Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Состояние исследований по индуцированию наследственной изменчивости у растений при помощи экзогенной ДНК
1.1. Взаимодействие чужеродной ДНК с геномом высших растений 7
1.2. Генетические эффекты экзогенной ДНК 13
1.3. Использование гамма-облученной пыльцы для передачи наследственной информации ; . 22
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Исходный материал 28
2.2. Методические вопросы выделения и анализа ДНК 29
2.3. Методика работы с пыльцой 31
2.4. Способы воздействия экзогенной ДНК 32
2.5. Методика постановки лабораторных и полевых опытов 34
ГЛАВА 3. Наследственная изменчивость, индуцированная препаратами экзогенной днк при воздействии на генеративные клетки и семена кукурузы
3.1. Изучение и характеристика модели донор -реципиент 38
3.2. Влияние экзогенной ДНК на рост и развитие растений первого поколения 44
3.3. Частота и спектр наследственных изменений /Uj-lU/ 51
ГЛАВА 4. Применение облученной пыльцы донора для индуциро вания наследственной изменчивости у реципиента
4.1. Оптимальные и критические дозы воздействия гамма-лучей на пыльцу 71
4.2. Индуцированная изменчивость у реципиента в Мр Mg . 78
ГЛАВА 5. Оцежа и описание новых форм, индуцированных экзогенной ДНК 91
Заключение 97
Выводы 102
Литература
- Взаимодействие чужеродной ДНК с геномом высших растений
- Использование гамма-облученной пыльцы для передачи наследственной информации
- Методические вопросы выделения и анализа ДНК
- Изучение и характеристика модели донор -реципиент
Введение к работе
В решениях ХХУІ съезда КПСС и в Продовольственной программе СССР на период до 1990 года особое внимание уделяется развитию исследований по проблемам генной инженерии в селекции растений, усилению работ по созданию новых высокопродуктивных, устойчивых к неблагоприятным условиям возделывания, болезням и вредителям сортов и гибридов сельскохозяйственных культур.
Для осуществления этих сложных задач необходима разработка эффективных методов создания новых форм растений на основе достижений современной генетики. Селекция остро нуждается в новых идеях и методах , позволяющих внести качественные изменения в селекционный процесс.
Метод экспериментального мутагенеза в сочетании с половой гибридизацией позволяет значительно расширить генетическую изменчивость, обогатить генофонд и сократить время на получение ценного исходного материала. Однако эти традиционные методы ограничены прежде всего нескрещиваемостью видов, а также непредсказуемостью мутагенеза. Необходим поиск новых методов, и в этом плане большой интерес представляет метод генетической трансформации при помощи экзогенной ДНК, который хорошо изучен и широко применяется у микроорганизмов.
Изучение возможности переноса генетической информации по типу трансформации у растений занимает особое место. Решение этого вопроса имеет как теоретическое, так и практическое значение, в частности в селекции сельскохозяйственных растений. Так, внутривидовое разнообразие не всегда может обеспечить донорами таких признаков и свойств, которые имеются у других видов. Большинство возделываемых сельскохозяйственных культур нуждаются в существенном повышении устойчивости к экстремальным условиям среды, болез-
[ - 5 -
ням, улучшении качества синтезируемого продукта. Например, известно, что запасные белки семян, определяющие их качество, не сбалансированы по аминокислотному составу у основных зерновых культур из-за недостатка одной или более незаменимых аминокислот.
Одним из направлений генетических манипуляций у растений является также перенос генов, контролирующих продуктивность, азотный и углеродный обмен и другие ценные признаки.
Однако результаты известных работ по генетической трансформации у растений весьма противоречивы, хотя и достигнуты определенные успехи. Необходимы дальнейшие исследования в этом направлении, чтобы выяснить реальные возможности трансформации как способа обмена генетической информации у растений.
Нуклеиновые кислоты, обладающие широким спектром биологического действия, представляют особый интерес и как мутагенный фактор. Изучение экзогенных ДНК как мутагенов обусловлено выявленными особенностями их действия на дрозофиле, а именно: экзогенные ДНК являются мутагенами более "мягкого" действия, не вызывающими крупных перестроек хромосом и обладающими специфичностью действия, вызывая повышенную мутабильность отдельных генов /I/. Изучение возможности индуцирования посредством экзогенной ДНК наследственных изменений у растений, в том числе и у одной из основных зерновых культур - кукурузы, широко возделываемой как в Советском Союзе, так и в Народной республике Болгарии, имеет важное значение в практической селекции.
Наряду с использованием экзогенных ДНК, выделенных химическим путем, перспективным по мнению ряда зарубежных исследователей является принципиально новый метод переноса генетической информации при помощи облученной высокими дозами радиации пыльцы, содержащей отдельные фрагменты ДНК. Использование пыльцы цветочных рас-
тений в качестве вектора ставит также ряд нерешенных задач.
Диссертационная работа посвящена изучению генетических эффектов экзогенной ДНК при воздействии на генеративные клетки и семена кукурузы.
В задачи исследований входило:
Разработка эффективных способов введения препаратов экзогенной ДНК в генеративные клетки и органы кукурузы.
Анализ индуцированных экзогенными ДНК наследственных изменений в связи с проблемой переноса наследственной информации у растений по типу генетической трансформации.
Изучение мутагенных эффектов экзогенной ДНК при различных способах воздействия на геном линии-реципиента.
Изучение возможности применения облученной пыльцы донора для индуцирования наследственной изменчивости у реципиента.
Генетическое изучение, оценка и отбор практически ценных форм растений кукурузы.
Взаимодействие чужеродной ДНК с геномом высших растений
Вопрос о взаимодействии экзогенной ДНК с растительными и животными объектами начал интенсивно изучаться в связи с открытием явления генетической трансформации у микроорганизмов. На пневмококках, стрептококках, кишечной палочке, сине-зеленых водорослях четко показано, что чужеродная ДНК способна проникать в клетки, интегрировать и нормально функционировать в их геноме, изменяя наследственные признаки реципиента.
Процесс взаимодействия чужеродной молекулы с геномом растительных клеток, в результате которого могут наступить изменения в их генетических характеристиках, является очень сложным и имеет пять биохимических ступеней: поглощение, интеграция, репликация, экспрессия и трансмиссия /2/.
Процесс поглощения ДНК показан многочисленными экспериментами. Теперь считается общепринятым, что экзогенная ДНК поглощается растительными системами, однако вопрос о дальнейшей ее судьбе стал предметом дискуссий. Некоторые авторы /3-9/ сообщают, что экзогенная ДНК не только поглощается растениями, но и интегрируется и реплицируется в реципиентном геноме. Другие исследователи доказывают, что экзогенная ДНК не интегрируется и не реплицируется, и делают вывод, что абсорбированная ДНК, как правило, деградирует и продукты ее деградации используются для синтеза эндогенной ДНК /10-15/.
Большинство экспериментов по поглощению ДНК, ее интеграции и репликации в геном реципиента сделаны физическими методами. Так, наиболее многочисленные исследования в этом направлении проведены группой Леду /3-7,9,16-18/. На ряде растительных объектов ими показано, что меченая ДНК, поглощаясь прорастающими семенами, поступает в стебель и генеративные органы. Более того, показано, что экзогенная ДНК бактерий способна проникать в ядра растительных клеток. Методом равновесного центрифугирования в хлористом цезии было показано, что экзогенная ДНК интегрирует в геном реципиента. Центрифугирование ДНК ячменя в градиенте плотности позволило установить промежуточный пик меченой ДНК между ДНК донора и реципиента. После обработки ДНК промежуточной по плотности фракции ультразвуком были выделены фрагменты ДНК с плотностью, соответствующей как ДНК реципиента, так и ДНК донора, что указывало на возможную дуплексную структуру молекул данной фракции.
Изучая процесс взаимодействия экзогенной гомологичной ДНК с геномом реципиента, Хемлебен и соавторы убедительно показали, что донорная ДНК хорошо поглощается растениями и интегрирует как двунитчатая молекула, связываясь ковалентно с ДНК реципиента /19, 20/. Аналогичные результаты были получены при исследовании поглощения экзогенной гомологичной ДНК клетками и ядрами зародышей ячменя /21,22/.
Поглощение и интеграция фаговой ДНК сеянцами Matthiola in-сапа показаны в работах Ребеля и соавт. (Rebel) /8,23/. Наличие бактериальной и донорнои ДНК в корнях и в щитке семени ячменя после их инкубации в растворе ДНК обнаружил Клайнхофс (Kleinhofs) /24/.
Результаты упомянутых выше работ свидетельствуют о поглощении и интеграции экзогенной ДНК в растительный геном. Однако мно - 9 гие авторы, пытавшиеся повторить опыты Леду (Ledoux) и соавторов на тех шш других системах, не смогли получить подтверждающие результаты. В работе /25/ авторам не удалось воспроизвести эксперименты по интеграции экзогенной ДНК на ячмене /18/ и эксперименты на томатах /26,27/. Они пришли к выводу, что меченая бактериальная ДНК, абсорбированная растениями, деградирует и ре-утилизируется реципиентом для синтеза эндогенной ДНК, или остается неповрежденной, но химически не связанной с реципиентной ядерной ДНК. К аналогичным выводам пришли и Бендич с соавторами, изучая поглощение бактериальной ДНК сеянцами гороха /10/. Практически отрицательные результаты экспериментов получены при исследовании возможности интеграции и репликации экзогенной ДНК на горохе, ячмене и томатах /11,12,28/, на проростках фасоли /14/, а также при изучении интеграции бактериальной ДНК в геном Chiami-domonas /29/.
Серию отрицательных экспериментов авторы объясняют возможным бактериальным загрязнением и ставят под сомнение использование самого метода центрифугирования в градиенте плотности в качестве единственного критерия характеристики фракции ДНК /2/. В этом плане интерес представляют данные, полученные Хансоном и соавторами на томатных побегах /13/. Хотя в результате центрифугирования в градиенте Csci и получался пик промежуточной плотности, но дальнейший анализ его компонентов не выявил гомологию между ДНК донора и ДНК, входящей в состав промежуточной фракции.
Примером доказанной интеграции экзогенной ДНК у растений пока может служить Ті -плазмида. В геном растительной клетки интегрируется только часть плазмиды, так называемая Т-ДНК /30-36/.
Использование гамма-облученной пыльцы для передачи наследственной информации
Изучая возможность применения методов генной инженерии на интактных растениях, Пэнди (Pandey к.к.) впервые продемонстрировал ограниченный перенос генов от донора к реципиенту при помощи облученной гамма-лучами пыльцы. Этот феномен был выявлен при исследовании межвидовой гибридизации у рода Mcotiana и назван автором "трансформация яйцеклетки" /154/. По существу это разновидность трансгенозиса, который в данном случае может быть назван "половой трансгенозис". Сущность его заключается в следующем: растения реципиента опыляются пыльцой донора, облученной высокими дозами ионизирующей радиации /от 50 до 100 крад/. Псевдооплодотворение такой пыльцой приводит к неполному циклу клеточного деления яйцеклетки и образованию псевдозиготы, которая развивается партеногенетически. Такой тип развития описан для всех видов Nicotiana. Хотя нормальное оплодотворение и не происходит, но псевдооплодотворение стимулирует яйцеклетку, находящуюся в фазе Gj клеточного цикла, к репликации ДНК. Во время репликации отдельные хроматиновые фрагменты облученной пыльцы могут встраиваться в геном яйцеклетки. В результате полученные эффективно удвоенные гаплоиды будут трехаллельны по отдельным локусам /155-157/. Второе мейотическое деление балансирует гаметное содержимое трансформированных хромосом и в результате растения ї по фенотипу идентичны с материнским организмом, за исключением признаков донора, переданных облученной пыльцой. Цитологическими исследованиями показано /158/, что в облученной пыльце нормальное деление генеративного ядра прекращается, так как хроматин сильно повреждается в результате облучения и хромосомы не могут ориентироваться в метафазную пластинку. Генеративное ядро представляет собой сконцентрированную массу отдельных хроматиновых фрагментов, которые и могут быть перенесены в яйцеклетку /рис.1,А/.
В отдельных случаях, как это показано на N.forgetiana, для получения диплоидных зародышей автор предлагает после опыления облученной пыльцой "доопылять" необлученной. При этом некоторые из гаплоидных яйцеклеток могут быть "дооплодотворены" нормальными пыльцевыми трубками /156-162/. Механизм вторичного оплодотворения пока не выяснен. Автор полагает, что в результате псевдооплодотворения облученной пыльцой деполяризация плазменной мембраны яйцеклетки не осуществляется, и таким образом создается возможность для оплодотворения нормальной необлученной пыльцой
В результате проведенных исследований у рода Nicotiana бы ла получена трансформация по трем маркерным генам. Растения трансформанты Tj имели высокофертильную пыльцу /от 70 до 95%/, характеризовались полной идентичностью с материнским организмом, за исключением признаков, привнесенных облученной пыльцой.Обычные половые гибриды отличались от обоих родителей и имели совершенно стерильную пыльцу /155,156/.
Как считает автор /156/, передача признаков при помощи облученной пыльцы методом "трансформации яйцеклетки" имеет ряд преимуществ по сравнению с препаратами экзогенной ДНК, выделенной химическим путем. Во-первых, хроматиновые фрагменты в клетке находятся в относительно естественном состоянии и входят в яйцеклетку путем обычного оплодотворения. Во-вторых, яйцеклетка, находящаяся в пресинтетической фазе Gj, имеет уникальный потенциал для быстрой репликации ДНК, роста и дифференциации и поэтому особенно удобная клетка для индукции трансформации. После оплодотворения в яйцеклетке происходит экстремально активная репликационная фаза, что является дополнительным фактором для включения фрагментов донорной ДНК.
Перспективность предложенного способа Пэнди (K.Pandey) вызывает ряд разногласий по поводу недостаточной изученности вопроса о партеногенетическом развитии других видов растений. Кроме того, при таком опылении облученной пыльцой количество получаемых "трансформированных" жизнеспособных семян очень низкое. Это является лимитирующим фактором не только для представителей рода м-cotiana, которые имеют несколько сотен семяпочек в завязи, но и для большинства культурных растений, имеющих в завязи одну или несколько семяпочек /155,156,163,164/. В связи с этим необходим прежде всего поиск эффективных условий для повышения завязываемо-сти семян.
Исследование возможности переноса генетической информации при помощи облучения пыльцы будет иметь большое значение в растительной селекции для ускорения процесса получения растений с ценными качествами. В последние годы появились работы на важных сельскохозяйственных культурах, на ячмене /165/, пшенице /157/, томатах /166-168/, горохе /164/, а также на гибридах пшеницы с тритикале /169/. Подобные результаты получены и на Nicotiana rustica /170-172/. При использовании в качестве модельной системы самосовместимые и самонесовместимые линии Petunia hybrida L. выявлен перенос двух маркерных генов донора в геном реципиента после облучения пыльцы дозой 1200 Гр /173/. При обобщении результатов этих работ следует отметить, что доза облучения пыльцы является видоспецифической величиной для каждого исследуемого растительного объекта. Известно, что пыльцевые клетки относительно устойчивы к облучению гамма-лучами /LD50 151 Двуядерной пыльцы составляет 220 крад/ /174,175/. Однако для осуществления переноса генетической информации необходимо, чтобы пыльцевое зерно не только прорастало, но и не теряло полностью свою фертильность. Дэйвисом (Davies) предлагается способ определения оптимальной дозы облучения для завязываемости зерен на основании соотношения радиочувствительности /летальные повреждения/ и среднего количества нуклеотидов в хромосомах /164/.
Методические вопросы выделения и анализа ДНК
Существуют различные методы выделения препаратов ДНК в зависимости от природы биологического материала и преследуемой цели.
Процесс выделения суммарной ДНК из растительных клеток можно разделить на несколько этапов: получение гомогенатов; лизис клеточных мембран и экстрагирование дезоксирибонуклео-протеида /ДНП/; отделение ДНК от белков; очистка ДНК от РНК, полисахаридов и пигментов.
Анализ литературы по методикам выделения растительной ДНК показал, что нет еще универсального детергента для лизирования растительных тканей, нет универсальных и надежных способов полной очистки ее препаратов от полисахаридов и пигментов, пока что не из всех тканей растений можно получить удовлетворительные препараты ДНК /I79-I8I/.
Для выделения ДНК в нашей работе использована модификация метода Кирби (Kirby), с фенольной депротеинизацией /182/. Этот метод оказался подходящим для выделения ДНК из проростков кукурузы, так как фенол способствует быстрому и эффективному удалению окрашенных полифенольных продуктов, в основном водорастворимых пигментов и дубильных веществ.
ДНК выделяли из 5-6-дневных этиолированных проростков кукурузы. Семена дезинфицировали раствором перманганата калия, а затем проращивали в термостате при температуре 26С. Проростки сно
ва дезинфицировали, тщательно промывали и. подсушивали. Потом замораживали жидким азотом и. измельчали в порцелановой ступке; до тонкого порошка. К навеске порошка добавляли буфер следующего состава: Ix SSC, 0,002 М цитрата натрия, 1% SDS, 0,1 М ЭДТА, рН 8. Соотношение буфера к навеске 2:1. Смесь прогревали при 50-55С 15-20 мин для инактивации нуклеаз. После того лизат охлаждали снова и добавляли к нему дважды перегнанный насыщенной водой фенол, рН 7,0. Соотношение раствора к фенолу 1:1. Полученную смесь медленно выкручивали на холоду 30 мин. Потом центрифугировали 25 мин при 4000 об/мин на центрифуге ЦЛР-І при -ЮС,верхний слой осторожно отсасывали пипеткой с защитным концом и повторно обрабатывали смесью фенола с хлороформом в соотношении 2:1.
ДНК осаждали 2-2,5: объемами 96$ зтанола, охлажденного до -25-30С. Через 30 мин всплывала "медуза", которую оставляли на ночь в холодильнике. После этого осторожно переносили "медузу" в небольшой объем 0,1 X SSC. К раствору ДНК добавляли предварительно прогретую РБК-азу /80С, 10 мин/ до концентрации 50 мкг/мл. Раствор нуклеиновых кислот обрабатывали РНК-азой в конечной концентрации 50 мкг/мл и проназой.
Раствор нуклеиновых кислот инкубировали с РНК-азой и проназой в конечных концентрациях соответственно 50 и 100 мкг/мл. После инкубации к охлажденному раствору добавляли I объем фенола, оставляли на 30 мин, затем центрифугировали при 3000 об/мин. Де-протешшзацию продолжали до исчезновения интерфазы. Водную фазу осторожно приливали к 2,5 объемам охлажденного до -30С этанола. Всплывшую "медузу" осторожно переносили в небольшой объем 0,1 X SSC. Диализ проводили на холоду, соотношение исследуемого раствора: буфер I : 1000, состав буфера - 0,1 х SSC с цитратом нат рия до нормы. Продолжительность диализа - 6 ч. После диализа получали чистый препарат ДНК, который хранили в холодильнике в 0,1 х ssc.
Концентрацию ДНК в растворе определяли на спектрофотометре "Спекорд". Степень очистки от белков и полисахаридов определяли фотометрически, по соотношению экстинции Е2бо/%80 и 26с/%30 В зависимости от степени депротеинизации количество белка в препаратах ДНК составляло 3-10$. Для целей нашей работы ДНК выделяли из проростков теосинте, коикса, линии ВС 2923, а также использовали коммерческий препарат ДНК тимуса теленка /фирма "Реанал", Венгрия/ с молекулярной массой около ІЩі содержанием белка до 0,5$.
Изучение и характеристика модели донор -реципиент
Успешное изучение генетических эффектов экзогенных ДНК во многом определяется модельной системой донор - реципиент. При создании такой модели мы подбирали генотипы, обладающие полезными и контрастными морфологическими, физиологическими и биохимическими признаками. Наличие в геноме доноров полезных генов при возможной генетической трансформации позволило бы расширить генетическую основу исходной линии-реципиента и получить новые формы с ценными свойствами.
В этом плане значительный интерес представляют дикорастущие сородичи кукурузы - теосинте, койке, трипсакум.
Теосинте - дикорастущее травянистое растение Американского континента, распространенное в качестве сорняка в Мексике, Гватемале, Гондурасе. В настоящее время известные виды теосинте рассматриваются в роде Zea L. /190,191/. В естественных популяциях встречаются два многолетних вида Zea perennis (2n=40), Zea diploperennis (2n=20) и однолетний Zea mexicana (2n=20).
Наиболее изученным является однолетний теосинте, имеющий одинаковое число хромосом с кукурузой (2п=20), который легко скрещивается с ней и дает фертильное потомство /рис.1/. Початок у теосинте представляет собой короткий колос, заключенный в цветочную обвертку. Он состоит из двух рядов женских колосков, расположенных поочередно в углублениях на тонкой оси. Эндосперм у теосинте обычно белый и крахмалистый. Семена не вымолачиваются и одеты в очень твердый роговидный панцирь. При созревании ось соцветия распадается на отдельные сегменты, обеспечивая этим распространение семян. Такие признаки, как затвердение наружной колосовой чешуи, развитие слоев расчленения главной оси, двурядныи колос, сидячие пестичные колоски относятся к пестичному соцветию.
Интенсивные генетические исследования гибридов кукурузы с однолетним теосинте показали, что именно по этим признакам кукуруза наиболее отличается от теосинте. Все эти признаки контролируются несколькими генами, расположенными в основном в 4-й хромосоме, и каждый из них действует на несколько признаков /192,193/.
В современных программах по улучшению кукурузы одно из ведущих мест занимают также представители рода Coix и Tripsacum, благодаря наличию ряда ценных признаков для селекции /194,195/.
Coix lacryma Jobi L. (2n=20) -многолетнее кустящееся растение, высотой около 30 см. /рис.1/. Вместо початка зерновка черного или бледно-голубого цвета. Мужские и женские соцветия в одном цветке. С кукурузой скрещивается плохо.
В нашей работе в качестве реципиента использована линия кукурузы ВС 2923, а в качестве доноров - линия кукурузы маркер Ман-гельсдорфа, маркированный по всем 10 хромосомам рецессивными генами /табл. 3.1/, койке и однолетний теосинте. Подобранные формы были всесторонне изучены и размножены. Характеристика донора теосинте и линии-реципиента по отдельным морфо-биологическим признакам приведена в табл. 3.2. Высота растений теосинте почти в 2,5 раза превышает линию-реципиент, растение теосинте имеет 46-155 початков при 1,5 початков у линии. Початок в значительной степени изменился. У теосинте на початке 2 ряда зерен, у реципиента -12-14, урожайность зеленой массы одного растения теосинте 800-970 г, линии-реципиента - 250 г.
Гибридные растения Fj /кукуруза х теосинте/ - теосинтепо-добного типа: многопочатковые, сильно кустящиеся, хорошо облист-венны и тонкостебельные /рис.2/. Початки очень мелкие с ороговевшими колосковыми чешуями, уменьшенным количеством рядов зерен, число зерен в початке 30-40. Гибриды первого поколения, как правило, занимают промежуточное положение между родителями по длине вегетационного периода, что указывает на частичное или неполное доминирование короткого периода над длинным. Таким образом, при такой резкой контрастности признаков даже промежуточное наследование многих из них не усложняет их выявление в посевах линии-реципиента.
