Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Сведения о систематике серебряного карася Carassius auratus gibe Но 9
1.2. Биология и ареал распространения серебряного карася 10
1.3. Проблема таксономического статуса серебряного карася 17
1.4. Полиплоидия как фактор видообразования 20
1.4.1. Общие сведения о полиплоидии 21
1.4.2. Полиплоидия у рыб 24
1.4.3. Образование полиплоидного вида у рыб 24
1.4.4. Проблема определения полиплоидного статуса вида рыб 31
1.5. Проблема происхождения триплоидной формы серебряного карася 32
1.6. Кариологические исследования серебряного карася 34
1.7. Цитологические особенности гиногенеза у серебряного карася 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Сбор материала 40
2.2. Выделение ДНК 40
2.3. Амплификация ДНК 40
2.4. Электрофоретический анализ фрагментов рестрикции амплифицированных участков мтДНК 43
2.5. Анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции 46
2.6. Анализ уровня плоидности особей серебряного карася 47
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Выяснение возможной связи между уровнем плоидности и генетической изменчивостью серебряного карася 51
3.1.1. Определение плоидности особей серебряного карася Carassius auratus gibelio в приморской популяции 51
3.1.2. Анализ митохондриальной ДНК серебряного карася Carassius auratus gibelio в приморской популяции 52
3.2. Цитометрический анализ и цитоморфологические особенности диплоидных и полиплоидных особей Carassius auratus gibe По 64
3.3. Распространение диплоидной и триплоидной формы и филогеография мтДНК серебряного карася в Евразии 68
3.3.1. Половой состав популяций серебряного карася 69
3.3.2. Состав популяций серебряного карася по уровню плоидности 72
3.3.3. Филогеография мтДНК серебряного карася 74
3.4. Сравнительный анализ мтДНК серебряного карася Carassius auratus gibelio, золотого карася Carassius carassius и карпа Cyprinus carpio 86
Выводы 92
Список литературы
- Биология и ареал распространения серебряного карася
- Полиплоидия как фактор видообразования
- Электрофоретический анализ фрагментов рестрикции амплифицированных участков мтДНК
- Анализ митохондриальной ДНК серебряного карася Carassius auratus gibelio в приморской популяции
Введение к работе
После создания синтетической теории эволюции (СТЭ) в биологии сформировалась общепринятая точка зрения, что наиболее вероятным механизмом видообразования является аллопатрический, при котором появление географических барьеров для потока генов между эволюционно значимыми единицами - популяциями - приводит к накоплению генетических различий между ними, и, в конечном итоге, к формированию новых видов (Майр, 1968). Однако в последние годы накапливается все больше теоретических и экспериментальных данных, свидетельствующих о возможном существовании других 'Механизмов образования новых видов, включая симпатрическое, видообразование путем гибридизации (Dawley,1989), аллополиплоидии или автотетраплоидизации (Оно, 1973).
Одним из первых, кто обратил внимание на значимость полиплоидизации для эволюции видов, был С. Оно (Оно, 1973). Он полагал, что одних только изменений частот аллельных вариантов генов недостаточно для эволюции, и тем более - для появления новых признаков и функций у организма. Для появления новых функций и признаков необходимо появление новых генов, однако новые гены могут возникнуть только на основе уже существующих. Эта дилемма может быть преодолена в том случае, если происходят дупликации генов. При этом один из генов может сохранять свою функцию, в то время как дуплицированная копия гена, выйдя из-под действия естественного отбора, может в результате накопления мутаций приобрести новую функцию (Оно, 1973). Дупликации (амплификации) могут происходить на ограниченном участке генома, в пределах одной хромосомы как следствие неравного кроссинговера, но возможен путь полной дупликации генома - аллополиплоидизации, при котором происходит кратное увеличение всего генома (Оно, 1973). В последние десятилетия обнаружено, что действительно, как частичная дупликация генома, так и полиплоидизация, часто сопровождают эволюцию групп видов (Гребельный, 2005).
Процесс полиплоидизации в большинстве случаев сопровождается формированием этапа бесполого размножения. При переходе к бесполому размножению утрачивается способность к рекомбинации, что позволяет
5 удерживать и сохранять в поколениях сложившиеся удачные сочетания признаков и, таким образом, успешно конкурировать с диплоидными бисексуальными особями благодаря своему консерватизму, малой подвижности генотипического состава популяций.
Актуальность проблемы. Одним из модельных видов для изучения процессов видообразования путем полиплоидизации является серебряный карась Carassius auratus gibelio (Bloch, 1782). В восточных популяциях Евразии (Японские острова, Северный Китай, Дальний Восток России) обнаруживаются бисексуальная диплоидная и гиногенетическая полиплоидная формы серебряного карася в разных соотношениях. В Сибири, на Урале, в Средней Азии и в европейской части ареала вида встречается главным образом триплоидная форма, которая размножается с участием самцов сазана, плотвы, золотого карася и других карповых рыб (Головинская и др., 1965; Никольский, 1974; Кирпичников, 1987). Это дает основание предположить, что регион Дальнего Востока является местом их происхождения. До сих пор остаются неясными филогенетические отношения форм серебряного карася с различающимися типами репродукции. Их морфологическое сходство (Васильева, Васильев, 2000) свидетельствует либо о недавней дивергенции, либо о постоянно идущем процессе генетического обмена.
Перечисленные проблемы определили необходимость данного исследования, а также его цели и задачи.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сопоставление плоидности особей в выборках серебряного карася из водоемов Дальнего Востока, Средней Азии и европейской части России с данными по филогеографии серебряного карася для выяснения механизмов возможного генетического обмена между гиногенетической полиплоидной и бисексуальной диплоидной формами, а также уточнения места их дивергенции.
В работе поставлены следующие задачи:
1. Определить плоидность особей из выборок серебряного карася Carassius auratus
gibelio, полученных из водоемов Дальнего Востока, Средней Азии и европейской
части России.
2. Определить уровень внутривидовой изменчивости у серебряного карася
Carassius auratus gibelio на основании данных полиморфизма длин
рестрикционных фрагментов (ПДРФ) участков митохондриальной ДНК, кодирующих 3-ю и 4-ю субъединицы надоксиддегидрогеназы и две субъединицы (12S/16S) рибосомальной РНК, амплифицированных в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
3. Сопоставить данные по плоидности с данными по внутривидовой изменчивости мтДНК Carassius auratus gibelio.
4. Изучить распределение бисексуальной диплоидной и гиногенетической полиплоидной форм серебряного карася на значительной части его ареала.
Научная новизна работы. Результаты проведенного исследования расширяют представления о механизмах, обеспечивающих морфологическое и генетическое единство клональных и бисексуальных форм в диплоидно-полиплоидных комплексах рыб. Впервые выполнен анализ изменчивости митохондриальной ДНК двух форм серебряного карася Carassius auratus gibelio из популяций Дальнего Востока, европейской части России и Средней Азии, а также установлена связь между способом репродукции серебряного карася и генетической изменчивостью на основе данных анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов амплифицированных участков митохондриального генома. Впервые приведены молекулярно-генетические доказательства существования генетического обмена между двумя формами серебряного карася и предложена гипотеза о механизме трансформации триплоидной гиногенетической формы в диплоидную бисексуальную форму. Доказано, что Дальний Восток является местом дивергенции бисексуальной и гиногенетической форм.
Практическая значимость работы
Результаты работы могут быть использованы при разведении серебряного карася в аквакультуре, для выведения его новых клональных форм. Представленный материал может быть использован в курсе лекций по теории эволюции для студентов биологических специальностей ВУЗов.
Апробация работы. Основные результаты данной работы представлены на конференции «Современные проблемы биологической эволюции» к 100-летию Государственного Дарвиновского музея (Москва, 2007), конференции «Чтения памяти профессора Владимира Яковлевича Леванидова» (Владивосток, 2008), международной конференции "Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и
7 воспроизводство рыб" (Санкт-Петербург, сентябрь 2008), на ежегодных научных конференциях ИБМ (2005, 2008), лабораторных семинарах.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе, 2 статьи - в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Брыков Вл.А., Апаликова О.В., Елисейкина М.Г., Ковалев М.Ю. Изменчивость митохондриальной ДНК у диплоидной и триплоидной форм серебряного карася Carassius auratus gibelio II Генетика. 2005. Т.41, №6. С. 811-816.
Апаликова О.В. Филогенетический анализ двух форм серебряного карася Carassius auratus gibelio В loch в дальневосточных водоемах // Материалы конференции «Современные проблемы биологической эволюции» к 100-летию Государственного Дарвиновского музея. 17-20 сентября 2007, Москва. М.: Изд-во ГДМ, 2007. - С. 96-97.
Апаликова О.В., Елисейкина М.Г., Ковалев М.Ю., Брыков Вл.А. Сопоставление уровней плоидности и филогенетических линий митохондриальной ДНК у серебряного карася из популяций Дальнего Востока и Средней Азии // Генетика. 2008. Т.44, №7. - С. 1000-1008.
Апаликова О.В. Филогеография плоидности и митохондриальной ДНК у серебряного карася Carassius auratus gibelio в популяциях Евразии. Чтения памяти Владимира Яковлевича Леванидова. Вып.4. Владивосток: Дальнаука, 2008. - С. 398-397.
Апаликова О.В., Елисейкина М.Г., Брыков Вл.А. Цитометрический анализ и цитоморфологические особенности диплоидных и полиплоидных особей в смешанных природных популяциях серебряного карася Carassius auratus gibelio Bloch II Международная конференция "Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб", посвященная 100-летию со дня рождения выдающегося генетика и селекционера Валентина Сергеевича Кирпичникова. Тезисы докладов. 10-12 сентября 2008. Санкт-Петербург, 2008. - С. 30-31.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 123 страницах, иллюстрирована 23 рисунками и содержит 24 таблицы, 13 из которых
8 представлены в приложении. Список литературы содержит 160 источников, из них 52 на русском языке.
Благодарности. Автор считает своим приятным долгом выразить глубокую признательность своему руководителю Брыкову Владимиру Алексеевичу за внимательное и конструктивное руководство. Автор выражает благодарность группе ученых за помощь в сборе материала для настоящей работы: Вл.А. Брыкову, СМ. Долганову, М.Ю. Ковалеву, Н.Е. Поляковой, СВ. Фролову, Н.Е. Ламаш. За неоценимую помощь в работе и при обсуждении диссертации автор благодарит к.б.н. М.Г. Елисейкину и д.б.н. СВ. Фролова, а также весь коллектив лаборатории генетики ИБМ ДВО РАН за всемерную помощь и моральную поддержку.
Биология и ареал распространения серебряного карася
В пределах области распространения серебряный карась образует два подвида - типичного китайского серебряного карася {Carassius auratus auratus), населяющего воды Китая, и обыкновенного серебряного карася {Carassius auratus gibelio), живущего в бассейне Амура, реках Приморья и западнее - в Сибири, в бассейне Аральского моря и в Европе. Серебряного карася разводят в прудах, где не может жить карп, или подсаживают в карповые пруды.
По сравнению с золотым карасем, серебряный карась более привязан к текучим водам, встречается в больших реках, чаще обитает в крупных озерах. Растет серебряный карась обычно несколько быстрее обыкновенного золотого карася, достигает длины свыше 40 см, массы до 1 кг и более (Моисеев и др., 1981). Размеры самцов и самок очень близки, обычно самцы лишь немного мельче самок (Никольский, 1956).
В хорошо изученной популяции р. Амур выделяются две группы серебряного карася: мелкие медленнорастущие караси - из притоков и мелких озер верхнего течения - и более крупные быстрорастущие караси - из района среднего и нижнего течения реки. Кроме этих двух резко отличающихся форм, в пределах каждой из них имеются отдельные местные стада, которые отличаются как по своим морфометрическим характеристикам, так и по темпу роста (Никольский, 1956).
В бассейне р. Амур серебряный карась в летнее время придерживается озер, разливов и затонов, в русле реки встречается редко. В озерах и на разливах карась держится дольше других рыб, далеко не во всех озерах на зиму выходит в основное русло реки, а во многих озерах проводит и зиму. Мелкий карась верховьев р. Амур постоянно живет в озерах и, как правило, в русло р. Амур или его притоки не выходит. В зимний период в бассейне этой реки ведет неактивный образ жизни, концентрируясь, главным образом, в ямах на глубоких протоках (Никольский, 1956).
Исследования, проведенные в бассейне р. Амур, показали, что для серебряного карася характерна полифагия: в случае возникновения пищевой конкуренции с другими видами рыб, он может переключаться на другой корм, менее используемый другими рыбами, населяющими водоем (Боруцкий, 1950). Карась уже в раннем возрасте частично переходит на такой малоиспользуемый корм, как детрит, а у взрослых особей детрит является основным пищевым компонентом.
Половой зрелости самки обычно достигают в 3-4 года, самцы - в 2-4 года (Моисеев и др., 1981). В Амуре серебряный карась становится половозрелым в возрасте 3+, 4+, 5+ лет при размерах (AD) от 18 до 23 см (Никольский, 1956). У серебряного карася наблюдается необычное соотношение полов. Как правило, самцов бывает меньше, чем самок. Лишь в очень немногих водоемах оба пола встречаются почти в равном количестве. Часто встречаются популяции, в которых самцы совершенно отсутствуют или только изредка проявляются среди самок. По данным Щетининой в популяциях серебряного карася из водоемов Японии доля самцов в среднем составляет около 11.0%, в бассейне р. Амур - 20%, в Западной Сибири 2.3 - 20%), в Ростовской области - 0.0 - 6%, на Северном Кавказе - всего 0.1%) (Щетинина, 1956). В таких однополых популяциях размножение происходит при участи самцов других видов рыб, близких по экологии размножения (золотой карась, сазан, линь и др.). В потомстве получаются только самки, ничем не отличающиеся от материнских особей. Это происходит благодаря тому, что спермий, проникая в яйцеклетку, не оплодотворяет ее, а лишь стимулирует дальнейшее развитие яйцеклетки.
Изучение свойств спермиев самцов серебряного карася показало, что в том случае, когда самцы составляют ничтожную часть стада, их способность к оплодотворению икры ограничена: они играют роль, подобную роли чужих самцов. Самцы двуполых популяций не проявляют никаких признаков ограниченной способности к оплодотворению. Очевидно, обе категории самцов отличаются по своей наследственной природе; возможно, что и самки из двуполых популяций отличаются от самок однополых популяций (Бугаев и др., 2007). В то же время, интересно отметить, что однополые популяции под влиянием внешних условий могут изменяться, и в них могут появляться в значительном количестве самцы. Такое явление наблюдается при уменьшении кормовой базы водоемов, при периодических заморах, то есть при значительном ухудшении условий жизни. В этих случаях популяция реагирует замедлением темпа роста, появлением и возрастанием числа самцов, карликовостью и ранним созреванием самцов. Особи двуполых популяций отличаются лучшим выживанием, более ранним созреванием самок, но отстают в росте.
Плодовитость серебряного карася 160-400 (средняя - 250) тыс. икринок. Икрометание порционное. Серебряный карась начинает нерест, когда вода в водоеме прогревается до 14-15С. Нерест при температурах 9-1 ГС приводит к гибели почти всей икры (Щетинина, 1956). Нерест в нижнем течении Амура начинается в конце мая - начале июня (Никольский, 1956). В оз. Ханка нерест серебряного карася наблюдается с середины мая по июль (Берг, 1949а).
Впервые о местообитании серебряного карася упоминает Блох ВІ783 г. и приводит данные о его распространении: Центральная и Восточная Германия, Западная Польша.
Кесслер отмечал наличие серебряного карася в бассейне Днепра (Кесслер, 1856), а также в пресных водоемах Европы и умеренной полосы Сибири, упоминая полное отсутствие этого вида на Камчатке (Кесслер, 1877). Дыбовский отмечал обитание серебряного карася в бассейне Амура (Дыбовский, 1877). Сабанеев так ограничивал ареал серебряного карася: «У нас в России, он распространён до Архангельска, а в Финляндии до 64 - 65 с.ш.; его нет только, кажется, в Крыму и в Закавказье.
Полиплоидия как фактор видообразования
Для гиногенетических животных типично сложное по структуре (полифилетическое) происхождение в результате процессов гибридизации бисексуальных видов внутри своего рода (Dawly, 1989; Vrijenhoek, 1994). Шимизу с соавторами выдвинули предположение, основанное на данных элегсгрофоретического полиморфизма изоферментов, что триплоидный серебряный карась возник в результате гибридизации, причем древним предком японского триплоидного серебряного карася мог быть континентальный подвид Carassius auratus (Shimizu et al., 1993).
Данные по исследованию повторяющихся последовательностей ДНК (СаІЗгЮг-семейство) свидетельствуют в подтверждение гипотезы о гибридном происхождении полиплоидных серебряных карасей (Murakami, Fujitani, 1997). Методом Southern-blot гибридизации было показано, что такие тандемно организованные последовательности выявляются только у триплоидных серебряных карасей Carassius auratus langsdorfi, в отличие от диплоидной формы того же подвида и других диплоидных подвидов японских серебряных карасей, карпа и китайского карася Carassius auratus. С другой стороны при искусственном оплодотворении диплоидной самки Carassius auratus langsdorfi спермой тетраплоидного самца того же подвида, полученное потомство показало наличие в геноме СаІЗпБг-последовательностей. Результаты исследований Мураками и Фуджитани не смогли дать определенного ответа, кто был предком, передавшим эти последовательности триплоидным японским серебряным карасям. Вслед за Шимизу с соавторами (Shimizu et al., 1993) Мураками и Фуджитани выдвинули предположение, что им мог оказаться широко распространенный на российской территории серебряный карась Carassius auratus gibelio (Murakami, Fujitani, 1997). Таким образом, как филогенетическое положение триплоидной внутривидовой формы серебряного карася, так и её генетическое происхождение остаются невыясненными. При этом близкое морфологическое сходство гиногенетической и бисексуальной формы с очевидностью свидетельствует об их генетической близости.
Полиплоидия - это состояние, при котором в организме присутствует более двух полных наборов хромосом, передающееся по наследству. Большинство полиплоидов имеет четное число наборов хромосом, чаще всего кратное четырем (тетраплоиды).
Полиплоидия обеспечивает длительную эволюционную гибкость, которая возможна за счет генной дупликации. Дуплицированные гены могут быть утрачены, сохранены или поддерживаться как копии, при этом у некоторых из них функция может несколько измениться, либо возникнуть новая (Adams, Wendel, 2005; Taylor, Raes, 2005). Эффективными конкурентами своим диплоидным родственникам вновь образовавшиеся полиплоиды становятся, преодолев «бутылочное горлышко» нестабильности (Comai et а/.,2000; Mayer, Aguilera, 1990; Singh, 2003; Ramsey, Schemske, 2002). Помимо возникновения генной избыточности (дупликации), полиплоидия приводит к увеличению размера ядра и усложняет процессы хромосомного контроля (поддержание их структуры и разделение хроматид) во время клеточного деления. Полиплоиды появляются в тех редких случаях, когда мейотические или митотические нарушения приводят к формированию гамет, несущих более одного набора хромосом. Диплоидные гаметы, возникающие не часто, обычно сливаются с гаплоидными гаметами и формируют в результате триплоидные зиготы. Такие зиготы являются нестабильными и могут быть у различных видов как стерильными, так и фертильными, т.е. участвовать в формировании полиплоидных гамет. Слияние диплоидных гамет приводит к образованию тетраплоидных потенциально стабильных зигот.
Между автополиплоидами и аллополиплоидами существует фундаментальное отличие. У обоих имеется увеличенное количество наборов хромосом, но у автополиплоидов наборы хромосом относятся к одному типу и имеют одинаковое происхождение, тогда как у аллополиплоидов наборы хромосом относятся к разным типам, и происхождение их различно. Так происходит потому, что автополиплоидия - это результат мутации по количеству хромосом, а аллополиплоидия - результат гибридизации. Разделение на автополиплоидов и аллополиплоидов не абсолютно. Хромосомные наборы аллополиплоидов различаются пропорционально дивергенции родительских геномов: чем ближе филогенетически родители, тем ближе к автополиплоиду получившийся аллополиплоид. Полиплоиды образуются с относительно высокой частотой (1 на 100 000) у цветковых растений (Comai, 2005).
Полиплоидия имеет ряд преимуществ за счет гетерозиса, генной дупликации (избыточности) и бесполой репродукции. Гетерозис является причиной более высокой жизнестойкости полиплоидов по сравнению с их диплоидными предшественниками, а генная дупликация защищает полиплоидов от губительного воздействия мутаций. Бесполая репродукция делает их способными размножаться в отсутствии половых партнеров. Защитное действие полиплоидии против губительных рецессивных мутаций может играть важную роль, если изолированные или прошедшие жесткий отбор «бутылочного горлышка» популяции подвергаются инбридингу, когда выбраковка вредных аллелей затруднена среди ограниченного числа скрещивающихся особей.
Другое преимущество, которое обеспечивается генной дупликацией, заключается в возможности разграничения генных функций посредством изменения дуплицированных копий важных или необходимых генов. Если у диплоидов такая возможность зависит от редких событий сегментарной дупликации, то у полиплоидов все гены имеют вторую (дуплицированную) копию, которая является материалом для эволюционного экспериментирования. Таким образом, основные преимущества полиплоидии состоят в высокой степени гетерозиготности и потенциальной возможности улучшить ее использование.
Кроме того, в результате полиплоидии генная дупликация дает буферный эффект в отношении летальных мутаций. В некоторых случаях в результате полиплоидизации происходит «упрощение» репродукции через самооплодотворение и асексуальность.
У полиплоидии есть существенные слабые стороны, а именно: 1) вредные последствия от увеличения ядра и целой клетки, 2) склонность к формированию анеуплоидных клеток в процессе митоза и мейоза полиплоидов.
3) Полиплоидия может препятствовать нормальному протеканию митоза и мейоза. Так, у автотетраплоидных дрожжей наблюдается увеличение частоты потерь хромосом в митозе, что приводит к образованию анеуплоидных клеток (Mayer, Aguilera, 1990).
Сложности могут возникать из-за нарушений в структуре и функциях веретена деления. Хотя вероятность появления анеуплоидных клеток в результате митоза у автополиплоидов может варьировать от таксона к таксону, результаты исследований указывают на существование значительного риска анеуплоидии. В мейозе у автополиплоидов также велика вероятность нарушений. Мейоз, в который вовлечены 3 или более наборов хромосом, может приводить к образованию анеуплоидных клеток, причем частота и пути их возникновения зависят от уровня плоидности организма. Автополиплоиды способны в мейотической метафазе I формировать мультиваленты. Разделение тетравалента в анафазе I происходит значительно сложнее, чем разделение бивалента, т.к. тетравалент может пойти по пути аномальной сегрегации: «3:1» или «2:1 плюс 1 остаток». Поэтому считается, что спаривание бивалентов имеет адаптивные свойства, стабилизируя полиплоидов. Какова бы ни была природа, механизмы, которые требуются для нормального автотетраплоидного мейоза, играют важную адаптивную роль, т.к. неоавтотетраплоиды часто производят анеуплоидов.
Электрофоретический анализ фрагментов рестрикции амплифицированных участков мтДНК
Каждый из амплифицированных участков анализировался набором рестрикционных ферментов. Для идентификации гаплотипов мтДНК на отдельных этапах исследования были использованы различные наборы рестрикционных ферментов. На первом этапе, посвященном выяснению возможной связи между уровнем плоидности и генетической изменчивостью серебряного карася в модельной выборке р. Раздольной, для ПЦР-ПДРФ анализа двух участков мтДНК были использованы 12 рестриктаз. Для исследования участка ND3/ND4L/ND4 были использованы эндонуклеазы Mspl, BsuRl, Rsal, Mval и Ніпбі; для 12S/16S rRNA - Mspl, FnuDU, Haelll, Rsal, Mval, Hhal и BstDEl ("Fermentas", Литва и "Сибэнзим", Новосибирск). Для идентификации филогрупп гаплотипов мтДНК, обнаруженных ранее, в выборках серебряного карася из водоемов Дальнего Востока, Средней Азии и европейской части России был использован набор только информативных рестриктаз, хорошо дифференцирующих филогруппы. Для ND3/ND4L/ND4 это: Mspl, Mval, BsuKl и BstDEl; для 12S/16S рРНК фрагмента: Mspl, Rsal («Fermentas», Lithuania и «Сибэнзим», Новосибирск). Для анализа ПДРФ основных комбинированных гаплотипов, входящих в состав обнаруженных ранее филогрупп, а также для ПДРФ-анализа тех же амплифицированных участков мтДНК золотого карася и сазана, использовались рестриктазы: Aval, BsuEI, QH ЗІ, Bshl236l, Ніпві, Hinfl, Mspl, Mval для участка ND3/ND4L/ND4 и Aval, BsuRI, Cfrl3l, Bshl236l, Ніпбі, Hinfl, Mspl, Mval, Rsal для участка, кодирующего гены 12S H16S субъединиц рРНК. Все рестрикционные ферменты, использованные в исследовании, указаны в таблице 3.
После обработки амплифицированных фрагментов рестриктазами пробы подвергали электрофорезу в 1.8% агарозном геле в 50мМ трис-боратном буфере (Sambrook et ai, 1989). Фрагменты ДНК в геле окрашивали этидиумбромидом и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для определения молекулярной массы образующихся фрагментов использовали маркерный набор фрагментов ДНК, кратных 100 п.о. (BRL Gibco, Grand NY) и ДНК фага А,, обработанную Pstl рестриктазой (рис. 4).
На основе линейного расположения рестрицированных фрагментов строились карты сайтов рестрикции по каждой эндонуклеазе для обоих амплифицированных участков мтДНК. По выстроенным картам определяли отсутствие или наличие сайта рестрикции. Варианты, отличающиеся по наличию либо отсутствию сайтов рестрикции, обусловленные мутациями, в каждом из участков по каждому из ферментов рестрикции обозначались буквой. Варианты расщепления по каждому фрагменту и по каждому ферменту кодировались в бинарной системе. Наличие сайта рестрикции обозначалась цифрой 1, отсутствие сайта рестрикции - 0. Результаты анализа двух участков мтДНК каждой особи по всем сайтам и всем рестрикционным ферментам объединяли, получая, таким образом, комбинированные гаплотипы, каждый из которых обозначался одной буквой.
Гаплотипическое (h) и нуклеотидное разнообразие (л), степень дивергенции между гаплотипами (р) определялись с помощью уравнений Ней (Nei, 1987) с использованием пакета программ REAP (McElroy et alH 1992). Полученная в REAP матрица количественных значений дивергенции между гаплотипами использовалась для кластеризации и построения фенограммы с использованием программы UPGMA [пакет программ NTSYS (Rohlf, 1990)]. Гетерогенность между выборками оценивали с помощью псевдовероятностного теста х2 (Zaykin, Pudovkin, 1993).Устойчивость полученных филогенетических деревьев оценивали методом бутстрепа (Felsenstein, 1985), используя 1000 бутстреп-реплик. Реконструкцию сетей гаплотипов (древ минимальной протяженности) проводили по принципу минимального числа нуклеотидных замен между гаплотипами (Prim, 1957; Rohlf, 1973). Величину различий и вероятные альтернативные связи между ними рассчитывали в пакете программ Arlequin 2.000.
Определение площади ядер эритроцитов. Одним из быстрых и достаточно достоверных способов определения уровня плоидности считается анализ площади ядер эритроцитов. Унифицированный метод включает окрашивание клеток ядерным красителем и последующее измерение площади ядер (Toth et al., 2005).
Измерения площади ядер проводили на препаратах крови из хвостовой артерии рыб. Фиксированные 96% этанолом препараты окрашивали азокармином G (ООО «Биовитрум», Санкт-Петербург) в течение 15 мин при комнатной температуре, ополаскивали дистиллированной водой, высушивали в термостате при +37С и заключали в иммерсионное масло. Препараты анализировали на микроскопе Leica DM2500 при увеличении х 100 (рис. 5).
Определение плоидности методом сравнения количества ДНК в ядрах эритроцитов. Цитологические препараты из ткани печени и селезенки получали после щелочной дезагрегации, окрашивали по Фельгену (Пирс, 1962) и фотографировали в одинаковых условиях. Морфометрический анализ ядер эритроцитов на препаратах проводили в программе Photoshop. У каждой особи определяли параметры для 40-100 эритроцитов. Расчет плоидности проводился сопоставлением средних значений, полученных по формуле Q = (В-А) / S, где
В - интенсивность свечения фона, А - интенсивность свечения ядра, S - площадь ядра.
Для каждой особи строилась гистограмма значений Q в программе Ехеї. У триплоидных и тетраплоидных особей значения Q были увеличены относительно значений, полученных для диплоидных особей.
Подсчет количества ядрышек в ядрах эритроцитов. В качестве дополнительного метода определения плоидности особей серебряного карася был использован подсчет максимального количества ядрышек в ядрах эритроцитов на препаратах крови, окрашенных 50% AgN03 (Howell, Black, 1980). Этот метод окрашивания был использован для выявления ядрышек в ядрах эритроцитов серебряного карася (Черфас, Ильясова, 1980; Takai, Ojima, 1982). Подсчет количества ядрышек оказался удобным дополнительным методом для определения уровня плоидности (Phillips et я/., 1986). Предварительно фиксированные 96% этанолом препараты крови выдерживали в 2N расворе муравьиной кислоты в течение 1 часа (или более), затем отмывали дистиллированной водой и высушивали. Затем на препарат наносили смесь 50% AgNC 3 и 2% раствора желатина в соотношении 1:2. Инкубацию проводили при 55С под покровным стеклом в течение 10 мин до появления золотистого цвета в зоне окрашивания препарата. Метод окрашивания серебром демонстрирует факт проявления Ag-окрашенного рРНК-белкового комплекса, синтезированного в ядрышковом
Анализ митохондриальной ДНК серебряного карася Carassius auratus gibelio в приморской популяции
К началу исследований из литературных источников было известно, что в восточных популяциях Евразии (Японские острова, Северный Китай, Дальний Восток России) обнаруживаются бисексуальная (диплоидная) и гиногенетическая (триплоидная) формы серебряного карася в разных соотношениях. В последние годы появились сообщения об увеличении доли диплоидных самцов и самок в западных популяциях (Luskova et al., 2004), однако считается, что в Сибири, на Урале и в европейской части ареала вида встречается главным образом триплоидная форма (Головинская с соавт.,1965; Takai, Ojima, 1983; Кирпичников, 1987; Zhou et al., 2000; Васильева, Васильев, 2000). Таким образом, предполагалось, что в водоемах Дальнего Востока обитают обе формы серебряного карася. Первый этап исследования был посвящен анализу плоидности особей в популяции серебряного карася одной реки и выяснению возможной связи между изменчивостью мтДНК и плоидностью у особей (фактически - типом размножения) у этого вида.
В качестве модельной популяции была использована выборка серебряного карася Carassius auratus gibelio из реки Раздольная. Данные анализа 33 особей карася по плоидности и вариантам гаплотипов приведены таблице 5.
Для установления уровня плоидности каждой особи был использован метод определения количества ДНК в ядрах эритроцитов (см. главу 2 «Материалы и методы»).
На гистограммах рисунка 7 приведены результаты измерений количества ДНК в ядрах эритроцитов (окрашенных по Фельгену) диплоидных и триплоидных особей. Как видно на первой гистограмме, максимальную частоту имеет значение566 (условных единиц количества ДНК в ядре эритроцита), тогда как на второй гистограмме - значение 794. Соотношение этих значений можно
представить как 1 : 1,4, что согласуется с данными определения плоидности по среднему значению площади ядра эритроцита (см. гл. 2. «Материалы и методы»).
В выборке обнаружено 14 диплоидных особей (бисексуальная форма), из них 5 самцов и 9 самок. Остальные 19 особей были тришюидными или тетраплоидными. Таким образом, полученные результаты подтверждают представление о том, что в водоемах Дальнего Востока и в популяции р. Раздольной, в частности, выявляются диплоидная, по-видимому, бисексуальная форма и триплоидная гиногенетическая форма.
С целью выяснения возможной связи между уровнем плоидности и генетической изменчивостью серебряного карася был проведен ПЦР-ПДРФ анализ мтДНК. Для выявления изменчивости каждый из амплифицированных фрагментов анализировался набором из 12 рестрикционных ферментов. Перечень рестриктаз приведен в главе 2 «Материалы и методы».
В двух амплифицированных участках мтДНК - ND3/ND4L/ND4 и 12S/16S рРНК - было выявлено 62 сайта рестрикции, из них 9 - полиморфные. Всего было выявлено 5 комбинированных гаплотипов: А, В, В1, С, D. Гаплотип, обозначенный буквой А, обнаружен у 23 особей (1р, 4р, 6р, 7р, 9р, Юр, 11р, 13р, 14р, 15р,16р, 19р, Зір, ЗЗр, 36р, 37р, 38р, 44р, 45р, С1, С2, С4, С5), т.е. у большей части особей выборки (табл. 5, 6). Гаплотип двух особей - триплоидной самки Зр и диплоидного самца С16 - имеют иной, чем у гаплотипа А, спектр фрагментов рестрикции участка ND3/ND4L/ND4 ферментом Mspl, этот гаплотип обозначен как С. Комбинированный гаплотип D был обнаружен у одной особи - диплоидной самки 40р, также характеризующейся отличиями по сайтам рестрикции эндонуклеазой Mspl. В группе, состоящей из 6 диплоидных особей (2р, 5р, 8р, 17р, 29р, 42р), в спектрах фрагментов рестрикции обоих исследованных участков мтДНК выявлены значительные отличия от гаплотипа А. Этот комбинированный гаплотип обозначен буквой В. Кроме того, спектр фрагментов рестрикции особи 42р показал отличие от гаплотипа В по сайтам рестрикции фрагмента 12S/16S rRNA с использованием эндонуклеазы Rsal, и этот гаплотип обозначен как В1 (табл. 5, 6).
В таблице 6 приведены рассчитанные данные по величине дивергенции между всеми обнаруженными гаплотипами. Гашготипы А и С, а также В и В1 отличались по одному сайту, т.е. предположительно, одной нуклеотидной заменой. Соответственно, величина дивергенции между А и С а также между В и В1 оказалась наименьшей и составила около 0,22%. Дивергенция между гаплотипами А и В составила 2,54% нуклеотидных замен. Величина дивергенции между С и В оказалась выше - 2,76%, а генетическая дистанция между D и
