Linkage Grant (CLG-974984); грант REC-002 Министерства образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза, программа «Фундаментальные исследования и высшее образование»; Федеральной целевой программы «Интеграция высшего образования и фундаментальной науки» (проекты А0021 и В008); гранта ИНТАС №562, грантов Красноярского краевого фонда науки и 5F0086-C и 7F0202-D; гранта РАН для молодых ученых №223.
Механизмы формирования электронно-возбужденных состояний хемштюминесцентной ферментативной реакции
Структурные формулы субстратов и продуктов реакции (I) катализируемой бактериальной люциферазой: (1) Восстановленный ФМН (или ФМН Н2, или 1,5-дигидро-флавин) (2) ФМН (приведена нумерация атомов нзоаллоксазинового кольца) (З)Тетрадеканаль (или Сн-альдегид, или миристиновый альдегид) (4) Тетрадекакарбоновая (миристиновая) кислота
Эта реакция представляет собой (Схема 1.2.1.2) ферментативное окисление восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН-Нз) и длинноцепочсчпого альдегида (RCHO) кислородом воздуха (Hastings, 1996; МсСарга, 1996). В ходе реакции образуется электронно-возбужденный продукт, испускающий голубовато-зеленый свет с максимумом при длине волны 490 нм (что соответствует 20400 см"1 или 60 ккал/моль), при этом альдегид окисляется до соответствующей кислоты. Энергия окисления ФМН-ЬЬ составляет 40 ккал/моль, а при окислении альдегида выделяется 70 ккал/моль. Таким образом, в ходе реакции освобождается 110 ккал/моль, что соответствует 260 им или 38400 см"1.
Это одна из наиболее медленных ферментативных реакций, время оборота фермента составляет приблизительно 100 с (Угарова и др., 1981).
Бактериальная люцифераза представляет собой гетеро димер с молекулярным весом в среднем 79000, состоящий из двух неидентичных субъединиц аи весом 42 000 и 37 000 соответственно (Thoden et al.,1997; SirokmanetaL, 1995; Clare et al., 1997; Tanner et al., 1997; Eckstein et al., 1993). Кинетический анализ, показал присоединение одной молекулы ФМНН2 к одной молекуле люциферазы (гетеродимеру) (Baldwin et. а., 1975; Becvar et. al, 1976). Роль р-субъединицы до конца не ясна, хотя и очень существенна для проявления биолюминесцентной активности: показано, что р1-субъединица обеспечивает стабилизацию каталитически активного димера (Eckstein et al., 1993). В молекуле этого фермента отсутствуют металлы, простетические группы и неаминокислотные остатки (Гительзон и др., 1984).
Своеобразие люциферазы как фермента заключается в том, что она фактически замедляет реакцию окисления восстановленного флавина. Известно, что ФМН-Нг в растворе окисляется кислородом воздуха в 20 раз быстрее, чем в реакции, катализируемой бактериальной люциферазой (Hastings and Gibson, 1963).
Поскольку ни один из субстратов люциферазы не может существовать в бактериальной клетке в свободном виде (дигидрофлавин - по причине быстрого окисления, альдегид - потому что является ядом и не производится организмами), бактерии имеют специальные ферментативные системы, восстанавливаіощие исключительно для нужд биольоминесценции флавин и органическую кислоту. Считается, что восстановление ФМН происходит в реакции, катализируемой НАДН;ФМН-оксидоредуктазой (Схема 1.2.1.1, реакция 2, Схема. 1.2.1.3).
По отношению к альдегидам люциферазы различных источников имеют различную специфичность. Сродство альдегида к люциферазе обусловлено гидрофобными связями между каждым участком цепи альдегида и гидрофобными группами фермента. Благодаря этому с увеличением длины углеродной цепи альдегид прочнее связывается с люцифсразой (Угарова и др, 1981; Гительзон и др., 1984; Hastings, 1996). Считается, что это обеспечивает большую эффективность биолюминесцентной реакции. Кроме того, длина алифатической цепочки определяет положение альдегидной группы, участвующей в химических перестройках в активном центре люциферазы. Альдегиды с цепочкой, короче, чем у октаналя, не участвуют в люминесцентной реакции. Установлено, что природным субстратом бактериальной люциферазы является тетрадеканаль (Схема. 1.2.2) (Ulitzur and Hastings, 1979), поскольку в бактериях ферментативная система, восстанавливающая для нужд биолюминесценции карбоновую кислоту, имеет специфичность именно к миристиновой кислоте (Meighen, 1993).
В 1963 г. Гастингс и Джибсон предложили схему реакции, катализируемой бактериальной люциферазой, объясняющую сложный характер спада интенсивности биолюминесценции этой реакции в условиях высокой концентрации фермента (Hastings and Gibson, 1963). Она включала в себя 3 основных интермедиата реакции: люцифераза+ФМН-Н2 (интермедиат I), люцифераза+пероксифлавин (интермедиат П) и люцифераза+ пероксихемиацеталь-ФМН (интермедиат ПА) (Схема 1.2.3.). Дальнейшие исследования подтвердили правильность этой схемы в целом. При этом до сих пор учеными не найдено единой точки зрения в отношении механизма преобразования интермедиата ЇІА в возбужденный (этот этап обозначен на схемах 1.3-1.4 вопросительным знаком).
Регистрация флуоресценции при стационарном возбуждении
Биолюминесценцию бифермептной системы запускали внесением в смесь НАДН-КРАБ. Кювету с реакционной смесью помещали вплотную к щели монохроматора и регистрировали исходную биолюминесценцию (контрольный спектр). Затем в эту же кювету добавляли 50-300 мкл раствора флуоресцентного органического соединения (РОРОР, МСБ, антрацен, хиноны, фенолы) и записывали спектр вновь. Если после такой операции интенсивность биолюминесценции не падала до критического уровня чувствительности установки, то добавление красителей повторяли вновь.
При снятии интегральной кинетики биолюминесценции в присутствии ксантеновых красителей разных концентраций на биолюминометре была использована реакционная смесь №1. 20 мкл исследуемого вещества вносились после добавления в кювету ФМН, реакция запускалась раствором НАДН. Область исследуемых концентраций водных растворов ксантеновых красителей — 10 9-И0"5 М.
При регистрации спектров биолюминесценции в присутствии красителей ксантенового ряда была использована реакционная смесь №2. Область исследуемых концентраций красителей в данном эксперименте -— 3-Ю 6-г10"4М. Запись спектров сенсибилизированной биолюминесценции в присутствии ксантеновых красителей производилась в кварцевой кювете на оптическом пути 10 мм. Сначала регистрировали исходную биолюминесценцию (контрольный спектр) в диапазоне 420-630 нм с шагом 1 нм при времени накопления на одной точке 0,2 с. Затем в эту же кювету добавляли 2-50 мкл раствора флуоресцентного соединения и записывали спектр вновь. Если после такой процедуры интенсивность биолюминесценции не падала до критического уровня чувствительности установки, то добавление красителей повторяли вновь.
Измерения анизотропии флуоресценции растворов экзогенных соединений выполнены на флуориметре SPEX Fluorolog 1681 (рабочий диапазон 180-1000 нм).
Измерения анизотропии флуоресценции эндогенного флавина при постоянном возбуждении проводили в препаратах ферментов, люциферазы и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы, в отсутствии и присутствии различных концентраций экзогенных соединений (хинонов). Исследуемый образец облучали, используя монохроматический источник света (длина волны возбуждения 450 нм, ширина щели 0,1 мм), в течение 1 мин. Измерения интенсивности флуоресценции образца сделаны при двух-кональном счете фотонов.
Анизотропия флуоресценции определялась из отношения сигналов, поступающих из двух анализаторов, один из которых фиксировал интенсивность вертикально поляризованного света (1Х), другой фиксировал интенсивность горизонтально - поляризованного света (1ц). Ориентация анализаторов была калибрована. При измерениях интенсивности флуоресценции использовали цветной фильтр, позволяющий регистрировать флуоресценцию для длин волн больших 500 нм.
Флуоресценция с временным разрешением.
Изучение взаимодействия флуоресцентных ароматических соединений с ферментами проводились путем анализа спада интенсивности флуоресценции и анизотропии флуоресценции этих соединений при пикосекундном возбуждении. При изучении спада люминесценции экзогенных соединений использовали длины волн возбуждения 340 и 450 нм, эндогенного флавина - 450 нм, ферментов - 300 нм. Принцип счета фотонов с временной корреляцией представлен на Рис. 2.3 (O Connor, etal., 1984).
При измерения флуоресценции РОРОР, МСБ, антрацена, 1,4-антрацендиола с временным разрешением с использовали 1) лазеры с синхронизацией мод для возбуждения и 2) цифровая техники счета фотонов с временной корреляцией для регистрации сигнала. Непрерывный NdrYLF лазер с синхронизацией мод (Coherent, модель Antares 76-YLF, (Reed, 1990)) был оборудован удвоителем частоты (с температурным контроллером Coherent, модель 7900 SHGTC) и утроителем частоты (Coherent, модель 7950 THG) для того, чтобы получать непрерывную выходную мощность с синхронизацией мод вплоть до 1 Вт на длине волны 351 нм. С помощью этого УФ излучения синхронно накачивался непрерывный лазер на красителе. В лазере на красителе использовался краситель DCM (Exciton Inc.). Лазер на красителе был сконструирован (Coherent Radiation, модель 701-2 CD), был выполнен со стандартным трехзеркальным резонатором, но в последствии выходное зеркало было перемещено на расстояние, соответствующее наилучшему согласованию длин резонаторов накачивающего лазера и лазера на красителе. Для уменьшения частоты следования импульсов возбуждения до 594 кГц было использовано устройство с двухпроходным электро-оптическим модулятором, описанное ранее (van Ноек, 1981). Длительность конечного импульса возбуждения была около 4 пс по полувысоте; длины волны, используемая в данной работе, составляла 343 нм. Максимальная энергия в импульсе составляла десятки пДж.
Изучение возможности резонансной миграции энергии в системе: эмиттер биолюминесценции - гидрофобная молекула
Известно, что любой биологический процесс можно рассматривать как сложную комбинацию элементарных физических и химических процессов. Изменение какой-либо физиологической функции организма при воздействии на него экзогенных веществ является результатом воздействия на большое количество взаимосвязанных элементарных процессов в организме. Экзогенные вещества различной природы, оказывающие влияние на разные элементарные физические процессы, могут вызывать изменение одного и того же физиологического параметра. Т.е. отклик организма является интегральной функцией первичных физических и химических процессов. Все вышесказанное дает возможность использовать общий подход для биологических объектов, заключающийся в установлении связи между биологическими функциями организма и эффективностью элементарных физических и физико-химических процессов, происходящих в биологических системах под воздействием экзогенных соединений. К элементарным процессам можно отнести перенос энергии, электрона, а также более сложный процесс переноса водорода, который можно рассматривать как сумму электрона и протона (Н = е" + Н+). Интенсивность биолюминесценции определяется скоростью дезактивации электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции. Известно, что для флавинов, которые являются представителями 5-ой группы спектрально-люминесцентной систематики молекул, константы скорости излучательной дезактивации велики: к (S - S0) 107 - 1010 с ] (Плотников, 1980; Шигорин, и др. 1993). Квантовые выходы флуоресценции флавинов - порядка 25%, Оставшиеся 75% приходятся на безызлучательную дезактивацию возбуждения через триплетные состояния (S — конверсия). Скорость излучательной дезактивации флуоресцентных состояний эмиттера является величиной, которую в биолюминесцентной реакции можно оценить экспериментально, как сказано выше, по интенсивности биолюминесценции. Это и есть интегрирующий параметр жизнедеятельности организма (а также системы in vitro), в изменении которого отражаются все внешние воздействия, включая воздействия экзогенных соединений. Экзогенные соединения могут оказывать воздействия на элементарные физико-химические процессы на любых стадиях сложного биолюминесцентного процесса. Удобно классифицировать воздействия экзогенных соединений по стадии биолюминесцентного процесса: воздействие может осуществляться на стадиях (1), когда уже образовались возбужденные состояния эмиттера, и на стадиях (2), предшествующих образованию электронно-возбужденных состояний.
Рассмотрим, каким образом экзогенные соединения могут воздействовать на стадии 1. В этом скорость излучательной дезактивации флуоресцентных состояний варьируется в результате изменения скоростей заселения этих состояний и скоростей безызлучательной дезактивации. Дезактивировать флуоресцентные состояния можно в результате межмолекулярного переноса энергии на подходящие акцепторы и увеличения скорости внутримолекулярной S - конверсии эмиттера биолюминесценции в присутствии тяжелых атомов, В связи с этим, экзогенные соединения изменяют эффективность биолюминесценции в результате (і) образования дополнительных межмолекулярных каналов миграции энергии с электронно-возбужденных состояний эмиттера путем резонансного переноса или абсорбции биолюминесценции, а также (п) изменения эффективности внутримолекулярных процессов переноса энергии в результате увеличения скорости интеркомбинационной конверсии в эмиттере биолюминесценции в присутствии внешнего тяжелого атома.
Межмолекулярную миграцию энергии возбуждения наблюдали в присутствии химически инертных флуоресцентных молекул в качестве акцепторов энергии возбуждения. На Рис. 3.L прерывистыми стрелками показаны межмолекулярные процессы миграции энергии между биолюминесцентным эмиттером (Рис.3.1а) и экзогенными флуоресцентными молекулами (Рис.3 Л б и 3.1 в) с различной энергией флуоресцентных S,„ -состояний. Флуоресцентные молекулы с энергией флуоресцентных состояний меньшей, чем аналогичная энергия биолюминесцентного эмиттера (Рис.3.1), могут акцептировать энергию с S состояний биолюминесцентного эмиттера (показано на Рис. прерывистыми стрелками) посредством индуктивно-резонансного переноса. Молекулы с энергией Sm -состояний большей, чем аналогичная энергия биолюминесцептного эмиттера (Рис.3.1 в), и отсутствием перекрытия спектров их поглощение с биолюминесценцией могут быть акцепторами энергии только с высших электронно-возбужденных состояний эмиттера, если они заселяются при биолюминесцентном процессе. Эксперименты по изучению возможности получения сенсибилизированной флуоресценции в биолюминесцентной системе в присутствии молекул такого типа могло бы подтвердить или опровергнуть гипотезу активности высших электронно-возбужденных состояний в биолгоминесцентном процессе (Кудряшева и др., 1991).
Действие органических окислителей на процессы миграции водорода в полиферментных биолюминесцентных системах
Исходя из использованных в экспериментах концентраций, можно видеть, что средние расстояния между эмиттером биолюминесценции и молекулой красителя имеют величину порядка сотен ангстрем (при условии равномерного распределения молекул в объеме), В такой модели средние расстояния между предполагаемыми донором и акцептором энергии возбуждения значительно превышают привычные величины ферстеровских радиусов, а значит эффективность безызлучательного переноса энергии пренебрежимо мала. Очевидно, Биолюминесцентная реакционная смесь в присутствии молекул красителя пе является истинным раствором с равномерно (хаотично) распределенными компонентами. Вероятно, существуют слабые взаимодействия между компонентами, изменяющие распределение молекул в растворе и тем самым влияющие на эффективность переноса энергии электронного возбуждения с эмиттера биолюминесценции.
Таким образом, по спектрам биолюминесценции в присутствии молекул, характеризующихся значительным перекрытием спектров их поглощения со спектрами биолюминесценции, был сделан вывод об осуществлении индуктивно-резонансного переноса энергии с возбужденного эмиттера биолюминесценции. Донором энергии в этом процессе являются низшие флуоресцентные, состояния эмиттера. Возможность зарегистрировать перенос энергии между эмиттером биолюминесценции и красителем (на фоне абсорбции биолюминесценции) обеспечивается также соотношением квантовых выходов в этой донорно-акцепторной паре: для эмиттера он равен 0.33 (Lee, 1993), а для ксантеновых красителей - 0.8-0.9 (Табл.2.3). Т.е. акцептор излучает практически каждый перенесенный на себя квант энергии, в то время как на молекуле донора дезактивируются с излучением только треть всех возбужденных электронных состояний.
Влияние химических соединений первой группы на спектральные свойства биолюминесценции аналогичны действию желтого флуоресцентного белка (YFP) - природного вторичного эмиттера биолюминесценции у некоторых видов бактерий. Эффективность переноса энергии на YFP в биолюминесцентной реакции гораздо выше, чем на низкомолекулярные красители, использованные в данной части работы. Это отражает важную роль белковых компонент как координаторов взаимодействия, создающих оптимальные расстояния и ориентацию для взаимодействующих флуорофоров.
Внешний эффект тяжелого атома в биолюминесцентной системе удобно изучать с использованием рядов галогенидов (органических и неорганических), т.к. данные соединения содержат галогены с различными атомными массами при относительно близких химических свойствах. В молекулах, содержащих тяжелые атомы, спин-орбитальная связь значительна. В этих условиях сохраняется полный угловой момент, и правило отбора (AS O) по спину S электронной оболочки теряет свою силу. При этом внутримолекулярный синглет-триплетный переход S - (Рис.3, la, б, в) перестает быть запрещенным, что сказывается на характеристиках люминесценции. Подобные эффекты можно индуцировать в молекулах, используя растворители, содержащие тяжелые атомы. Такой эффект получил название внешнего (межмолекулярного) эффекта тяжелого атома (Тшто, 1979; Lakowicz, 1999). Перечисляя явления, сопряженные с эффектом тяжелого атома, можно назвать следующие явления: увеличение поглощения на переходах Ti —S0; уменьшение времени жизни фосфоресценции; уменьшение квантового выхода флуоресценции; возможность увеличения квантового выхода фосфоресценции.
Эффекты тяжелого атома были исследованы несколько десятилетий назад для случая фотовозбуждения флуоресцентных красителей в растворах. Логично предположить, что эти эффекты будут наблюдаться и в системах с химическим возбуждением в присутствии белка, т.е. а биолюминесцентных системах, Сложность изучения подобных явлений в биологических системах связана с тем, что помимо чисто физических эффектов, вызванных присутствием тяжелого атома, биолгомипесцентиая система характеризуется рядом других свойств, определяемых течением химической реакции и активностью фермента.
Похожие диссертации на Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции
