Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы.
I. Лекарственная резистентность злокачественных опухолей 6
1. Механизмы развития множественной лекарственной резистентности 8
1). Роль Р-гликопротеина в формировании множественной лекарственной устойчивости 8
2). Белок-переносчик, ассоциированный с множественной лекарственной резистентностью 10
3). Глутатион-зависимые механизмы развития резистентности 12
4). Роль ДНК-топоизомераз в лекарственной устойчивости 15
5). Другие механизмы развития резистентности 16
2. Способы преодоления резистентности 18
II. Роль оксида азота в организме человека 24
1. Участие оксида азота в различных биологических процессах 25
2. Биохимические основы цитотоксичности оксида азота 28
3. Оксид азота, рост опухолей и метастазирование 29
4. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота 33
5. Возможности использования доноров оксида азота в химиотерапии опухолей 37
Глава II. Материалы и методы исследования 42
Глава III. Результаты исследования и их обсуждение 48
1. Модулирующее лекарственную резистентность действие доноров оксида азота 48
2. Механизмы модулирующего МЛУ действия N0-донора из группы органических нитратов (препарата NMO) 71
Выводы 89
Список литературы 90
- Роль Р-гликопротеина в формировании множественной лекарственной устойчивости
- Другие механизмы развития резистентности
- Оксид азота, рост опухолей и метастазирование
- Механизмы модулирующего МЛУ действия N0-донора из группы органических нитратов (препарата NMO)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из серьезнейших проблем современной химиотерапии опухолей является возникающая в процессе лечения частичная или полная резистентность к терапевтическому воздействию. Развитие резистентности опухолевых клеток одновременно к нескольким химиотерапевтическим препаратам с разной структурой и механизмами действия получило название множественной лекарственной резистентности. Множественная лекарственная устойчивость опухолей (МЛУ) возникает в результате естественной селекции и адаптивных изменений к действию химиотерапевтического препарата либо является исходно свойственной данным клеткам. Многие из лекарств, с которыми связан феномен МЛУ, широко используются в химиотерапии опухолей, что значительно ограничивает эффективность лечения.
МЛУ способна развиться очень быстро и определяется различными молекулярными изменениями, возможно сочетание нескольких механизмов устойчивости в одной клетке. Кроме того, имеет большое значение и гетерогенность популяции опухолевых клеток. Механизмы развития резистентности зависят от используемого препарата.
Препараты, применяемые в настоящее время в клинике для предупреждения развития резистентности или снижения степени резистентности обладают различными побочными эффектами, вследствие этого применение таких препаратов существенно ограничено.
Таким образом, поиск и разработка способов и методов модулирования лекарственной резистентности опухолей являются весьма актуальными.
В последнее время серьезное внимание исследователей привлекает двухатомный радикал - монооксид азота. Оксид азота - переносчик, регулирующий многочисленные процессы жизнедеятельности.
Опубликовано огромное количество данных о его воздействии на ряд патологических процессов в организме, включая и рост злокачественных опухолей. Оксид азота обладает уникальной способностью вызывать или блокировать апоптоз - генетически запрограммированную гибель клеток, результатом которой является избавление от нежелательных клеток, в том числе и опухолевых. Баланс между проапоптотическими и антиапоптотическими сигнальными механизмами, их активация или подавление при участии N0 определяет либо защитное действие оксида азота на клетки, либо инициируемый им переход клеток в состояние апоптоза. Отсюда вытекает еще один аспект значения NO при онкологических заболеваниях. N0 обладает и другими видами воздействия на опухоль, включая ангиогенез и метастазирование.
В настоящее время опубликовано некоторое количество исследований посвященных изучению взаимосвязи оксида азота и лекарственной резистентности. Некоторые исследователи, например, связывают начало развития МЛУ со сниженным синтезом оксида азота (Riganti С, Miraglia Е., et al., 2005). Показано, что ингибирование синтеза оксида азота при гипоксии способствует увеличению резистентности опухолевых клеток (Matthews N.E., Adams М.А., et al., 2001). Кроме того, применение доноров оксида азота может стимулировать экспрессию опухолевого супрессора гена р53 (Messmer U.K., et al., 1994).
Роль оксида азота в биологии злокачественных опухолей и возможность применения доноров оксида азота в терапевтических целях остается до конца непонятой и требует дальнейшего изучения.
Цель исследования. Целью настоящей работы являлось исследование возможности использования доноров оксида азота в качестве модуляторов лекарственной резистентности опухолей с целью повышения эффективности химиотерапии.
Задачи исследования.
Исследовать возможность использования доноров оксида азота для повышения химиотерапевтической чувствительности резистентных опухолей в эксперименте in vivo.
Изучить влияние донора оксида азота на процесс развития лекарственной резистентности в эксперименте in vivo.
Исследовать возможные механизмы модулирующего резистентность действия доноров оксида азота.
Научная новизна работы. Впервые в системе in vivo исследовано действие NO-доноров, как модуляторов лекарственной резистентности: впервые показана способность донора оксида азота из группы органических нитратов задерживать развитие резистентности в системе in vivo; впервые показана способность доноров оксида азота повышать чувствительность резистентных экспериментальных опухолей с фенотипом МЛУ к цитостатикам в субтерапевтических дозах; впервые показано, что эффект повышения чувствительности резистентных опухолей к действию цитостатиков усиливается с увеличением числа NO-донирующих нитратных групп.
Практическая значимость работы.
Прикладной аспект работы связан с открывающимися возможностями использования доноров оксида азота для преодоления клинически неблагоприятного феномена МЛУ опухолей. Практическое применение доноров оксида азота в качестве адьювантов при цитостатической терапии опухолей будет способствовать задержке развития резистентности и повышению химиотерапевтической чувствительности.
Полученные данные открывают новое направление в исследовании биологической активности оксида азота, имеющее как фундаментальное, так и прикладное значение.
Роль Р-гликопротеина в формировании множественной лекарственной устойчивости
Способность опухолевых клеток обеспечивать низкую внутриклеточную концентрацию лекарств, недостаточную для их цитотоксического действия, является одним из механизмов резистентности клеток к противоопухолевым препаратам. Предложенная Dano модель энергозависимого насоса, выбрасывающего препараты из MDR клеток (7), полностью подтвердилась. Установлено, что увеличение скорости обратного транспорта лекарств, наблюдаемое в клетках с MDR фенотипом, коррелирует с гиперэкспрессией в них Р-гликопротеина (8). Эксперименты по трансфекции ДНК-последовательности комплементарной Р-гп показали, что экспресии Р-гп достаточно для развития MDR фенотипа (9). Р-гликопротеин — это транспортный белок с молекулярной массой 170 кДа, функционирующий как энергозависимый насос и осуществляющий выброс препаратов из клетки против градиента концентрации (10). Резистентность, связанная с Р-гп, требует около 10% от энергообмена клетки (11). Для того, чтобы транспортировать одну молекулу субстрата через клеточную мембрану, необходим гидролиз 2-3 молекул АТФ (12, 13). Первичная последовательность Р-гп была установлена с помощью анализа кДНК. Белок состоит из 1280 аминокислотных остатков и содержит два практически одинаковых домена, каждый из которых имеет 6 трансмембранных сегментов и цитоплазматический домен NBD (nucleotide-binding domain). В каждом домене имеется гидрофильная и гидрофобная область (14,15). Гидрофобные участки связываются с субстратом и осуществляют его прохождение через липидный бислой клеточной мембраны. Гидрофильные участки находятся на внутренней стороне мембраны, где происходит связывание и гидролиз АТФ (16, 17). Р-гп транспортирует через плазматическую мембрану широкий спектр структурно разнородных природных субстратов и пептидов, включая антрациклиновые антибиотики, алкалоиды Винка, актиномицин Д, эпиподофиллотоксины, таксол, колхицин, этидиум бромид, грамицидин Д и др. (18, 19, 20). С помощью электронной криомикроскопии кристаллов мембранного Р-гп внесена ясность в понимание структуры мультилекарственных транспортеров и принцип их функционирования (21). Р-гп относится к ABC семейству (ATP Binding Cassette) мембранных переносчиков (22, 23), насчитывающему более сотни транспортных белков. Известны два гена Р-гп человека - mdrl и mdr3, три гена мыши - mdrl, mdr2, mdr3. Гены человека гомологичны между собой на 80%. Гены mdr3 человека и мыши также имеют высокую степень сходства. Однако, к формированию MDR имеют отношение только ген mdrl человека и mdrl и mdr3 мыши (23, 24-26). Показано, например, что амплификация и/или гиперэкспрессия гена mdrl является причиной появления резистентности в клетках мыши лейкоза Р388 и меланомы В16. Уровень Р-гп мРНК коррелировал со степенью резистентности. Высокий уровень экспрессии mdrl гена наблюдался в резистентных клетках, низкий уровень экспрессии был характерен для чувствительных клеток (27). Кроме того, Choi с соавторами было доказано, что мутация mdrl гена влияет на спектр веществ, транспортируемых Р-гп (28).
При исследовании экспрессии mdrl гена в нормальных тканях человека Р-гп был обнаружен в печени (29), кишечнике (30), почках (31), плаценте (32), эндотелиальных клетках мозга (33), где он, как полагают, защищает клетки от ксенобиотиков. По-видимому, Р-гп переносит также мембранные липиды (34) и экспрессируется в В-лимфоцитах (35) и в клетках молочной железы (36).
Исследования, проведенные на многих линиях раковых клеток животных и человека, резистентных к одному или группе противоопухолевых препаратов (MDR фенотип), позволили установить, что в большинстве случаев (но далеко не всегда) развитие лекарственной резистентности опухолевых клеток сопровождается гиперэкспрессией Р-гп. Результаты многочисленных работ очень подробно проанализированы в ряде обзоров (14,37). Высокий уровень экспрессии Р-гп был установлен в огромном количестве новообразований человека с врожденной и приобретенной резистентностью. Именно с этим связывают слабый клинический эффект при лечении, например, острой миелоидной и лимфобластной лейкемии, детской саркомы и нейробластомы, остеосаркомы и рака груди (38,39,40).
В резистентных клетках был обнаружен также другой тип транспортной системы - белок, ассоциированный с множественной лекарственной резистентностью или MRP (MDR-Related Protein). Этот гликопротеин был идентифицирован в клетках мелкоклеточного рака легкого, резистентных к доксорубицину, как продукт вновь обнаруженного гена, связанного с формированием MDR (41). Из клеток HL 60, резистентных к адриамицину и обладающих фенотипом MDR, но не содержащих Р-гп, был выделен протеин с молекулярной массой 190 кДа (42). Позже было выяснено, что масса этого белка колеблется от 180 до 195 кДа, он преимущественно локализован в цитоплазматической мембране и функционирует, подобно Р-гп, как трансмембранный энергозависимый насос, откачивающий цитостатики против градиента концентрации (43). Сравнение первичных структур MRP и Р-гп показало, что между ними существует лишь незначительная гомология (41).
Исследования in vitro показали, что MRP является энерго-зависимым глутатион-коньюгирующим переносчиком, который функционирует, используя мембранные везикулы клеток (44,45). Как было показано, Р-гп связывает и транспортирует неизмененные химиотерапевтические препараты и другие соединения из клеток (46). Продемонстрировать прямой активный транспорт некоторых немодифицированных препаратов с помощью MRP , используя обогащенные этим белком везикулы плазматических мембран и в условиях эксперимента, схожих с работами по Р-гп, не оказалось возможным. Однако, было показано, что MRP активно транспортирует винкристин и афлатоксин В в присутствии физиологических концентраций глутатиона. По мнению авторов, транспорт соединений посредством MRP сопровождается котранспортом редуцированного глутатиона, что может служить подтверждением различия механизмов резистентности, обусловленной MRP или Р-гп (47).
Было проведено исследование зависимости чувствительности клеток мышиных фибробластов к химиотерапевтическим препаратам от активности генов, кодирующих Р-гп и MRP. Инактивация генов, кодирующих Р-гп, вызывала потерю этого белка клетками, при этом увеличивалась чувствительность к антрациклинам в 4 раза, к винкаалкалоидам в 3 раза, к таксолу в 16 раз. Клетки, потерявшие и Р-гп и MRP, были гиперчувствительны к большему числу препаратов. Чувствительность к антрациклинам увеличивалась в 6-7 раз, эпиподофиллотоксину в 4-7 раз, винкаалкалоидам в 28 раз. Авторы приходят к выводу, что даже низкие уровни экспресии Р-гп и MRP могут значительно влиять на чувствительность клеток к широкому спектру клинически важных препаратов (48). Следует отметить, что количество вновь открытых белков-переносчиков членов ABC-семейства постоянно растет. Например, недавние исследования подтвердили участие BCRP (breast са ncer г esistant protein) в формировании резистентности в клетках рака груди человека (49).
Злокачественная трансформация клеток сопровождается существенным усилением их биохимической защитной системы. При этом происходят разнонаправленные изменения активности ферментов метаболизма и детоксикации ксенобиотиков. В пренеопластических узелках печени, например, снижается активность цитохрома Р-450 по сравнению с нормальными клетками, что приводит к угнетению метаболизма лекарственных препаратов (50), а наблюдаемое резкое повышение экспрессии глутатиона (GSH ) и глутатион-Б-трансферазы (GST), указывает на значительное возрастание активности ферментов детоксикации лекарств (51). Именно GSH-зависимая ферментная система детоксикации играет наиболее важную роль в развитии MDR раковых клеток и является фактором резистентности, не связанным с функционированием системы обратного транспорта лекарств из клетки посредством Р-гп.
Другие механизмы развития резистентности
Между чувствительными и резистентными опухолевыми клетками наблюдаются различия во внутриклеточном распределении противоопухолевых препаратов. Так, в чувствительных клетках препарат в основном аккумулируется в нуклеоплазме, тогда как в MDR клетках - в органеллах и вакуолях (85) . Во многих случаях резистентные опухолевые клетки имеют более развитую везикулярную сеть, что позволяет им пространственно нейтрализовать лекарственные препараты и/или выводить их путем экзоцитоза (86). Компартментализация лекарств и продуктов их метаболизма внутри клетки также считается одним из механизмов лекарственной резистентности. Возникло предположение, что существуют некие белки-носители, которые связываются с препаратами после их проникновения в клетку и доставляют их в разные компартменты, содержащие либо лизосомы, либо систему детоксикации, либо Р-гликопротеин (87).
При анализе 25 резистентных линий клеток карциномы прямой кишки человека было обнаружено, что во всех MDR-сублиниях происходит компартментализация препаратов во внутренние цитоплазматические структуры. Ингибирование этого процесса верапамилом, фенотиазином, квинидином позволяло полностью снять MDR-фенотип (88).
Способность верапамила изменять распределение даунорубицина и доксорубицина в клетках HL-60, резистентных к антрациклиновым антибиотикам, была продемонстрирована и другими авторами (89). Они считают, что препараты, снимающие резистентность способны изменять распределение антрациклинов в гидрофобно-гидрофильных компартментах клетки.
Известны и некоторые другие механизмы, которые могут вносить вклад в развитие резистентности. К ним можно отнести изменения структурного порядка и фосфолипидного состава плазматических мембран, которые могут оказывать существенное влияние на транспорт противоопухолевых препаратов к внутриклеточным мишеням (90, 91), а также изменения внутриклеточного рН (92).
Цитотоксический эффект многих противоопухолевых препаратов осуществляется посредством их связывания с ДНК и нарушением ее функционирования. В таком случае резистентность к действию препарата может зависеть от состояния системы репарации повреждений ДНК. Резистентные клетки содержат увеличенные количесва ДНК-полимеразы альфа и бета, ферментов, участвующих в репарации повреждений (93, 94), тогда как исходно гиперчувствительные клеточные линии характеризуются ослабленной активностью ДНК-полимераз (95, 96). Увеличение репарации ДНК было обнаружено, например, в устойчивых к цисплатину клетках L1210 и Р388 лейкемии мышей, карциномы яичника крыс, карциномы яичника и толстого кишечника человека (97). Обработка резистентных к цисплатину клеток афидиколином, ингибитором ДНК-полимераз, возвращает клеткам чувствительность к cPt (95,98).
Нарушение регуляции генов, участвующих в контроле за процессом апоптоза, также может быть причиной резистентности. Резистентность к ДНК- тропным препаратам (адриамицину и актиномицину Д), антиметаболитам (5-фторурацилу) связана с функционированием онкосупрессора р53 и генов семейства bcl-2 (99, 100). В клинических исследованиях выявлена корреляция между высокой устойчивостью различных опухолей к химиотерапевтическим препаратам и уровнем экспрессии антиапоптотических генов bcl-2 и bcl-xL (101, 102). На экспериментальных моделях показано, что сверхэкспрессия bcl-2 и bcl-xL может привести к возникновению МЛУ (103, 104). Описаны также клеточные линии, у которых фенотип МЛУ обусловлен сразу несколькими из вышеупомянутых механизмов, т.е. имеет мультифакторную природу (105).
Исследование, проведенное на культуре клеток карциномы прямой кишки, показало, что в резистентных штаммах этой линии клеток значительно уменьшена чувствительность к индукции апоптоза с помощью оксалиплатина. По мнению авторов, резистентность в данном случае вызвана дефектом апоптотического пути (106).
Оксид азота, рост опухолей и метастазирование
Участие NO в цитотоксической активности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам было одним из первых свойств, описанных для этой молекулы. Было установлено, что образование NO вызывает нарушение дыхания в клетках лимфомы (214) и оказывает цитостатический эффект на опухолевые клетки (215). Как in vitro, так и in vivo опухолевые клетки провоцируют функциональные изменения в популяции нормальных макрофагов, вызывая у последних появление супрессивных свойств и увеличение синтеза NO (216). В макрофагах мышей после прививки фибросаркомы Meth-KDA существенно увеличивался синтез цитотоксических агентов - оксида азота и фактора некроза опухоли TNFa (217). Как известно, развитие опухоли в организме сопровождается появлением различных субстанций, выделяемых малигнизированной тканью. Иммунная система отвечает на эти стимулы активацией макрофагов, которые начинают вырабатывать увеличенные количества цитотоксических факторов. Например, показано, что выделение интерферона-Р (INF р) из опухолевых клеток аденокарциномы поджелудочной железы мышей стимулирует выработку оксида азота в клетках "хозяина" (животного опухоленосителя) (218). В ответ на цитотоксическую активность макрофагов опухолевые клетки вырабатывают несколько видов супрессорныех агентов -интерлейкин-10 (IL-10), факторы роста опухолей TGF р и TGF pi, простагландин Е2 (PGE 2), которые могут ослаблять образование N0 и уменьшать противоопухолевую активность макрофагов (219-221).
Макрофаги, выделенные из животных, имеющих опухоли, могут иметь пониженную способность продуцировать NO, а также ослабленную противоопухолевую активность (222-224). У онкологических больных обнаружена взаимосвязь между повышением уровней IL-10 и TGF pi, снижением продукции NO и размером опухоли (221). Наличие этой взаимосвязи указывает на то, что этот свободный радикал является частью противоопухолевой защиты, осуществляемой иммунной системой. Некоторые исследователи считают оксид азота основным медиатором цитотоксичности, индуцированной макрофагами (225).
Цитостатическое или цитотоксическое действие N0 на опухолевые клетки было продемонстрировано многочисленными исследованиями (212, 213, 215), при этом значительные количества оксида азота производились экспрессированной iNOS, например, в купферовских клетках, клетках-киллерах, микроглиальных и эндотелиальных клетках (223-231). Однако, установлено, что во многих видах опухолей наблюдается экспрессия разных форм NOS, и N0 может выступать в роли важного медиатора роста и развития самой опухоли. Повышенный уровень NOS обнаружен в разных формах рака человека (232-235). Иммуногистохимическим методом была, например, показана гиперэкспрессия INOS mRNA, самого фермента и N0 в карциноме толстой кишки человека, причем авторы связывают иммуносупрессивные свойства, проявляемые опухолью, с повышенным производством оксида азота (236).
Было показано увеличение скорости роста, плотности сосудов и инвазивности клеток опухоли человека при трансфекции в них гена iNOS, а введение высоко селективного ингибитора iNOS ограничивало инвазию и скорость роста трансфецированной опухоли и других опухолей, экспрессирующих эту изоформу. В подобных случаях ингибирование NO синтеза внутри опухоли может обеспечить полезную противоопухолевую терапию, предотвращая ангиогенез, инвазию и метастазирование (237).
Однако, другие исследователи иллюстрируют прямо противоположное действие оксида азота на рост опухолей. Так, например, было изучено влияние эндогенно синтезированного NO на рост клеток меланомы в культуре и in vivo. Если клетки меланомы трансфецировали геном iNOS или стимулировали экспрессию iNOS цитокинами, это приводило к снижению роста клеток in vitro и ограничению развития и метастазирования in vivo (238,239).
Возможно, противоречивость этих данных (способность N0 в одних случаях ингибировать опухолевый рост, а в других - стимулировать его) связана с концентрациями оксида азота. По мнению Chinje и Stratford, низкие концентрации N0 могут являться про-опухолевыми, тогда как высокие концентрации будут иметь противоположный эффект (240). Так, например, другими исследователями было показано, что концентрация N0 больше 80 микромолей вызывает значительный лизис опухолевых клеток (241). Рост, развитие и метастазирование опухоли в значительной степени зависят от образования сети кровеносных сосудов, обеспечивающих питание и дыхание раковых клеток. Поэтому вопрос об ангиогенезе в метастазировании является одним из основных в онкологии. Многие исследователи сходятся в признании роли оксида азота в физиологическом и патофизиологическом ангиогенезе. N0 способствует выживанию и развитию клеток эндотелия капилляров посредством активации эндотелиальной NOS, поднятия уровня cGMF, активации МАРК (mitogen activated protein kinase) (242).
Было показано, что NO-донор, нитропруссид натрия, и предшественник в синтезе NO, L-аргинин, ингибируют, а ингибиторы NO-синтазы N-монометил-Ь-аргинин (L-NMMA) и N-нитро-Ь-аргинин метилэфир (L-NAME) стимулируют образование новых сосудов, т. е. N0 может быть эндогенным супрессором ангиогенеза (243).
Подавляющее большинство опухолевых клеток, попадающих в кровеносное русло, гибнет, некоторое количество клеток выживает и способно к образованию метастазов. Это выживание неслучайно и частично является следствием обратной корреляции между экспрессией эндогенной iNOS (продукцией N0) и потенциалом метастазирования. Прямое доказательство роли фермента iNOS в метастазировании предоставили данные проведенных экспериментов по переносу генов iNO-синтазы с разной функциональной активностью в клон мышиных клеток с высокой метастазирующей способностью и низким уровнем iNOS. При трансфекции функционального гена не наблюдалось образование метастазов и сама опухоль росла медленно, тогда как при внесении инактивированного гена опухоль оставалась быстро растущей и высоко метастазирующей. Кроме того, трансфекция интерферона-бета подавляла формирование опухоли и рост метастазов, что было, возможно, связано с экспрессией iNOS и NO производством в макрофагах хозяина. Подавление метастазов, таким образом, может быть достигнуто индукцией iNOS экспрессии с помощью иммуномодуляторов или прямой доставкой iNOS гена в опухолевые клетки с помощью липосом или вирусных векторов (244). Можно привести и другие примеры, демонстрирующие участие оксида азота в защите организма от опухоли. Гиперэкспрессия iNOS , вызванная с помощью трансфекции гена iNOS, тормозила опухолевый рост и полностью подавляла метастазы мышиной фибросаркомы с высокой метастатической активностью (245). Инфицирование клеток рака почки человека ретровирусом, содержащим мышиный ген iNOS, вызывает продукцию высоких уровней N0, что приводит к аутоцитотоксичности этих клеток, подавлению их туморогенности и способности к метастазированию (246). Очевидные сложности и противоречия не являются препятствием для наличия уже общепризнанной точки зрения на существование естественного защитного механизма против рака, значительное место в котором занимает эндогенный синтез оксида азота. Получены данные, вновь подтверждающие это. Задержка клеток меланомы в печени вызывает быстрое локальное освобождение оксида азота, который вызывает апоптоз клеток меланомы и ингибирует их последующее развитие в печеночные метастазы (247).
Механизмы модулирующего МЛУ действия N0-донора из группы органических нитратов (препарата NMO)
Введение препарата NMO увеличивает количество апоптотических клеток в чувствительном штамме в 4 раза, в резистентном в 2,5 раза, при этом наблюдается также увеличение количества некротических клеток в чувствительном штамме в 4 раза, в устойчивом - в 2,8 раза.
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что NO-донор вызывает индукцию апоптоза в клетках чувствительного лейкоза Р388 и полученного нами резистентного штамма Р388/ЦФ, что приводит к активации этого процесса по сравнению с уровнем апоптоза, наблюдаемого в контроле.
Известно, что химиотерапевтические препараты являются неспецифическими индукторами апоптоза. Показано, что клетки лимфосаркомы подвергаются апоптозу в ответ на действие циклофосфана (312), цисплатин и доксорубицин также индуцируют апоптотическую гибель клеток (313, 314). Значительное увеличение апоптоза после проведения курса химиотерапии наблюдалось также у пациентов с опухолями молочной железы (315). Из анализа накопленных экспериментальных данных следует, что нарушение апоптотической программы ведет к снижению лекарственной чувствительности опухолей. Основные компоненты апоптотической системы, присутствующие в клетке, могут быть направлены в нужную сторону с помощью определенных воздействий. Показано, что оксид азота индуцирует биохимические признаки апоптоза в различных клетках, включая макрофаги (259), бета-клетки (316, 317), тимоциты (318). Накоплено большое количество экспериментальных данных, демонстрирующих влияние и эндогенного оксида азота и NO-доноров на пролиферацию и индукцию апоптоза в опухолевых клетках (238, 239, 247, 277, 279, 319, 320). Ранее было показано, что саназол (АК-2123), являющийся NO-донором, усиливает апоптоз, вызванный облучением (321).
Сопоставляя эти факты можно предположить, что одним из возможных механизмов реализации модулирующего влияния NO на чувствительность резистентных опухолей может быть его проапоптотическое действие. 2. Исследование экспрессии белка р53. С целью выяснения механизма действия изучаемого в настоящей работе донора оксида азота на развитие лекарственной резистентности опухолей и изменения их чувствительности была исследована экспрессия белка р53 в клетках чувствительного и резистентного штаммов лейкоза Р388 при действии NMO. Белок р53 - ключевой элемент контроля клеточного ответа на различные виды стресса: активация р53 в ответ на стресс, включая повреждения ДНК различными химическими агентами, приводит к остановке пролиферации или апоптозу. Белок р53 осуществляет важную функцию в организме, удаляя поврежденные и, следовательно, потенциально опасные клетки. Показано, что нарушения функции р53 приводят к изменениям чувствительности опухолевых клеток к воздействию химических препаратов, в частности к развитию МЛУ. Исследование, проведенное Национальным Институтом Рака США, выявило прямую корреляцию между статусом р53 в клетках и их чувствительностью к цитотоксическому действию лекарств. Клетки с мутантным р53 чаще были резистентны к химиотерапевтическим препаратам с разными механизмами действия, чем клетки, обладающие р53 дикого типа (322).
Некоторые данные свидетельствуют о том, что оксид азота может способствовать активации опухолевого супрессора белка р53. Этот вывод был сделан на основании результатов, продемонстрировавших, что N0 способствует удержанию белка р53 в ядре, что препятствует его протеосомной деградации (323). Показано также, что увеличение синтеза N0 с помощью индуцированной цитокинами NO-синтазы или применение N0-доноров стимулирует экспрессию опухолевого супрессора гена р53 (324).
Известно, что NO-доноры способны стимулировать экспрессию опухолевого супрессора гена р53 (324). Полученные нами данные позволяют предположить, что наблюдаемое нами проапоптотическое действие донора оксида азота не связано с р53-зависимыми молекулярными механизмами, а имеет другой механизм действия.
Как уже отмечалось в литературном обзоре, значительный вклад в развитие резистентности вносится изменениями структуры и фосфолипидного состава плазматических мембран, что оказывает существенное влияние на транспорт противоопухолевых препаратов к внутриклеточным мишеням (90,91). В связи с этим мы предположили, что одной из причин наблюдаемого нами увеличения химиотерапевтической чувствительности резистентных опухолей могут являться структурно 1 функциональные изменения мембранного аппарата клетки.
Кроме того, активация растворимой гуанилатциклазы и увеличение уровня cGMF, как и многие аспекты кальциевого обмена, связаны с действием оксида азота (199-201). Это послужило основанием для изучения механизма действия NMO на структуру биологических мембран и функции мембраносвязанных ферментов.
Наиболее изученными мембраносвязанными ферментами являются транспортные АТФазы, в частности Са - зависимая Mg - активируемая АТФаза, осуществляющая перенос ионов кальция из клеток против градиента концентрации за счет гидролиза АТФ. Этот фермент участвует также в активном транспорте во внутриклеточные везикулы саркоплазматического ретикулума (325). Известно также, что активность многих мембранных ферментов существенно зависит от микровязкости окружающего их липидного бислоя. Например, при изменении температуры одновременно изменяются микровязкость липидного слоя в везикулах и активность Са -АТФазы (326, 327). В свою очередь, внутриклеточная концентрация ионов Са + может играть роль в лекарственной резистентности. Показано, например, что измененный внутриклеточный обмен кальция способствует развитию резистентности к таксолу в клетках немелкоклеточного рака легких (328). Известно также, что в ряде случаев в клетках с фенотипом МЛУ наблюдается повышенное содержание ионов Са (329).
