Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 7
1.1. Взаимодействие ядра и цитоплазмы в процессе жизнедеятельности клетки 10
1.2. Ферменты как маркеры активности генов 22
1.3. Молекулярно-генетичеекая природа ЦМС 32
ГЛАВА II. Материал и методы 47
2.1. Приготовление вытяжек 48
2.2. Приготовление геля и проведение электрофореза 49
2.3. Получение и очистка J3 - limit декстрина 50
2.4. Выявление множественных молекулярных форм ферментов на электрофореграммах 50
2.5. Определение активности ферментов 52
2.6. Определение белка 54
ГЛАВА III. Онтогенетические изменения ферментов углеводного обмена при формировании жизнеспособной пыльцы 56
ГЛАВА ІV.Нарушения углеводного обілена в процессе микр0сп0р0генеза при цитоплазматическ0й мужской стерильности 82
ГЛАВА V. Влияние генов-восстановителей фертильности на углеводный обмен, нарушенный в пыльниках растений кукурузы с ЦМС 114
Выводы 125
Литература 127
- Взаимодействие ядра и цитоплазмы в процессе жизнедеятельности клетки
- Молекулярно-генетичеекая природа ЦМС
- Приготовление геля и проведение электрофореза
- Выявление множественных молекулярных форм ферментов на электрофореграммах
Введение к работе
Цитоплазматическая мужская стерильность у растений представляет теоретический интерес как модель для изучения взаимодействия генетических систем ядра и цитоплазмы. Весьма широко этот признак используется в практической селекции в качестве генетического метода кастрации растений при создании гетерозисних гибридов.
Цитоплазматическая мужская стерильность характеризуется нарушением многих звеньев метаболизма - в формирующихся пыльниках изменяются аминокислотный, липидный, углеводный обмены, наборы запасных белков и полисахаридов. Несмотря на интенсивное изучение молекулярно-генетической природы ЦІЮ, причины этих нарушений до сих пор остаются невыясненными. В последние годы обнаружено, что каждому типу ЦМС у кукурузы присущи уникальные изменения митохондриальной ДНК. Однако остается неясным, как эти изменения внеядерного генома проявляются в онтогенезе растений, приводя к формированию нежизнеспособной пыльцы.
Генетическая информация реализуется в белках, подавляющее большинство из которых обладает ферментативной активностью. Изучение изменений ферментов при аномальном развитии пыльцы приблизит нас к пониманию особенностей реализации генетической информации ядра в присутствии мутантной цитоплазмы.
Открытие в середине 50-х годов того факта, что ферменты, как правило, существуют в организме в виде множественных молекулярных форм, которые кодируются неаллельными генами либо серией аллелей одного локуса, сделало изучение молекулярной гетерогенности ферментов одним из самых распространенных и информа-
тивных методов биохимической генетики. Определение числа множественных молекулярных форм данного фермента, их относительной электрофоретической подвижности, активности отдельных молекулярных форм, сравнение набора изоформ у родительских форм и гибридов позволяют определить число генов, кодирующих различные молекулярные формы данного фермента, судить об экспрессии этих генов в онтогенезе и в отдельных органах изучаемого объекта.
Кроме того, об изменении экспрессии генов, контролирующих определенные ферменты, можно косвенно судить и по изменению суммарной активности всех его молекулярных форм.
Нам представляется перспективным сочетание этих двух методов - исследование молекулярной гетерогенности и активности ферментов - для выяснения причин нарушения метаболизма в пыльниках растений с ЦМС. Несмотря на установленные факты изменения количественного и качественного состава углеводов, в особенности содержания крахмала в пыльниках мужски стерильных растений разных видов, ферменты, катализирующие превращения углеводов, в связи с ЦМС изучены весьма слабо. В особенности это касается определения числа множественных молекулярных форм ферментов и исследования нарушений этого показателя на разных этапах формирования стерильной пыльцы. Более того, неясным остается вопрос об онтогенетических изменениях ферментов углеводного обмена при микроспорогенезе нормальных растений. Выяснение этих моментов позволит лучше понять, как изменяется функционирование ядерного генома у растений с мутантной цитоплазмой, и в какой-то степени представить последовательность нарушений метаболизма в пыльниках, приводящих к ЦМС.
Известно, что дефект цитоплазмы, вызывающий ЦМС, может
быть в определенной степени компенсирован введением в ядро доминантных аллелей генов-восстановителей фертильности. Механизмы нейтрализации цитоплазматических дефектов под действием этих генов пока не выяснены. В начале 70-х годов Н.В.Турбиным и А.Н.Палиловой была предложена теоретическая модель взаимодействия генов ядра и митохондрий при формировании ВДС, которая основывается на идее регуляции структурных митохондриаль-ных генов генами-регуляторами, расположенными как в самом ми-тохондриальном геноме, так и в генетическом аппарате ядра. В случае мутаций генома митохондрий введение доминантных аллелей Rf -генов в ядро компенсирует возникший генетический дефект митохондрий и приводит к восстановлению фертильности. Выяснение молекулярно-генетических событий, происходящих при введении в ядро доминантных Rf -аллелей, поможет установить механизм восстановления фертильности пыльцы. Предложенная модель дает возможность экспериментальной проверки, в первую очередь, сравнительного анализа нарушений, выявленных у растений с ЦМС и восстановленных растений с мутантной цитоплазмой. В связи с этим целью данной работы являлся анализ нарушений, возникающих в свойствах ферментов углеводного обмена при аномальном развитии пыльников у растений с ВДС и оценка роли доминантных аллелей генов Rf в репарации нарушений экспрессии ядерного генома в мутантной цитоплазме.
Для исследования были поставлены следующие задачи: I/ изучение активности и молекулярной гетерогенности ферментов углеводного обмена в процессе формирования пыльников фертильных растений кукурузы разного генотипа; 2/ анализ изменений в процессе микроспорогенеза активности и молекулярной гетерогенности ключевых ферментов углеводного обмена в пыльниках растений
кукурузы с техасским типом стерильности; 3/ исследование влияния ядерных генов Ef на активность и набор множественных молекулярных форм этих ферментов.
Взаимодействие ядра и цитоплазмы в процессе жизнедеятельности клетки
Два основных процесса, через которые реализуется генетическая информация - транскрипция и трансляция - являются, по сути, взаимодействием ядра и цитоплазмы /volpe ,1976/. Показано, что цитоплазма влияет на функционирование ядра, и эффект цитоплазмы не уменьшался при пересадке ядер у амеб в течение более чем 1000 поколений. Однако механизмы, посредством которых цитоплазма осуществляет свой контроль над ядром, остаются пока невыясненными. Не ясно также, можно ли стабильность цитоплазмы объяснить присутствием в ней генетических элементов, или же это ре II зультат особой внутренней стабильности динамических систем клетки /Danielli, DiBerardino ,1979/.
Ядро, будучи хранилищем генетической информации, "задает программу", которая реализуется в цитоплазме. Однако, цитоплазма, как показывают многочисленные исследования по пересадке ядер, начатые еще в 30-е годы на ацетабулярии / Hammerling , 1934,1963/ и на амебах / Comandon , Fonbrun ,1939/, может усиливать проявление одних и ослаблять или полностью подавлять экспрессию других ядерных генов /Корочкин,1977; Нейфах, Тимофеева,1978/.
Наблюдения за развитием энуклеированных клеток Acetabu -laria позволили предположить наличие в цитоплазме определенных регуляторных элементов /Schweiger , Berger ,1979/. Б этих опытах наблюдался нормальный морфогенез в течение шести недель после удаления ядра, отмечен синтез ряда белков, кодируемых ядерной ДНК. Более того, показано одновременное возрастание активности щелочной фосфатазы как у обычных, так и у энуклеированных Acetabularia на определенном этапе онтогенеза /Spen -cer , Harris,1964/. Аналогичные данные получены также для ряда других ферментов: УДФГ-4-эпимеразы, УДФГ-фосфорилазы и тими-динкиназы, активность которых возрастала на определенном этапе морфогенеза у энуклеированных Acetabularia практически синхронно с нормальными водорослями. Механизм такой регуляции остается неясным. Следует отметить, что тимидинкиназа кодируется органельным геномом, и синтез ее в нормальных клетках резко усиливается к моменту начала репликации ДНК ядра /Schweiger, Berger ,1979/.
Регулирующая роль цитоплазмы в функционировании ядра была также показана в экспериментах по трансплантации ядер у амфи 12 бий /Гердон,І977; Gurdon ,1971,1979/. Так, пересадка ядра из клетки нейрулы, синтезирующей все типы РНК, в цитоплазму яйцеклетки привела к полному прекращению синтеза РНК в течение часа. Пересадка ядер средней бластулы, у которых синтез РНК отсутствует, в цитоплазму растущего ооцита вызывала синтез РНК того типа, который характерен для ооцита на этой стадии: вначале высокомолекулярной нерибосомной РНК, в конце дробления -тРНК, в период гаструляции - рРНК /Гердон,1977, Gurdon ,1979/.
Отмечена миграция определенных типов белков из цитоплазмы в пересаженные ядра. Ядра, трансплантированные в ооциты Хепо-pus , интенсивно аккумулируют гистоны и почти не аккумулируют бычий сывороточный альбумин, специально инъецированный в цитоплазму / Gurdon ,1979/. Напротив, ядра, пересаженные в неопло-дотворенные яйцеклетки, теряли ряд негистоновых белков / Gur -don ,1979/. Обмен негистоновыми белками между цитоплазмой и трансплантированным ядром зафиксирован также DiBerardino /1979/. Во всех этих опытах трансплантированные ядра вели себя точно так же, как собственные ядра ооцитов или яйцеклеток. Ядра, не обменивающиеся белками с цитоплазмой, оказываются неспособны к нормальному развитию / Gurdon ,1979/.
Молекулярно-генетичеекая природа ЦМС
Как уже упоминалось, цитоплазматическая мужская стерильность является результатом взаимодействия измененной цитоплазмы с определенным ядерным генотипом. Независимо от того, как она возникает: I/ объединением "несовместимых" ядра и цитоплазмы или 2/ в результате мутации в генетической системе цитоплазмы - экспрессия генов ядра осуществляется в присутствии измененной цитоплазмы, что оказывает влияние на формирование мужского гаметофита, тогда как в целом растения развиваются нормально. Развитие же мужской генеративной сферы в определенный момент нарушается, причем затронутыми оказываются многие звенья метаболизма. Результатом такого аномального развития яв-ется дегенерация пыльцы.
Причины наблюдаемых нарушений, наследующихся исключительно по материнской линии, следует искать в генетических системах цитоплазмы, прежде всего в хлоропластах и митохондриях.
У кукурузы ЩІС имеет мутационную природу. На основании данных о значительных изменениях структуры и функционирования митохондрий в мужском гаметофите растений с ЩЮ, часть из кото рых процитирована в начале данного обзора, в начале 70-х годов Н.В.Турбиным и А.Н.Палиловой была впервые разработана теоретическая модель взаимодействия ядерных и митохондриальных геномов при ЦМС /Турбин, Палилова,1970,1972/.
Согласно этой модели, синтез митохондриальных белков, необходимых для формирования полноценных митохондрий, контролируется структурными плазмогенами, локализованными в митохонд-риальном геноме. Эти структурные плазмогены регулируются плазмо геном-регулятором, который кодирует структуру репрессора,/р/,и ядерным геном Rf , контролирующим синтез индуктора /И/. Мито-хондриальный белок /М/ начинает синтезироваться только тогда, когда под контролем ядерного гена Ef в клетках пыльника образуется достаточное количество индуктора, связывающего репрес-сор и тем самым индуцирующего транскрипцию структурного плаз-могена /Пс/, /см. рис. 2/. Б нормальной цитоплазме биосинтез
Рис. 2. Схема взаимодействия ядерных генов и плазмогенов при ЩО у кукурузы. индуктора, контролируемый ядерным геном Rf /или rf / и биосинтез ре-прессора под контролем плазмогена-регулятора уравновешены так, что на соответствующих стадиях онтогенеза пыльников происходит дерепрессия структурного плазмогена и осуществляется синтез белка, необходимого для формирования нормальных митохондрий.
В случае ЦМС предполагается мутация плазмогена-регулятора, вызывающая увеличение скорости биосинтеза репрессора. Скорость синтеза репрес 34 сора под контролем рецессивного аллеля rf оказывается недостаточной, структурный плазмоген останется в репрессированном состоянии, и необходимый митохондриальный белок не будет синтезирован, что повлечет за собой формирование аномальных митохондрий и в конечном счете стерильность пыльцы. Только доминантный аллель гена Rf , обладающий большей скоростью синтеза индуктора, обеспечитт в этих условиях достаточную концентрацию молекул индуктора для связывания репрессора, что приве ре дет к депрессии структурного плазмогена, синтезу необходимого митохондриального белка и восстановлению фертильности /Турбин, Палилова,1970,1975/. Предполагалась также гетерогенность митохондрий в дифференцированных тканях, что обеспечивает их нормальную функцию в целом организме /Турбин, Палилова,1972/.
Целый ряд звеньев этой модели, которые во время ее создания были только гипотезами, в ходе последующего изучения ЦМС современными методами стали доказанными фактами. Так, была обнаружена гетерогенность митохондриальной ДНК /vedel , Quetie 1974,1977; Levings , Fring,I979; Dale et al., 1980/. Оказалось, что мтДНК организована в виде отдельных молекул, содержащих различную генетическую информацию - "митохондриальных хромосом" / Sederoff et аЛ,Д982/. У кукурузы описано по крайней мере четыре класса кольцевых молекул, имеющих молекулярный вес от ЗбхТО6 до 93хЮ6 /Levings , Pring,I979/. Возможно, отдельные молекулы мтДНК присущи определенному виду митохондрий /Палилова, Фомченко,1980/. Не исключено, что имеют место оба явления: как гетерогенность самих митохондрий, так и присутствие в отдельных митохондриях разных молекул ДНК. Предполагается, что дефект митохондрий при ЦМС проявляется именно в тканях формирующегося пыльника в связи с теми стрессовыми условиями, которые создаются в тапетуме и спорогенных клетках в период мейоза, когда число митохондрий на клетку увеличивается за короткий период времени в 20-40 раз. Видимая дегенерация митохондрий у Т-форм начинается именно в этот период /warmke , Lee ,1977,1978/.
Приготовление геля и проведение электрофореза
Навеску колосков растирали в фарфоровой ступке при +40 с равным, а на стадии двуядерной пыльцы - с двойным весовым количеством экстрагента и стеклянным песком. В зависимости от цели исследования использовали экстрагенты следующего состава:
В качестве экстрагента при определении молекулярной гетерогенности и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фос-фоглюконатдегидрогеназы, гексокиназы применяли трис-глицинат-ный буфер - 0,005М по трису, содержащий 0,01М этилендиаминтет-раацетат /ЭДТА/, 0,0Ш бета-меркаптоэтанол, 0,01М восстановленный глутатион / GSH /, рН 7,8.
Злектрофоретическое исследование набора изоформ амилаз и фосфорилазы крахмала проводили, используя в качестве экстрагента трис-глицинатный буфер - 0,005М по трису с добавлением 0,01М ЭДТА, 0,01М бета-меркаптоэтанол или вместо последнего 0,005М дитиотреитол, рН 7,8.
При определении альфа-амилазной и суммарной амилазной активности вытяжку готовили на 0,2М ацетатном буфере, содержащем 0,2$ хлористый кальций, 0,01М бета-меркаптоэтанол, рН 5,6 /Briggs ,1961/.
Активность рибулезодифосфат-карбоксилазы определяли, экст рагируя листья в 10-кратном количестве 0,05М трис-солянокисло-го буфера, содержащего 0,OOOIM ЭДТА, 0,ООШ хлористого магния, 0,005М дитиотреитола, рН 8,0.
Гомогенаты исследуемых тканей растений отжимали через капроновую ткань /сито № 55/ и центрифугировали 15 минут при 17000 на центрифуге К-70 /ГДР/ при +2, +5С. Центрифугат отжимали чере з бумажный фильтр с желтой лентой / Filtrak /.
Исходные компоненты геля перекристаллизовывали - акрила-мид из хлороформа, метилен-бисакриламид из ацетона / Loening , 1967/.
В предварительно проведенных исследованиях мы выяснили, что глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа дает более четкое разделение при электрофорезе в случае использования 5#-ного геля /испытывали 5$, 6$, 7$ и 8$ по акриламиду гели/. Остальные ферменты анализировали в 7$ геле.
Для выявления гексокиназы в состав геля при полимеризации добавляли глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу фирмы Fluka - 0,7 Е на I мл компонентов геля / Harrison ,1974/.
При определении молекулярной гетерогенности амилаз в состав геля включали 0,0625$ крахмал /Федоров и др., 1973/, «С-амилазы определяли, используя в качестве субстрата 0,0625$ f -limit декстрин /приготовление описано ниже/. -амилазу идентифицировали как зоны амилазной активности, выявляющиеся на электрофоре граммах при включении в гель крахмала, и отсутствующие при заїдене крахмала на специфический для /-амилаз субстрат - J -limit декстрин /Van Onckelen et al , 1977/.
Через час после добавления к дегазированным компонентам геля катализатора - надсернокислого аммония в конечной концентрации 0,07$ - вытяжки смешивали с половинным объемом 40$-ной сахарозы с растворенным в ней 0,001$ бромфеноловым синим и 50 или 100 микролитров полученной смеси наносили на гель.
Проводили вертикальный электрофорез в трубках по методике, описанной Orns-fcein /1964/ и Davis /1964/ в аппарате фирмы Reanal , угольные электроды в котором были заменены платиновыми. Первые 30 минут электрофорез проводили при токе 2 миллиампера на трубку, затем 45-60 минут при 4 ма/трубку.
30 мг )3-амилазы /Реахим, диализованный препарат/ растворяли в 20 мл дистиллированной воды и добавляли к 1,5$ раствору крахмала в 0,0125 М ацетатном буфере, рН 5,6 с 0,008 М хлористым натрием. Полученную смесь выдерживали I час при комнатной температуре /van Onckelen et al.,I977/. Для обессоливания пропускали полученный раствор через колонку с сефадексом G -25, после чего отбирали фракции, имеющие наибольшую оптическую плотность при 230 нм,и высушивали их в сублимационной сушилке Б 72 /США/, -амилазу в полученном препарате инактивировали прогреванием при Ю0С.
Выявление множественных молекулярных форм ферментов на электрофореграммах
Как уже отмечалось во введении, основная цель проводимых нами исследований состоит в выяснении генетико-биохимических механизмов прекращения развития пыльцы на определенных стадиях микроспорогенеза у растений с ЦМС, а именно установление роли в этих процессах ядерных генов, контролирующих активность и молекулярную гетерогенность ряда ключевых ферментов углеводного обмена.
Для решения этой задачи необходимо было изучить онтогенетические изменения ферментов углеводного обмена при формировании пыльцы у фертильных растений кукурузы разных генотипов и сравнить особенности поведения отдельных ферментов в процессе развития пыльцы у фертильных растений и их стерильных аналогов того же генотипа.
Было изучено шесть ключевых ферментов, связанных с взаимопревращением углеводов, в частности, с синтезом и расщеплением крахмала /рис.3/.
Исследование гексокиназы представляет интерес в связи с тем, что этот фермент катализирует реакцию, вовлекающую глюкозу в углеводный обмен. Образующийся глюкозо-6-фосфат участвует затем в процессе гликолиза, либо в пентозофосфатном цикле, либо превращается ферментативно в глюкозо-I-фосфат и используется для синтеза крахмала. Таким образом, гексокиназу следует считать одним из узловых ферментов углеводного обмена / Batra Mehta »1981/, ибо с катализируемой ею реакции начинается ряд важнейших процессов синтеза, распада и взаимопревращения углеводов.
Были изучены также два ключевых фермента пентозофосфатно-го цикла, глюкозо-6-фюсфатдегидрогеназа и 6-фосфоглюконатдегид-рогеназа. В ходе реакций этого цикла восстанавливается НАДФ, образуются фосфорилированные пентозы, которые входят в состав полимеров клеточной стенки, а также превращаются в ароматические аминокислоты. Одним из важнейших продуктов этого цикла является рибулозо-5-фосфат, необходимый для синтеза нуклеиновых кислот /Гэлстон и др., 1983/.
Определяли также набор множественных молекулярных форм . фосфорилазы крахмала - фермента, конкретная роль которого в обмене крахмала дискутируется /ozbun et al.,I973; Сакало, Горо-вая,1979/. Одни исследователи считарэт, что фермент этот у растений катализирует лишь расщепление крахмала/фВау , Nelson , 1968; Turner , Turner Д975/, другие указывают на участие фосфорилазы в синтезе наряду с крахмал-синтетазой / Hawker et al., 1979/. Некоторые данные свидетельствуют о том, что в пыльниках фосфорилаза может являться основным крахмало- синтезирующим ферментом, тогда как крахмалсинтетаза играет второстепенную роль /singh et а1.Д978/. К сожалению, попытки определить активность фосфорилазы в вытяжках тканей пыльников оказались безуспешными, что, очевидно, связано с ингибирующим действием J -амилаз на этот фермент / whelan ,1955/.
Исследовали также молекулярную гетерогенность и активность Х- и -амилаз - ферментов, гидролизующих крахмал.
Гексокиназа- /АТФ: Д-гексоза-б-фосфотрансфераза, 2.7.I.I./ катализирует следующую реакцию: АТФ + Д-гексоза -іС2Ш2а . АДФ + Д-гексозо-6-фосфат
Результаты исследования молекулярной гетерогенности гек-сокиназы на разных стадиях развития пыльцы фертильных линий ку курузы представлены в таблице I.
Как видно из таблицы I, изученные фертильные линии различаются по числу и относительной подвижности молекулярных форм гексокиназы. У линии ВИР 29 на всех стадиях развития пыльцы выявляется только одна молекулярная форма с относительной элект-рофоретической подвижностью /ОЗП/ 0,63 /рис.4а/. У линий ВИР 44 и ВИР 40 обнаружено по два электрофоретических компонента гексокиназы, ОЭП которых зависит от генотипа линий. У этих же линий отмечены онтогенетические изменения молекулярной гетерогенности гексокиназы. Так, фракция с ОЗП 0,59 в пыльниках линии БИР 44 выявляется на всех стадиях, а изоформа с ОЭП 0,63 отсутствует на стадии археспория, появляется на стадии тетрад, а у двуядерной пыльцы вновь исчезает. У линии БИР 40 были исследованы только поздние стадии формирования пыльцы, однако и здесь отмечены онтогенетические изменения: из двух полос более быстрая, с ОЭП 0,61, обнаруживается на обеих стадиях, тогда как более медленная, с ОЭП 0,53, на стадии двуядерной пыльцы не выявлялась.
Таким образом, у двух из трех изученных фертильных линий наблрэдается уменьшение числа молекулярных форм гексокиназы при переходе от одноядерной к двуядерной пыльце. Следует отметить также, что, хотя у линии БИР 29 гексокиназа представлена одной изоформой на протяжении всего микроспорогенеза, интенсивность окраски этой полосы на стадии двуядерной пыльцы резко уменьшается Такое же уменьшение активности гексокиназы на стадии двуядерной пыльцы отмечено у линии БИР 44 и ВИР 40. По-видимому, экспрессия генов, контролирующих гексокиназу в пыльниках кукурузы, в процессе формирования пыльцы уменьшается, определенные аллели, возможно, вообще перестают транскрибироваться, что приводит к исчезновению кодируемых ими молекулярных форм фермента на электрофореграммах.
