Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 4
1.1. Рис 4
1.2. Ботаническая характеристика риса 4
1.3. Генетическая характеристика риса 4
1.4. Системы мужской стерильности 6
1.4.1. Цитоплазматическая мужская стерильность 7
1.4.2. Генетическая мужская стерильность, чувствительная к
окружающей среде (EGMS) 10
1.4.3. Химически индуцированная мужская стерильность 10
1.5. Биохимические и цитогенетические особенности растений с ЦМС 11
1.6. Механизм развития ЦМС у растений 12
1.7. Влияние стерильной цитоплазмы на различные признаки 13
1.8. Производство гибридного риса 15
1.9. Молекулярные особенности генов ЦМС 15
1.10. Восстановление фертильности 24
1.10.1. Генетический контроль восстановления фертильности 27
1.10.2. Генетика популяции восстановителей 28
1.10.3. Механизм восстановления 28
1.11. Молекулярные маркеры 31
1.11.1 .ДНК-маркеры 33
1.11.1.1. RAPD-маркеры 34
1.11.1.2. STS-маркеры 36
1.11.1.2.1. CAPS- маркеры 36
1.11.1.2.2. SSR- маркеры 37
1.11.1.2.3. SCAR- маркеры 39
1.12. Селекция с помощью маркеров (MAS) 41
1.13. Генетические карты сцепления 43
1.14. Методы картирования локусов количественных признаков 44
ГЛАВА2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48
2.1. Исходный материал 48
2.2. Изучаемые признаки 48
2.2.1. Фертильность пыльцы и озерненность метелки 48
2.2.2 Высота растений и цвет рыльца 49
2.3. Выделение ДНК риса для ПЦР-анализа 51
2.4. Амплификация SSR- маркеров 51
2.5. Синтез и создание новых праймеров 54
2.6. CAPS-маркеры 54
2.7. Выявления полиморфизма митохондриальной ДНК между ЦМС линиями и их закрепителями ЦМС 55
2.7.1. Амплификация ДНК SCAR- праймерами 56
2.7.2. Амплификация ДНК RAPD-методом 56
2.8. Выделение фрагментов ДНК и секвенирование 58
2.9. Клонирование ДНК фрагментов 59
2.9.1. Лигирование ДНК фрагментов в pGEM-T вектор 59
2.9.2. Трансформация компетентных клеток 59
2.10. BSA- анализ 60
2.11. Анализ сцепления 61
2.12. Картирование локусов количественных признаков (QTL) 62
2.13. Изучение характерных особенностей и структуры генов восстановления фертильности 62
2.13.1. Изучение характерных особенностей и структуры рнее клонированных генов восстановления фертильности у разных
растений 63
2.13.2 Классификация генов, находящихся в ДНК фрагменте, несущем молекулярные маркеры, сцепленные с геном восстановления
фертильности 63
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 65
3.1. Идентификация молекулярных маркеров, сцепленных с цитоплазматической мужской стерильностью WA-типа риса 65
3.1.1. Создание SCAR- маркеров 65
3.1.2. RAPD- анализ 67
3.1.3. Преобразование RAPD- маркеров в специфичные SCAR-
маркеры 69
3.2. Тип наследования фертильности 72
3.3. Влияние стерильной цитоплазмы (ЦМС) на различные признаки.... 76
3.4. BSA- анализ 77
3.5. Картирование гена восстановления фертильности R/3,
действующего в нормальных условиях в популяции Neda-A х IR36 79
3.6. Обнаружение QTL-локусов восстановления фертильности в стрессовых условиях внешней среды 81
3.6.1. Выявление QTL-локусов с главными эффектами 82
3.6.1.1. Выявление QTL-локусов методом картирования по отдельным маркерам 82
3.6.1.2. Множественно-интервальное картирование QTL-локусов восстановления фертильности 83
3.6.2. Анализ взаимодействия между обнаруженными QTL-локусами (I-QTLs) 85
3.7. Идентификация и локализация гена R/4 и сцепленных с ним ДНК-маркеров в популяции Neda-A х IR24 87
3.8. Идентификация и локализация гена R/4 и сцепленных с ним ДНК-маркеров в популяции Neda-A х IR28 88
3.9. Идентификация и локализация гена R/5 и сцепленных с ним ДНК-маркеров в популяции Neda-A х IR62030 89
3.10. Картирование гена R/4 в популяции Neda-A х Amoll 90
3.10.1. Обнаружение R/4 гена у Amoll и картирование региона R/4- гена 90
3.10.2. Подробное картирование региона R/4 гена 92
3.10.3. Физическая локализация фрагмента, несущего R/4- ген и сцепленные с ним маркеры 94
3.11. Изучение характерных особенностей и структуры генов восстановления фертильности 97
3.11.1. Классификация ранее клонированныех генов восстановления фертильности разных растений 98
3.11.2. Классификация генов, находящихся в ДНК фрагменте, несущем молекулярные маркеры, сцепленные с геном восстановления фертильности ЦМС WA риса 102
3.12. Идентификация наиболее вероятного гена - кандидата восстановления фертильности ЦМС WA- типа 109
3.13. Изучение роли гена - кандидата RflB в проявлении восстановления фертильности 112
ВЫВОДЫ 117
РЕКОМЕНДАЦИИ 119
БЛАГОДАРНОСТИ 120
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121
ПРИЛОЖЕНИЕ 150
- Генетическая характеристика риса
- Исходный материал
- Идентификация молекулярных маркеров, сцепленных с цитоплазматической мужской стерильностью WA-типа риса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск молекулярных маркеров для решения задач по изучению и картированию экономически важных генов высших растений представляет одну из важных и актуальных задач селекции и генетики [Tingey et al., 1992; Tanksley, 1993; Yu et al., 1995]. В последние десятилетия молекулярные маркеры нашли очень широкое применение в различных областях генетических исследований [Caetano-Anolles, 1993; Mohan et al., 1997]. Наличие большого числа молекулярных маркеров, распределенных по всему геному, дает возможность эффективно картировать интересующие исследователей гены. Молекулярные маркеры позволяют избежать в генетическом анализе проблем, связанных с взаимодействием разных локусов [Tanksley, 1993; Yu et al., 1995].
Молекулярные маркеры широко используют для исследования сомаклональной изменчивости [Кокаева и др., 1997; Осипова и др., 2001], точной и быстрой паспортизации различных видов и сортов растений [Multani and Lion, 1995; Журавлев и др., 1996; Sanchez-Escribano et al., 1999; Кочиева и др, 2003], идентификации соматических гибридов [Гавриленко и др., 1994; Дорохов и Клоке, 1997], для изучения филогенетического родства [Gonzales and Ferrer, 1993; Lanza et al., 1997; Chowdari et al., 1998].
Молекулярные маркеры значительно облегчают процесс клонирования генов [Tanksley et al., 1995; Mohan et al., 1997], а также важны при изучении полигенных локусов количественных признаков (QTL) [Tanksley, 1993; Van der Knaap et al., 2002].
Для изучения организации геномов растений генетики используют самые разные объекты, имеющие как чисто теоретическое значение (легкость проведения генетических исследований и хорошая изученность), так и
практическое значение (важность для сельскохозяйственного использования). К таким, широко используемым генетическим объектам, можно отнести и рис.
Рис (Oryza sativa L.) является важной сельскохозяйственной культурой и удобной моделью для генетических исследований. Рис выращивается как продовольственная культура. Жизнь около половины населения мира зависит от этой культуры. Среди различных видов растений, на которых коммерчески используются гибриды Fb рис занимает ведущее место. Коммерческое использование гибридной технологии является одним из самых важных применений генетики в сельском хозяйстве. Это имеет не только важное значение для продовольственной безопасности, но оказывает также пользу окружающей среде [Virmani et al., 2003].
В настоящее время опубликованы карты хромосом риса, содержащие молекулярные маркеры [McCouch. et al., 2002]. Благодаря использованию молекулярных маркеров удалось создать «интегрированую» карту хромосом риса [Kishimoto et al., 1993], объединившую морфологические и молекулярные локусы. Большое число работ по картированию генов с применением молекулярных маркеров у риса посвящены изучению восстановления фертильности [Zhang et al, 1995 , 1997 and 2002; Zhuang et al, 2001 и 2002; He et al, 2002; Jing et al, 2001; Yao et al, 1997], но из-за сложности фенотипического проявления, наличия нескольких ЦМС- систем риса -значение многих генов и генов модификаторов в экспрессии признака точно не идентифицированы. Работ по клонированию генов восстановления фертильности риса немного [Kazama, Toriyama, 2003; Komori et al., 2003; Akagi et al., 2004]. Характерные особенности и структура генов восстановления фертильности, особенно у ЦМС WA-типа, не достаточно изучены. Поэтому требуется дополнительный поиск новых морфологических
и молекулярных маркеров, их локализация и изучение характерных особенностей, структуры генов восстановления фертильности.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлся поиск и идентификация новых молекулярных маркеров, сцепленных с ЦМС и с генами восстановления фертильности, создание генетической карты для локализации важных локусов восстановления фертильности ЦМС WA- типа и изучение характерных особенностей, структуры этих генов. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Идентифицировать молекулярные маркеры, сцепленные с ЦМС и
позволяющие различать линии с ЦМС и линии закрепители.
2. Идентифицировать новые молекулярные маркеры, сцепленные с геном
(генами) восстановления фертильности.
3. С помощью молекулярных маркеров идентифицировать локусы'
количественных признаков (QTL), контролирующие восстановление
фертильности в стрессовых условиях внешней среды.
4. Изучить структуру и организацию генов восстановления фертильности и
определить возможный ген- кандидат восстановления фертильности ЦМС
WA -типа.
Генетическая характеристика риса
Рис принадлежит к роду Oryza, семейства Gramineae, ордеру Glumiflorae," классу Monocotyledoneae, и филогенетической ветви Angiospermae [Chang, 1976]. Рис имеет широкое распространение и создано большое число сортов и" линий риса путём сортового отбора. В настоящее время ведется большое количество селекционных программ в различных национальных и международных институтах. В отделе сохранения ресурсов Международного Исследовательского Института Риса (IRRI) (International Rice Research Institute) на Филиппинах сохраняется больше чем 80000 сортов/линий посевного риса и диких родственных видов. Большой объем сортов и видов риса также поддерживается отделами сохранения генетических ресурсов в различных странах. Однако считается, что несколько тысяч линий риса имеется в диком виде [Virmani et al., 2003].
Генетическая характеристика риса Род Oryza включает виды с количеством хромосом 2п= 24 или 48 [Chang, 1976]. Большинство сортов посевного риса принадлежит подвидам О. sativa L. Другой вид риса - О. glaberrima Steud., выращивается в центральной части Западной Африки. Сегодня, посевная площадь под разновидностью О. glaberrima незначительна. Культурные виды риса имеют 18 известных диких родственных видов. Числа хромосом, геномы и распространение видов Oryza показаны в таблице 1-1. для генетиков: однолетний цикл, самоопыляемость; у Oryza sativa небольшое число хромосом (2п=24; табл. 1.1). Хотя известно около 500 признаков, только приблизительно одна треть из них была картирована на хромосомах риса [Kishimotoetal., 1993].
Насыщенная генетическая карта хромосом риса уже построена. Значительный полиморфизм риса по морфологическим признакам обеспечил достаточное количество маркеров для первых генетических исследований и заложил основы для их построения [McCouch et al., 1988]. В настоящее время опубликованы карты хромосом риса, содержащие молекулярные маркеры [Tanksley et al., 1991; Wang 1992]. Благодаря использованию общих маркеров удалось создать «интегрированую» карту хромосом риса [McCouch et al., 1988], объединившую морфологические и молекулярные маркеры. Эта карта состоит из 135 локусов, соответствующих клонам, отобранным из PstI геномной библиотеки, и охватывает 1389 сМ генома риса. С тех пор были созданы постоянные популяции риса для дальнейшего молекулярного картирования [Guiderdoni et al., 1990; IRRI 1991; Tanksley et al., 1991; Wang 1992]. Zhu и коллеги (1994) картировали 100 RFLP маркеров, и 8 локусов изоферментов на популяции DH, которые были распределены по всем 12 хромосомам со средним расстоянием 8.5 сМ.
Последняя версия SSR- карты сцепления риса, опубликованная в 2002 г. McCouch и коллегами [McCouch et al., 2002], состоит из 2240 SSR маркеров. Feltus и коллеги (2004) идентифицировали 408,898 потенциальных полиморфизмов (SNPs/INDELs) между двумя подвидами риса indica и japonica [Feltus et al., 2004].
Исходный материал
В тесте на определение фертильносте пыльцы, отбирали 5-6 пыльников, раздавливали в красителе «Александер» или в 1% «12-К1» растворе и окрашивание пыльцы наблюдали под микроскопом. Процент фертильносте пыльцы оценивали в 2-3 поля зрения. В среднем в одном поле было 100-120 зерен пыльце. Процент фертильносте метёлки, рассчитывли путём деления числа фертильных колосков на их общее количество. На основании определения фертильносте, выделяли 4 класса растений: 1. стерильные (фертильность пыльцы 10% и фертильность метёлки 1%). 2. частично стерильные (фертильность пыльцы 10-70% и фертильность метёлки 1-50%). 3. частично фертильные (фертильность пыльцы 70-85% и фертильность метёлки 50-70%), и 4. фертильные (фертильность пыльцы 85% и фертильность метёлки 70%). Для оценки соответствия наблюдаемых генетических соотношений с ожидаемым соотношениями F2 популяции использовали критерии х2.
Высота растений и цвет рыльца
Родительские линии несли также маркерные признаки «цвет рыльца» и «высота растения» (табл. 2.1). Генетические символы маркерных генов высоты растений iph, plant height) и цвета рыльца (ps-1, purple stigma 1) (рис. 2.1) и их локализация в группе сцепления даны в таблице 2.3. Выделение ДНК риса для ПЦР - анализа
ДНК выделяли из свежих листьев риса методом, описанным Saghai-Maroof и др. [Saghai-Maroof et al., 1984] с незначительными модификациями:
1. 0.5 cm свежих листьев помещали в пробирку Эппендорф объемом 1.5 мл, содержащую 100 мкл лизирующего буфера (в состав которого входят 1 % СТАВ, 700 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl (рН 8) и 50 мМ EDTA (рН 8.0)), и гомогенизировали 30-40 сек.
2. Добавляли 500 мкл лизирующего буфера, инкубировали 40 мин. при 65С, периодически помешивая.
3. Добавляли 500 мкл хлороформа (хлороформ : изоамиловый спирт 24 : 1), перемешивали вручную, центрифугировали 10 мин. при 14000 об ./мин.
4. Переносили верхнюю водную фазу в чистую пробирку.
5. Добавляли 400 мкл изопропанола, осторожно перемешивали вручную,
инкубировали 5 мин. при комнатной температуре.
6. Центрифугировали 10 мин. при 14000 обУмин.
7. Осторожно, не задевая осадка, удаляли супернатант.
9. Добавляли к осадку 500 мкл 70% этанола, инкубировали 5 мин. при комнатной температуре, центрифугировали 2 мин. при 14000 обУмин.
10. Тщательно удаляли супернатант, осадок подсушивали до полного испарения этанола 15-20 мин. в вакууме, растворяли в 50 мкл деионизированной воды.
11. Хранили ДНК при температуре 4С.
12. Концентрацию ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле относительно контроля.
Идентификация молекулярных маркеров, сцепленных с цитоплазматической мужской стерильностью WA-типа риса
ЦМС является результатом взаимодействия цитоплазматических и ядерных компонентов. Многочисленные исследования сосредоточены на различиях в митохондриальных геномах между линиями с ЦМС и их линиями закрепителями. Однако высокая степень полиморфизма митохондриального генома между линией с ЦМС и ее закрепителями не позволяет идентифицировать митохондриальные факторы, контролирующие мужскую стерильность. Используют линии одинаковые по ядерному геному (оба имеют rfrf генотип), но отличаются по цитоплазме для выявления полиморфизма: линия с ЦМС (А-линия) имеет ненормальную S цитоплазму, но ее фертильный аналог (В-линия) имеет нормальную N цитоплазму. По этой причине они являются аллоплазматическими изогенными линиями.
Создание SCAR- маркеров
Для идентификации молекулярных маркеров, различающих генотипы ЦМС линий и линий закрепителей, были разработаны 2 специфичных праймера (SCARmtOlF и R; табл. 2.6, стр. 56) на основе митохондриальной последовательности AY187000 от линий "Zhenshan 97-А" и 2 специфичных праймера (SCARmt02F и R; табл. 2.6, стр. 56) на основе митохондриальной последовательности AY181205 от линий "Zhenshan 97-В", соответственно (Yang et al., 2002).
Одна пара специфичных праймеров SCARmtOlF и R при ПЦР дала ко-доминантные фрагменты, различающие генотипы ЦМС линии и линии закрепителя (рис. 3.1). Амплифицированный фрагмент у всех линий закрепителей был немного длиннее, чем у ЦМС линий.
Рис. 3.1. Образцы ПНР - амплификации праймером SCARmtOl. S- ЦМС. N-закрепитель
Амплифицированные фрагменты с использованием SCARmtO 1 на ДНК линий Neda-A, IR68897-A и IR68897-B были успешно секвенированы (Силекс-М, Москва). Результаты секвенирования показывают, что фрагмент ДНК у линии закрепителя (IR68897-B) на 6-7 п.н длиннее чем у ЦМС линий (рис. 3.2).
Сравнение секвенированной последовательности локуса SCARmtOl у ЦМС линии "Neda-A" с последовательностями ДНК базы данных ГенБанк показало, что данная последовательность почти польностью (96%) гомологична участку митохондриальной последовательности риса линии 93-11 (подвида indica) и линии Nipponbare (подвида japonica), а также участку (42 п.н) митохондриальной последовательности пшеницы (Triticum aestivum), участку (42 п.н) митохондриальной последовательности гена tRNA-Asp (trnD-GUC) Elytrigia elongate и участку (45 п.н) митохондриальной последовательности табака (Nicotiana tabacum).
