Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы стр.14
1.1. ДНК-диагностика неврологических заболеваний стр. 14
1.2. Патогенез БП стр.22
1.2.1 .Клиническая характеристика БП стр.23
1.2.2. Патоморфологические признаки БП стр.26
1.2.3.Диагностика БП стр.30
1.2.4.Средовые факторы риска БП стр.35
1.3.Наследственные формы БП стр.38
1.3.1.Что называют генами БП? стр.38
1.3.2.Ген 5Ж:Л... стр.42
1.3.3.Ген LRRK2 стр.43
1.3A.GBA -ген высокого риска развития БП стр.48
1.3.5.Гены аутосомно-рецесивного ювенильного паркинсонизма стр.50
1.3.6.Гены атипичных форм паркинсонизма стр.55
1.3.7.Гены предрасположенности к БП стр.57
1.4. Альфа-синуклеин в патогенезе БП стр.60
1.4.1 .Структура и свойства альфа-синуклеина стр.61
1.4.2.Функции альфа-синуклеина стр.62
1.4.3.Агрегация альфа-синуклеина и нейродегенерация стр.64
1.4.4.Модели паркинсонизма на животных на основе экзогенной экспрессии гена SNCA стр.66
1.5.Предполагаемый механизм гибели дофаминергических нейронов при БП стр.69
1.5.1. Гипотетические молекулярные механизмы нейродегенерации при БП стр.69
1.5.2. Роль программируемой клеточной гибели (апоптоза) в патогенезе БП стр.79
1.6. Лимфоциты периферической крови как объект исследования при изучении патогенеза нейродегенеративных заболеваний стр.85
Глава 2. Материалы и методы стр.89
2.1. Характеристика обследованных групп стр.89
2.2. Выделение ДНК стр.91
2.3. Идентификация мутаций при наследственных формах БП стр.92
2.3.1. Стратегия поиска мутаций в генах наследственных форм БП стр.92
2.3.2.Ген PARK2 стр.94
2.3.3. Ген SNCA стр.101
2.3.4. Ген LRRK2 стр.104
2.3.5. Ген GBA стр.113
2.4. Идентификация ОНП в генах SNCA, МАРТ, PON1 стр. 116
2.5. Измерение активности параоксоназы 1 стр. 121
2.6. Выделение фракции лимфоцитов периферической крови стр. 122
2.7. Оценка уровня экспрессии генов методом количественной ПЦР в режиме реального ремени стр. 123
2.7.1. Оценка уровня мРНК гена SNCA стр.123
2.7.2. Оценка уровня мРНК гена FAS и BCL2 стр.125
2.8. Измерение уровня альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови стр. 128
2.9. Оценка уровня апоптоза лимфоцитов периферической крови стр. 130
2.10. Статистическая обработка данных стр. 133
Глава 3. Результаты и обсуждение стр.134
3.1. Генетические основы наследственных форм БП стр. 134
3.1.1. Спектр мутаций в гене PARK2 у пациентов с БП с ранним началом стр. 134
3.1.2.Мультипликации гена SNCA у пациентов с семейной формой БП стр.146
3.1.3. Мутаций в гене LRRK2 у пациентов с семейной и спорадической формой БП , стр. 149
3.1.4. Клиническое течение G2019S -ассоциированной БП стр.160
3.1.5. Генетические факторы риска развития БП и их влияние на возраст начала Ц Х2-ассоциированной БП стр. 168
3.1.6. Частота мутаций гена GBA (N370S и L444P) у пациентов с БП стр.176
3.1.7. Алгоритм проведения ДНК-диагностики наследственных форм БП стр.184
3.2. Молекулярные характеристики лимфоцитов периферической крови в группах пациентов с мутациями в генах LRRK2 и GBA стр.192
3.2.1.Альфа-синуклеин лимфоцитов периферической крови у пациентов с G2019S ассоциированной БП стр. 192
3.2.2. Влияние клинических характеристик на уровень мРНК гена SNCA и белка альфа-синуклеина стр.206
3.2.3. Апоптоз лимфоцитов периферической крови у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA стр.213
Заключение стр.231
Выводы стр.231
Практические рекомендации : стр.233
Список литературы стр.2
- ДНК-диагностика неврологических заболеваний
- Гипотетические молекулярные механизмы нейродегенерации при БП
- Идентификация ОНП в генах SNCA, МАРТ, PON1
- Алгоритм проведения ДНК-диагностики наследственных форм БП
Введение к работе
Актуальность проблемы
Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным
нейродегенеративным заболеванием. Частота встречаемости БП среди лиц старше 60 лет составляет 1-2 %. В то же время около 17 % случаев заболевания обнаруживается до 50 лет, т. о. поражая трудоспособную часть населения.
Развитие симптомов БП (ригидность мускулатуры, тремор, брадикинезия, нарушение позы) коррелирует с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции мозга, приводя к снижению концентрации дофамина в стриатуме. В цитоплазме дегенерирующих нейронов обнаруживаются специфичные белковые включения — тельца Леви. Следует отметить, что симптомы БП проявляются при гибели 60-80 % дофаминергических нейронов черной субстанции мозга человека.
В настоящее время БП относят к классу конформационных болезней мозга,
т. е. к заболеваниям, в генезе которых лежит нарушение конформации
и внутриклеточного процессинга определенного белка, приводящее
к формированию белковых агрегатов, инициирующих процесс
нейродегенерации. Предполагается, что в основе молекулярных механизмов БП
лежит нарушение фолдинга и полимеризация белка альфа-синуклеина (SNCA),
основного компонента телец Леви, приводящая к селективной гибели
дофаминергических нейронов черной субстанции. Однако полностью механизм
нейродегенерации при БП остается неясным. По этой причине не существует
лабораторных диагностических тестов БП, и доля случаев неправильной
постановки диагноза достигает 25 %. Выяснение механизма нейродегенерации
при БП является важной задачей не только для понимания общего патогенеза
заболевания, но и для разработки превентивной терапии. При этом одним из
актуальных подходов изучения молекулярно-генетических основ БП
представляется исследование моногенных форм заболевания
с известной этиологией.
Открытие локусов, ответственных за развитие наследственных форм БП, в последнее пятнадцатилетие позволило по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза и диагностики БП. Хотя в большинстве случаев БП имеет спорадический характер, у 15 % пациентов выявляется семейная форма БП, когда заболевание имеет место у нескольких родственников из одного или разных поколений. Сегодня картировано 18 локусов, ассоциированных с БП (PARK1-PARK18) (Bekris, 2010). Доказано, что мутации по крайней мере в пяти генах определенно приводят к развитию менделирующих форм заболевания: гены альфа-синуклеина (SNCA) и обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2) ассоциированы с развитием аутосомно-доминантных форм БП, а гены паркина (PARK2), DJ1, PINK1 - с аутосомно-рецессивной формой заболевания с ранним началом (Cookson, Bandmann, 2010). К генам высокого риска БП относят ген глюкоцереброзидазы (GBA) (Hardy, 2010).
Выявление молекулярной этиологии наследственных форм БП позволяет говорить о проведении ДНК-диагностики этих форм заболевания. При проведении ДНК-диагностики и последующего медико-генетического
консультирования необходимо знание о спектре мутаций генов наследственных форм, характерных для данной популяции, частотах распространения данного заболевания, а также особенностях его течения. Комплексное молекулярно-генетическое исследование наследственных форм БП, с одной стороны, позволяет разработать алгоритм ДНК-диагностики наследственных форм заболевания, с другой стороны, молекулярно-генетическая характеристика наследственных форм БП впервые дает возможность создания репрезентативной группы пациентов с однородной этиологией заболевания. Такая группа пациентов может быть использована как для исследования молекулярных механизмов развития БП, так и для выявления биомаркеров развития более общих форм заболевания.
Цель исследования
Целью работы явилось молекулярно-генетическое исследование наследственных форм БП.
Задачи исследования
-
Разработать методы анализа делеций/мультипликаций гена SNCA, экзонов гена PARK2, а также точковых мутаций в гене LRRK2.
-
Выявить мутации в генах SNCA, PARK2, LRRK2, GBA у пациентов с БП.
-
Охарактеризовать клинические особенности течения наследственных форм БП, ассоциированных с мутациями в генах SNCA, PARK2, LRRK2, GBA. Выявить генетические факторы риска развития БП и оценить их влияние на возраст начала /,&/ІО-ассоциированной формы заболевания.
-
Разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственных форм БП.
-
Исследовать уровень мРНК гена SNCA и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП.
-
Оценить апоптоз лимфоцитов периферической крови у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA.
Научная новизна
Данная работа, включившая молекулярно-генетический анализ генов SNCA, PARK2, LRRK2, GBA у пациентов с БП, является первым комплексным исследованием генетических основ наследственных форм БП в России. Впервые описан спектр мутаций в генах LRRK2 и PARK2 у пациентов с БП в России. У пациентов с семейной формой БП впервые в мире описана мутация Т4838С (V1613A), приводящая к развитию ЇЛЛ/Г2-ассоциированной БП с преобладающим тремором. Впервые в России проведено сопоставление течения заболевания у пациентов с выявленными мутациями в гене LRRK2 с пациентами БП отличной этиологии с отсутствием мутаций в этом гене. Отмечено преобладание побочных эффектов от терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами в виде дистоний, дискинезий и психопатологии среди пациентов с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) в гене LRRK2. Впервые в России среди пациентов с БП выявлена форма заболевания,
обусловленная дупликацией гена SNCA. Показано, что наличие мажорных мутаций гена GBA (L444P, N370S) повышает риск развития БП в отечественной популяции.
Впервые исследована ассоциация ОНП в генах SNCA, МАРТ, PON1 и активности параоксоназы 1 с возрастом начала ІЛЛЮ-ассоциированной БП, показано отсутствие влияния исследуемых параметров на клиническое течение /,/УЖ?-ассоциированной БП. Впервые для отечественной популяции выявлена ассоциация аллеля G (генотипы AG и GG, гз356219) гена SNCA и генотипа АА (rsl052553) теш МАРТ с БП.
Разработаны простые методы идентификации мутаций в гене LRRK2 (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T, V1613A) на основе ПЦР и рестрикционного анализа, идентификации мутаций, связанных с изменениями копийности гена/экзонов гена в генах SNCA и PARK2 на основе количественной ПЦР в режиме реального времени. Впервые предложена схема проведения ДНК-диагностики наследственных форм БП в России.
Впервые у пациентов с /і/?К2-ассоциированной формой БП проведено исследование уровня альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови. Показано снижение альфа-синуклеина лимфоцитов крови у пациентов с ЛЛАТ2-ассоциированной БП по сравнению с группой пациентов со спорадической БП и контролем. Впервые проведена оценка апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA и выявлено повышение уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов в исследуемых группах. Показано стабильное увеличение уровня мРНК гена FAS у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП.
Теоретическое и практическое значение работы
Изучение механизма нейродегенерации при моногенных формах БП, в частности при наиболее распространенной 1ЛЛАГ2-ассоциированной форме заболевания, позволяет ближе подойти к пониманию патогенеза спорадических форм БП. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных основ патогенеза БП. Проведенные исследования позволяют предположить, что снижение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови характеризует особенность патогенеза только LRRK2-ассоциированной БП, в то время как повышение спонтанного апоптоза лимфоцитов является более общей характеристикой, присутствующей при различных формах заболевания.
Разработанный метод генотипирования наиболее распространенной среди семейных случаев БП мутации G6055A (G2019S) в гене LRRK2 может быть использован в клинической практике при выявлении /,Л/?АГ2-ассоциированных форм БП. Также в клинической практике может быть использован предложенный алгоритм проведения ДНК-диагностики наследственных форм заболевания. Проведение ДНК-диагностики наследственных форм БП может быть полезно с целью проведения дифференциальной диагностики заболевания. Выявленные в настоящем исследовании особенности течения БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA, следует принимать во
внимание при проведении медико-генетического консультирования. Проведение ДНК-диагностики пациентам с БП и членам их семей позволит осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутации до начала проявления клинических симптомов заболевания.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Мутация G6055A (G2019S) в гене LRRK2 является наиболее распространенной причиной развития наследственных форм БП в Северо-Западном регионе России.
-
В группе пациентов с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) в гене LRRK2, наблюдается повышенная частота побочных эффектов при применении Л-ДОФА-содержащих препаратов.
-
Мутации гена GBA (L444P и N370S) играют важную роль в формировании предрасположенности к развитию БП. Наличие мутации L444P повышает риск развития БП в возрасте до 50 лет.
-
Мутации в гене PARK2 не являются значимой причиной развития БП с началом заболевания в возрасте от 40 до 50 лет.
-
Наличие мутаций в гене LRRK2 ассоциировано со снижением уровня белка альфа-синуклеина, повышением уровня мРНК гена FAS и усилением спонтанного апоптоза в лимфоцитах периферической крови у пациентов с БП.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конгрессах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и школах: «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002); на совещании общества «GEO-PD» (Париж, Франция, 2005); V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); XVIII Всемирном конгрессе по неврологии (Сидней, Австралия, 2005); Международной летней школе по нейрогенетике поведения (Москва, 2005); конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2005); конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2006); 20-ом конгрессе европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Вена, Австрия, 2007), Европейской конференции по генетике человека (Ницца, Франция, 2007); на Совещании общества «GEO-PD» (Трондхейм, Норвегия, 2008); 12-ом конгрессе Европейской федерации неврологических ассоциаций (Мадрид, Испания, 2008); II Всемирном конгрессе по вопросам неврологии (Афины, Греция, 2008); I Национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения (Москва, 2008); научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2008); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); 9-й Международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона (Прага, Чехия, 2009); научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2009); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010); на
1-ом конгрессе «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010); VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); Европейском конгрессе по генетике человека (Ґетеборг, Швеция, 2010); 14-ом конгрессе Европейской федерации общества неврологов (Женева, Швейцария, 2010); 15-ом конгрессе Европейской федерации неврологических ассоциаций (Будапешт, Венгрия, 2011); 24-ом конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Париж, Франция, 2011), II Национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения (Москва, 2011).
Результаты диссертационного исследования внедрены в практику учебной и лечебной работы ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» и ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН соответственно.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, из них 14 статей в журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 1 монография, 4 главы в монографиях, 8 статей в сборниках и 30 тезисов.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц, иллюстрирована 56 рисунками и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, включающий 444 источника (49 - на русском языке и 395 - на иностранном).
ДНК-диагностика неврологических заболеваний
С открытия двойной спирали ДНК ученым Джеймсом Уотсоном и его коллегой Френсисом Криком прошло чуть более пятидесяти лет, а достижения в области чтения и расшифровки генетического кода превзошли границы воображения. Начало XXI века ознаменовалось успешным завершением программы «Геном человека» и полной расшифровке генома человека [Lander, 2011; Иванов, Киселев, 2005]. Расшифровка структуры генома человека привела к сенсационному открытию. Оказалось, что в геноме человека не более 32 000 генов, что в несколько раз меньше количества белков. При этом белок-кодирующих генов человека не превышает 20 - 25 000. Наиболее вероятная оценка - 21 000. Продуктами остальных генов являются молекулы РНК. Интересно, что число генов человека не намного превосходит число генов у более простых организмов, например, круглого червя Caenorhabditis elegans (20 000) или мухи Drosophila melanogaster (14 000) и значительно уступает количеству генов в геноме некоторых растений, например, риса (37000). У человека процент сходства по нуклеотидным последовательностям ДНК между индивидуумами разных этнических групп составляет 99,9%. Изменчивость на нуклеотидном уровне приходится на однонуклеотидные замены, называемые однонуклеотидным полиморфизмом (ОНП) (SNPs - single nucleotide polimorphisms) и на различие числа копий повторяющихся элементов генома. Количество идентифицированных ОНП в геноме человека достигло 10 миллионов. Их общее число оценивается в 10-13 миллионов. ОНП встречается через каждые 250-400 п. о., и они составляют основу качественного генетического полиморфизма. Количественный полиморфизм представлен, главным образом, вариациями числа микро- и миыисателлитных повторов. Однако это не единственный вид количественной генетической изменчивости.
Показано, что около 12% всех генов человека присутствуют более чем в двух копиях [Бочков, 2002; Баранов, 2009]. Интенсивное изучение генома продолжилось и после завершения проекта «Геном человека». В таблице 1 представлены основные характеристики генома человека.
Сегодня, с развитием новейших технологий молекулярно-генетического анализа, в частности, методов параллельного секвенирования, определение полного сиквенса генома человека, или кодирующей части генома (экзома) не является трудно разрешимой задачей. Принципиально сократилось время получения информации о нуклеотидной последовательности индивидуальных геномов: если на расшифровку первой версии генома человека понадобилось несколько лет, то сегодня геном любого человека может быть расшифрован в пределах нескольких недель. Существенно сократилась и стоимость этой процедуры. Еще в 2003 году подобные работы стоили 300 миллионов долларов, потом подешевели до одного миллиона в 2007 году и сегодня расшифровка генома человека оценивается приблизительно в 5000 долларов. Интересно, что уже сегодня ряд коммерческих фирм, включая отечественные, предлагают выявление около 500 000 ОНП индивидуального генома всего за 1000 долларов (http://www.23andme.com; http://www.i-gene.ru/index.php). Нужно отметить, что упомянутые проекты носят скорее коммерческий и развлекательный характер. Что же столь бурное развитие новых технологий и внедрение их в клиническую практику дает современной медицине?
В настоящее время примеры реального использования геномной информации в клинической медицине в основном касаются наследственных моногенных (менделирующих) заболеваний. Моногенными называются болезни, обусловленные мутациями в одном гене. В соответствии с современными представлениями разнообразие моногенных заболеваний достаточно велико. Их количество в электронной базе данных "Менделевское наследование у человека" (OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) достигает 5000. В данной базе для каждой болезни суммированы клинические и молекулярно генетические данные (о картировании, идентификации гена, практических возможностях генодиагностики). База находится в Национальном центре биотехнологической информации (США) и постоянно пополняется. На 3 октября 2011 наследственные причины развития (известен ген) были описаны для более 3000 моногенных заболеваний (http://omim.org/statistics/entries). Статистические данные по количеству описанных наследственных заболеваний человека на 3 октября 2011 года приведены в таблице 2.
Успехи в области расшифровки структуры генома человека нашли реальное воплощение в клинической практике. В настоящее время разработаны и используются генетические тесты для более 1000 нозологии. В России ДНК-диагностика наследственных заболеваний проводиться в ряде городов, наиболее успешно в Москве, С.Петербурге, Уфе, Томске. В медико-генетическом НЦ РАМН (Москва) проводиться ДНК-диагностика более 200 различных наследственных заболеваний (http://www.med-gen.ru).
К числу наиболее известных моногенных болезней относятся фенилкетонурия, муковисцидоз, адреногенитальный синдром, гемофилия А и В, миодистрофия Дюшенна/Беккера, спинальная мышечная атрофия и другие болезни. Их частоты варьируют в пределах от 1 на 2-3 до 1 на 10-20 тысяч новорожденных
Другие наследственные заболевания встречаются с более низкими частотами - 1 на 100-300 тысяч или 1 на миллион. Однако суммарная отягощенность наследственными болезнями варьирует от 1.5 до 3.5 на 1000 [Гинтер, 2002, Степанов, 2010]. Не все моногенные заболевания проявляются в детском и ювенильном возрасте. В качестве примера, следует отметить такие заболевания, как хорея Гентингтона, наследственные формы БП и болезни Альцгеймера, клиническое проявление которых приходится на 30-60 или более лет [Горбунова, Пчелина, Шварцман, 2011]. В последние годы знания о генетических основах наследственных болезней нервной системы существенно расширяются. В самом общем виде все наследственные заболевания нервной системы могут быть подразделены на два большие группы [Иллариошкин, 2002; Вахарловский, Романенко, Горбунова, 2009]:
1) Заболевания, при которых поражения нервной системы составляют ведущий симптомокомплекс, «ядро» клинической картины. Это наследственные нервно-мышечные болезни (мышечные дистрофии, врожденные миопатии, миотонические синдромы, и т.п.), наследственные болезни ЦНС (наследственные спастические параплегии, наследственные атаксии, наследственные деменции, наследственные экстрапирамидные заболевания (хорея Гентингтона, наследственные формы БП, болезни Альцгеймера, наследственные эпилепсии).
2) Заболевания с системными наследственными дефектами метаболизма, при которых, наряду с поражением различных органов и тканей, в качестве одного из проявлений может наблюдаться вовлечение нервной системы. Классическими примерами являются различные «болезни накопления» (гликогенозы, лизосомные болезни), наследственные болезни обмена, связанные с дефектом обмена аминокислот, пуринов, порфиринов, углеводов и.т.п. (фенилкетонурия, галактоземия).
По мере изучения наследственных заболеваний нервной системы, накапливается все больше данных о генетической гетерогенности заболеваний (существование генетической гетерогенности в рамках одной клинико-морфологической формы). Под влиянием новых генетических данных о природе наследственных заболеваний нервной системы претерпевают изменения подходы к их классификации. Идентификация генов, разработка метод ДНК-диагностики позволяет на качественно новом уровне решить проблему построения четкой и упорядоченной классификации, предполагая определение прямой взаимосвязи между конкретной нозологической формой и повреждением определенного гена, лежащего в основе болезни. Ярким примером может служить группа аутосомно-доминантных атаксий, систематизация которых до недавнего времени была чрезвычайно затруднена. Сегодня показано, что вариабельность клинико-анатомической картины аутосомно-доминантных атаксий обусловлена генетической гетерогенностью данной группы заболеваний. На сегодня установлено как минимум 16 генов, мутации в которых обуславливают развитие доминантных атаксических синдромов. Стала возможна молекулярно-генетическая классификация, основанная на данных ДНК-диагностики. При этом каждому гену доминантных атаксий присваивается соответствующий условный индекс: СЦА1, СЦА2 и т.д. По такому же принципу строится классификация наследственных спастических параплегии [Иллариошкин, 2002; Вахарловский, Романенко, Горбунова, 2009].
Гипотетические молекулярные механизмы нейродегенерации при БП
Один из подходов к пониманию молекулярных основ патогенеза распространенных спорадических форм заболевания - исследование его редких наследственных форм. Существует ряд примеров продуктивности данного подхода. Так, открытие мутаций в гене предшественника амилоида АРР при редких наследственных формах болезни Альцгеймера способствовало развитию гипотезы «амилодного каскада» [Hardy, Selkoe, 70 2002], что, в конечном итоге, привело к разработке новых подходов к терапии спорадических форм заболевания, проходящих фазу клинических испытаний сегодня [Taymans, Cookson, 2010].
Современное представление о механизме гибели дофаминергических нейронов при БП также основывается на данных, полученных при изучении наследственных форм заболевания. Важнейшим прорывом в изучении этиологии и патогенеза БП явилось открытие в 1997 году молекулярной этиологии наследственной формы БП, обусловленной мутациями в гене SNCA [Polymeropoulos et al., 1997] и последующее описание альфа-синуклеина как основного белка телец Леви [Spiliantini, Crowther, Jakes, et al., 1998]. Эти открытия привели к современному представлению о БП как о конформационной болезни мозга. Конформационные болезни представляют различные формы амилоидозов, характеризующиеся накоплением в тканях множественных фибриллярных агрегатов различных белков, устойчивых к протеолизу. Подробно о роли альфа-синуклеина в патогенезе БП см. главу 1.4. Какова же роль продуктов других генов наследственных форм БП в формировании патологического каскада событий, приводящих к селективной нейродегенерации дофаминергических нейронов, и оказывают ли они влияние на формирование токсических агрегатов альфа-синуклеина?
В качестве генов наследственных форм БП сегодня рассматривают в основном пять генов (альфа-синуклеина (SNCA), паркина (PARK2), DJ-1, PINK1, LRRK2) [Tong, Shen, 2009]. Ген GBA является геном высокого риска развития БП [Hardy, 2010]. Предполагается, что продукты этих могут быть вовлечены во множество процессов, включая убиквитин-зависимую протеосомную и шаперон-обусловленную деградацию белков, аутофагию, ответ на окислительный стресс, фосфорилирование белков, работу митохондрий, белковый фолдинг, синаптическую передачу сигнала.
Мутации в генах аутосомно-рецессивных форм паркинсонизма с ранним началом связывают в настоящее время в первую очередь с дисфункцией митохондрий [Bueler, 2009] (рис. 10). PINK1 - митохондриальная киназа, локализованная на внешней мембране митохондрий. Предполагается, что совместно с белком паркин (Е2 убиквитин лигаза) PINK1 играет ключевую роль в функционировании митохондрий, регулируя процесс митофагии [Shapira, Gegg, 2011]. Цитозольный белок паркин при усилении окислительного стресса и в ответ на изменение мембранного потенциала митохондрий транслоцируется из цитоплазмы внутрь митохондрий. Этому процессу предшествует фосфорилирование паркина киназой PINK1. Транслокация паркина в митохондрии нарушена у нокаутных по гену PINK1 мышей [Kim, et al., 2008]. В норме паркин участвует в контроле митофагии путем убиквитинирования митофузина 1 и 2 [Hardy, 2010]. Таким образом, паркин селективно транслоцируется в поврежденные митохондрии при деполяризации мембраны и способствует устранению поврежденных митохондрий путем митофагии, защищая клетку от окислительного стресса [Banrjee, Beal, Thomas, 2010]. У дрозофил с нокаутом гомологов генов PARK2 и PINK1 выявлено нарушение летательных функций и стерильность у самцов, ассоциированная с дисфункцией митохондрий, соответственно, в клетках мускулатуры и сперматозоидах [Cookson, 2010]. Все мутации генов PARK2 и PINK1, выявленные у пациентов с БП, ассоциированы с потерей функциональной активности кодируемых белков, что приводит к нарушениям процесса устранения митохондрий с деполяризованной мембраной путем митофагии и усилению окислительного стресса [Cookson, 2010]. Интересно, что введение митохондриального токсина параквата также способствует транслокации паркина в митохондрии [Youle, Narendra, 2011]. Последние данные указывают на то, что белок DJ1 также функционирует в связке PINKl/паркин. DJ1 может окислятся в ответ на повышение окислительного стресса и влиять на функционирование комплекса I дыхательной цепи митохондрий [Hayashi, Ishimori, 2009]. В конечном итоге, существующие данные убедительно показывают участие паркина, PINK1 и DJ1 в контроле нормального функционирования митохондрий [Thomas, et al., 2010].
Значительно труднее представляется объяснение роли мутаций доминантных генов БП в патогенезе заболевания. С одной стороны, выявление сегрегации мультипликаций гена SNCA в семьях с аутосомно-доминантной БП показываю, что увеличение концентрации альфа-синуклеина достаточно для развития заболевания [Singleton, 2003]. Обе мутации А53Т и АЗОР ускоряют фибрилизацию альфа-синуклеина [Conway, 2000].Предполагается, что токсичностью обладают растворимые олигомерные формы альфа-синуклеина, которые могут встраиваться в мембраны, нарушая их проницаемость [Xu et al., 2002; Kostka et al., 2008], хотя данное предположение нуждается в подтверждении in vivo. Более того, вышесказанное относиться к редким моногенным формам БП. Какие факторы могут влиять на агрегацию альфа-синуклеина остается неясным. Предполагается, что помимо мутаций гена SNCA (точковые, мультипликации нормальной последовательности гена), агрегации альфа-синуклеина может способствовать нарушение деградации белка в клетке, экзогенные нейротоксины (например, паракват, ротенон), а также химические модификации самого альфа-синуклеина (рис.11). Еще сложнее представляется объяснение роли LRRK2 в патогенезе заболевания, поскольку физиологические субстраты этой киназы остаются неизвестны. Известные мутации гена LRRK2 связывают с нарушением ГТФазной и киназной активности фермента. Большинство исследователей показывают двукратное повышение киназной активности для мутации G2019S [Greggio, Cookson, 2009]. В исследованиях in vitro показано, что гиперэкспрессия LRRK2 дикого типа приводит к клеточной смерти, укорачиванию нейритов, агрегации белков, гибели клетки посредством окислительного стресса и повышению уровней внутриклеточных реактивных видов кислорода (ROS), а гиперэкспрессия LRRK2 с патогенными мутациями, особенно с мутацией G2019S, усиливает проявление большинства этих процессов [Smith et al., 2006; West et al., 2007; MacLeod et al., 2006].
Трансгенные мыши с гиперэкспрессией гена LRRK2 дикого показывали усиление выброса дофамина в стриатуме и гиперактивность, в то время как гиперэкспрессия LRRK2 с мутацией G2019S приводила к дефициту дофамина в стриатуме [Li et al., 2010]. Интересно, что дисфункция синапсов и снижение выброса дофамина наблюдалось также у мышей с гиперэкспрессией гена SNCA человека [Garcia-Reitbork et al., 2010]. Неожиданными оказались данные, полученные при исследовании нокаутных по гомологу гена LRRK2 мышей.
Нокаутные животные обнаруживали нарушение систем клеточной деградации белков и резкое накопление альфа-синуклеина в почках [Tong et al., 2010]. Дрозофила как с нокаутом гомолога гена LRRK2, так и с гиперэкспрессией мутантного гена LRRK2 демонстрировали повышенную чувствительность к окислительному стрессу, указывая на то, что мутации в гене LRRK2 могут фенотипически проявляться как мутации, приводящие к потере функции [Taymans, Cookson, 2010]. Интересно, что ни одна модель на трансгенных мышах с гиперэкспрессией гена LRRK2 не демонстрировала возрастной нейродегенерации [Li et al., 2010]. При этом двойной трансген с гиперэкспрессией генов LRRK2 и SNCA, полученный Lin и соавт., обнаруживал резкую гибель дофаминергических нейронов уже в возрасте 1 месяца, указывая на совместную роль альфа-синуклеина и LRRK2 в нейродегенерации [Lin et al., 2009].
У большинства пациентов (около 60%) с БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2, при патоморфологическом исследовании выявляются альфа-синуклеин-положительные тельца Леви.
Идентификация ОНП в генах SNCA, МАРТ, PON1
Для идентификации ОНП в генах МАРТ и SNCA (rsl052553 и rs356219, соответственно) нами были разработаны оригинальные методы на основе ПЦР и рестрикционного анализа. Праймеры, условия ПЦР, использованные для выявления ОНП в генах МАРТ и SNCA, а также длина фрагментов ДНК после рестрикции указаны в таблице 16. Для выявления ОНП в гене МАРТ в верхнем праймере произвели замену G на С (подчеркнуто) для создания сайта рестрикции для эндонуклеазы Mspl в случае аллеля G. С целью идентификации ОНП гена МАРТ - rsl052553 (G/A) амплификацию проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей в конечной концентрации 67 ммоль Tris-HCl рН8.8, 16,6 ммоль (NH4)2S04, 0,1% тритон Х-100, 1,5 ммоль MgCl2, по 0,3 пмоль каждого праймера, 200 мкмоль dNTP, 1ед. Taq ДНК полимеразы и 3-10 нг геномной ДНК. Чтобы предотвратить испарение реакционной смеси в ходе ПЦР, наслаивали 10 мкл вазелинового масла. Амплификации проводили на термоциклере Терцик (ДНК-Технология, Москва).
После первоначальной денатурации при 94С в течении 5 мин., 30 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: денатурация: +92С - 1 мин, отжиг праймеров: +62С - 45 с, синтез: +72С - 45 с. После завершения 30 циклов амплификации проводили заключительный синтез при +72С в течение 7 мин. В результате ПЦР получали фрагмент размером 153 п.н. Для проведения рестрикционного анализа ПЦР продукт инкубировали с 1 ед. эндонуклеазы Mspl в 1х буфере Yango производства «Fermentas» при +37С в течение 24 часов. После рестрикции фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 8% полиакриламидном геле. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания бромистым этидием. Размер фрагментов ДНК после рестрикционного анализа в случае аллеля G составили 23 п.н. и 130 п.н. (рис.29).ПЦР фрагмент гена SNCA, содержащий ОНП rs356219, имел сайт рестрикции для эндонуклеазы МаеІІ, исчезающий в случае аллеля G. Для выявления ОНП гена SNCA - rs356219 (A/G) амплификацию проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей в конечной концентрации 67 ммоль Tris-HCl рН8.8, 16,6 ммоль (NH4)2S04, 0,1% тритон Х-100, 2,5 ммоль MgCl2, по 0,3 пмоль каждого праймера, 200 мкмоль dNTP, 1ед. Taq ДНК полимеразы и 3-10 нг геномной ДНК. Используемые для ПЦР праймеры указаны в таблице 16. После первоначальной денатурации при 94С в течение 5 мин, 30 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: денатурация: +92С - 1 мин, отжиг праймеров: +58С - 45 с, синтез: +72С - 45 с. После завершения 30 циклов амплификации проводили заключительный синтез при +72С в течение 7 мин. В результате ПЦР получали фрагмент размером 209 п.н. Для проведения рестрикционного анализа ПЦР продукт инкубировали с 0,5 ед. эндонуклеазы Tail (МаеІІ) в їх буфере R производства «Fermentas» при +65С в течение 24 часов. После рестрикции фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 8% ПААГ. Результаты визуализировали в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием. Размер фрагментов ДНК после рестрикционного анализа в случае аллеля G составил 73 п.н. и 136 п.н.
Идентификация полиморфных аллелей в гене PON1 (Q191R, rs662)
Для идентификации полиморфных аллелей в гене PON1 (Q191R) нами был использован метод разработанный нами ранее (Akhmedova (Pchelina) S.N., et al., 1999). Состав амплификационной смеси соответствовал описанному выше для идентификации мутаций в гене GBA. После первоначальной денатурации при 95С в течение 5 мин. 30 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: плавление 92С - 1 мин, отжиг 61 С - 1 мин, синтез 72С - 1 мин. После завершения 30 циклов амплификации проводили заключительный синтез при 72С в течение 7 мин. В результате амплификации получали площадку длиной 99п.н. С целью проведения рестрикционного анализа ПЦР продукт инкубировался с 1ед. Mbol в растворе, содержащем: Іммоль Tris-HCl рН 8.5, 1 ммоль MgCb, 10 ммоль КС1 и 0.01 млг/мл BSA при 37С в течение ночи.
Продукты рестрикции подвергались электрофоретическому разделению в 12% ПААГ с последующей окраской этидием бромидом и визуализацией в ультафиолете. Результаты генотипирования полиморфных аллелей гена PON1 в 191 позиции представлены на рисунке 30.
Идентификация полиморфных аллелей в гене PON1 (L54M, rs854560)
Для идентификации полиморфных аллелей L54M нами был разработан оригинальный метод, основанный на введении сайта рестрикции в амплифицируемый участок ДІЖ путем сайт-направленного мутагенеза в одном из праймеров [Akhmedova (Pchelina) et al., 2001]. С помощью компьютерного анализа (OHgo4) последовательности гена PON1 для амплификации соответствующего фрагмента гена нами была выбрана пара праймеров. Состав амплификационной смеси соответствовал описанному выше для детекции мутации в гене GBA. После первоначальной денатурации при 95С в течение 5 мин. 30 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: плавление 92С — 1 мин, отжиг 52С - 1 мин, синтез 72С - 1 мин. После завершения 30 циклов амплификации проводили заключительный синтез при 72С в течение 7 мин. В результате амплификации получали ПЦР продукт размером 123 п.н.
С целью проведения рестрикционного анализа ПЦР продукт инкубировался с 1 ед. Ncol в их буфере Yango производства «Fermentas» при 37С в течение ночи. В результате рестрикционного анализа в случае М аллеля получали фрагменты ДНК длиной 99 п.н. и 24 п.н. (рис. 31).
Алгоритм проведения ДНК-диагностики наследственных форм БП
Настоящее исследование является одним из самых больших по объему, проведенных на сегодня исследований по выявлению генетических основ развития наследственных форм БП в России. В исследование включено два гена аутосомно - доминантных форм БП (гены SNCA и LRRK2), ген аутосомно- рецессивной БП с ранним началом (ген PARK2), а также ген высокого риска развития БП - ген GBA. В ходе исследования собран банк ДНК, включающий образцы ДНК от 100 пробандов с наследственными формами БП, который является наибольшим из созданных при обследовании пациентов с БП в России.
В ходе проведения исследования нами показано, что мутации в гене PARK2 у пациентов с началом заболевания до 50 лет (большинство обследованных пациентов - 55 из 70 имело возраст начала заболевания в диапазоне от 40 до 50 лет), в основном, выявляются в гетерозиготном состоянии, даже при одновременной оценке делеций/мультипликаций отдельных экзонов гена PARK2 и точковых мутаций. Это затрудняет интерпретацию клинической значимости выявленных мутаций, не позволяя рассматривать их в качестве молекулярной основы этиологии заболевания. Дупликация гена SNCA выявлена только у одного пациента из 58 обследованных. Таким образом, гомозиготное носительство мутаций в гене PARK2 и мультипликации гена SNCA являются редкой причиной развития БП в России. Исследование мутаций в этих генах при проведении ДНК-диагностики БП является нецелесообразным. Нужно, однако, отметить, что в наше исследование по поиску мутаций в гене PARK2 были включены единичные пробанды с возрастом начала заболевания в интервале от 20 до 30 лет. Основываясь на данных зарубежных авторов, поиск мутаций в гене PARK2 следует включать в исследование при проведении ДНК-диагностики пациентам с ранним началом заболевания в возрасте до 30 лет [Klein, Djarmati, 2011]. Мутации в гене PARK2 были также выявлены в России у пациентов с аутосомно-рецессивной ювенильной формой БП [Illarioshkin et al., 2003].
Наиболее частой причиной развития БП в Северо-Западном регионе России являются мутации в гене LRRK2 (8% всех случаев с смейной формой БП). При этом выявляется мажорная мутация G2019S (7% всех случаев с смейной формой БП). В Европейских странах распространенность G2019S-ассоциированной БП имеет тот же уровень и составляет 5% [Giasson, Van Deerlin, 2008]. Если произвести перерасчет исходя из примерной распространенности БП в европейской популяции (частота 200 случаев на 100 000 человек населения) и из распространенности среди них семейных форм БП - 15% (от всех случаев заболевания), то встречаемость БП, обусловленной мутацией G2019S составит 5 случаев на 100 000 человек. Таким образом, частота G2019S - ассоциированной БП сопоставима с распространенностью таких неврологических заболеваний как множественная системная атрофия (4 на 100000), прогрессирующий надъядерный паралич (6 на 100000), а также с заболеваниями, обусловленными мутациями в одном гене - Хорея Генгтингтона (2 на 100000) и гемофилия А (5 на 100000). Учитывая простоту скрининга наиболее распространенной мутации G2019S, её выявление может иметь существенное диагностическое значение в практической неврологии, особенно в случаях со стёртой клинической картиной признаков, при дебют е заболевание в молодом возрасте. Превалирование мутации G2019S среди LftftO-ассоциированной БП характерное для всех популяций облегчает анализ клинического течения О20198-ассоциированной БП. Прямое секвенирование кодирующей области гена LRRK2 у 85 пробандов с наследственной формой БП, проведенное в настоящем исследовании, показало крайне низкую частоту других мутаций гена LRRK2 среди пациентов с наследственными формами БП в России. Таким образом, учитывая широкое распространение мутации G2019S среди семейных форм БП в России, следует рекомендовать скрининг этой мутации среди пациентов с БП, сообщающих о положительном семейном анамнезе заболевания. Включение в исследование других мутаций гена LRRK2 не целесообразно.
Не смотря на широкий диапазон возраста начала LRRK2-ассоциированной БП (в настоящем исследовании он составил 35-74 лет), в большинстве случаев данное заболевание обнаруживается возрасте более 40 лет. Возраст манифестации ЛКЛТ2-ассоциированной БП позволяет отделять данную форму заболевания от второй по частоте распространенности наследственной формы БП, обусловленной мутациями в гене PARK2, начало которой приходится на возраст до 40 лет [Lasage, Brice, 2009]. Зарубежные авторы рекомендуют проводить скрининг мутации G2019S всем пациентам с семейной историей заболевания с началом заболевания в возрасте более 40 лет [Healy et al., 2008]. Учитывая наши наблюдения, начало G2019S-ассоциированной БП может приходиться на более ранний возраст.
ДНК-диагностика БП (скрининг мутации G2019S LRRK2) может проводиться пациентам с подозрением на БП при наличии семейной истории заболевания с целью подтверждающей диагностики. В этом отношении показателен случай, зарегистрированный в семье PD3 в настоящем исследовании, где у пробанда III-1 проявления заболевания в дебюте (больна с 39 лет) были крайне нечёткими, смазанными: ригидность мускулатуры отсутствовала, тремор рук был мелким, усиливающимся при пробах на напряжение, но не на положение конечности, гипокинезия носила неясный характер. В течение долгого времени диагноз не выставлялся (фигурировал эссенциальный тремор или амиостатический синдром), пациентка не получала антипаркинсонической терапии, хотя её дееспособность прогрессивно снижалась. При проведении тщательной диагностики в МКДЦ СПбГМУ и последующим назначении фармакотерапии с минимальными дозами Л-ДОФА (200 мг в сутки) был получен хороший устойчивый результат, существенно улучшивший качество жизни, самообслуживание пациентки. Если бы генетическое исследование было проведено раньше (а не в возрасте 49 лет), сомнения неврологов были бы сняты, и адекватная терапия была бы начата своевременно.
С другой стороны возможно проведение ДНК-диагностики БП на преклинической стадии заболевания у родственников пробанда с выявленной молекулярной этиологией заболевания. В нашем исследовании в семье PD2 выявлен бессимптомный носитель мутации G2019S в возрасте 40 лет. В таких случаях может быть рекомендовано наблюдение невролога, а также периодическое обследование таких пациентов с привлечением методов нейровизуализации, в частности, таких как ПЭТ и транскраниальная сонография [Федотова и др., 2011]. Вопрос о ведении пациентов с выявленной мутацией G2019S LRRK2 на досимптоматической стадии заболевания представляется сложным и неоднозначным. В отсутствии нейропротекторной терапии досимптоматическое тестирование мутации остается дискутабельным. При проведении медико-генетического консультирования бессимптомных носителей мутации в гене LRRK2 следует принимать во внимание неполную пенетрантность мутаций. С другой стороны, относительная распространенность .LfcftO-ассоциированных форм БП среди семейных случаев заболевания впервые дает возможность исследования репрезентативных групп пациентов с однородной этиологией заболевания, что, несомненно, подчеркивает научную важность проведения ДНК-диагностики пациентам с семейной формой БП. Выделение групп риска развития БП дает неврологам шанс подбора терапии, способной отодвинуть клиническое проявления болезни. В настоящее время нет показаний по изменению схемы лечения пациента с диагнозом БП, при выявлении у него мутаций в гене LRRK2 [Healy et al., 2008]. Однако надо учитывать, что число пациентов с ilftftO-ассоциированной БП растет, а значит, появляются новые возможности для сопоставления течения заболевания и ответа на применяемую терапию у данной группе и в группе пациентов с БП отличной этиологии. Существует мнение (из устных сообщений), что при наличии мутации G2019S LRRK2 и снижении количества нейронов ЧС, выявленного методами ПЭТ или транскраниальной сонографии, до клинического проявления БП пациенту следует назначить препарат коэнзима Q. Сегодня усилия ученых направлены на поиски лекарственных средств, которые воздействовали бы на активность молекул (участников патологического процесса), таким образом, чтобы не только смягчались симптомы заболевания, но и останавливались дегенеративные процессы, ответственные за прогрессирование болезни. Несомненно, выявление носителей мутации в гене LRRK2 на досимптоматической стадии, их дополнительное обследование и участие таких бессимптомных носителей мутаций в клинических испытаниях по апробации новых нейропротекторных препаратов будет способствовать разработке новых подходов к профилактике и лечению БП.
Суммируя вышесказанное, при проведении ДНК-диагностики БП в первую очередь следует проводить скрининг мутации G2019S среди семейных форм БП. При проведении медико-генетического консультирования пациентов с этой мутацией, а также членам их семей, включая бессимптомных носителей мутации, следует учитывать возраст зависимую пенетрантность мутации, а также повышенную частоту осложнений при проведении терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами (рис. 47). Для уточнения этиологии заболевания у членов семей необходимо проводить детекции мутаций, поскольку, учитывая высокую частоту БП, нельзя исключать наличие фенокопии заболевания в пределах одной семьи [Klein etal., 2011].
Мутации в гене GBA распространены в исследуемой выборке пациентов с частотой сопоставимой с распространенностью мутации G2019S LRRK2 среди пациентов с семейной формой БП. В общей выборке пациентов суммарная частота мажорных мутаций гена GBA (L444P, N370S) составила 2.7%, в то время как частота мутации L444P среди пациентов с началом заболевания до 50 лет включительно практически достигала 7%. Мутации в гене GBA являются значимым фактором риска развития БП во многих популяциях, повышая риск развития заболевания в 5-6 раз [Sidransky et al., 2009]. В настоящем исследовании риск развития ранних форм БП у носителей мутации L444P возрастал в 15 раз! Учитывая высокие риски развития БП у носителей мутаций в гене GBA, следует рекомендовать скрининг наиболее распространенных мутаций гена среди пациентов с БП и их родственников. Досимтоматические носители мутаций могут наблюдаться у невролога и им, также как и в случае выявления мутаций в гене LRRK2, могут быть предложены дополнительные методы обследования (ПЭТ, транскраниальная сонография) с целью выявления заболевания на доклинической стадии. При проведении медико-генетического консультирования следует учитывать ранее начало заболевания у носителей мутации L444P, а также тот факт, что мутации в гене GBA (в отличие от мутаций в гене LRRK2) являются значительным, но, все же, фактором риска развития заболевания и обнаруживаются с низкой частотой в контрольных группах. В России частота мутации L444P среди индивидуумов с отсутствием неврологических заболеваний составила 0.4%. Указаний на клинические особенности течения БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA в литературе не имеется. Также не выявлены они и в настоящем исследовании.
Предложенная нами схема проведения ДНК-диагностики БП представлена на рисунке 47. Среди семейных случаев БП предлагается проводить скрининг мутации G2019S LRRK2. Выявление этой мутации среди спорадических случаев БП целесообразно проводить только в изолированных популяциях с высокой частотой распространенности этой мутации (евреи ашкенази, арабы северной Африки). Скрининг мутаций в гене GBA включен в предлагаемую схему на основании того, что он относится к генам высокого риска развития БП. [Shulman, 2011].
