Введение к работе
Введение. Актуальность проблемы. Одной из центральных задач науки о растениях является исследование гормональной регуляции роста и развития растений. Это объясняется тем, что вся жизнь растения, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и заканчивая отмиранием и смертью, происходит под контролем фитогормонов. Также фитогормоны играют важную роль в реакции растений на внешние воздействия. Именно благодаря большим адаптивным возможностям, растения могут вести «сидячий образ жизни», приспосабливаясь к изменяющимся условиям окружающей среды.
Воздействие гормонов на клетки осуществляется через специфические рецепторы. Изучение механизма действия гормонов заключается в исследовании их рецепторов и процессов, приводящих к проявлению специфического гормонального ответа. Кроме того, состав форм гормона и их количественное соотношение, необходимые для проявления того или иного ответа растительным организмом, поддерживаются в клетке белками-транспортерами гормонов и ферментами метаболизма гормона (ферментами синтеза, распада, модификации, которые могут преобразовать активную форму гормона в неактивную).
Существует пять основных групп гормонов растений - это ауксины, цитокинины, гиббереллины, этилен и абсцизовая кислота. Цитокининам принадлежит важная роль в течение всей жизни растений. Они участвуют в регуляции экспрессии цитокинин-чувствительных генов растений, регуляции деления клеток, дифференцировке хлоропластов, индукции стеблевого морфогенеза, осуществлении контроля корневой системы над ростом и развитием надземных органов растения, и др.
Описан мембранный рецептор цитокининов - гистидинкиназа, которая воспринимает внешний по отношению к клетке цитокинин. Кроме того, накапливаются факты, которые говорят о существовании альтернативного пути передачи цитокининового сигнала в растениях. В связи с этим был обнаружен ядерный растворимый цитокинин-связывающий белок 67 кДа (ЦСБ67), который в присутствии цитокинина активирует транскрипцию in vitro. Этот белок является кандидатом на роль внутриклеточного растворимого рецептора цитокинина растений, подобно ядерным рецепторам стероидных гормонов животных.
Обнаружение как мембранного, так и кандидата на внутриклеточный растворимого рецептор цитокинина, говорит о сложности системы восприятия цитокининового сигнала, и ставит вопрос о разделении функций между этими рецепторами. Так как мембранный рецептор цитокинина в основном локализован в корне, возможно, что в надземной части рецепция цитокинина происходит с помощью других белков. Возможно также, что мембранный и растворимый рецепторы цитокинина необходимы одновременно в растительной клетке, как это известно для хорошо изученных рецепторов стероидных гормонов животных. Мембранные рецепторы стероидных гормонов животных индуцируют быстрые ответы (активация сигнальных каскадов), ядерные рецепторы — более медленные ответы (усиление или ослабление транскрипции определенных генов). В некоторых случаях показано взаимодействие между мембранными и ядерными рецепторами. Для растений на настоящий момент такие данные отсутствуют.
Для понимания того, как гормональный цитокининовый сигнал регулирует рост и развитие растительного организма, проводится изучение белков-рецепторов цитокинина, а также цитокинин-связывающих белков с другими функциями. В связи с этим
ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ было дать комплексную оценку структурных и функциональных свойств цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L., Hordeum vulgare L., Oryza sativa L.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Оценить структурное сродство цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и мембранного рецептора цитокининов - гистидинкиназы CRE1/WOL/AHK4 Arabidopsis thaliana L..
-
Сравнить структурные и функциональные свойства цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 Hordeum vulgare L. и ауксин-связывающего белка Джонса АСБ65 Vigna radiata L.
-
Оценить функциональную идентичность ЦСБ67 и транскрипционных систем, выделенных из растений, относящихся к разным таксономическим группам: Классу Однодольных (Hordeum vulgare L.) и Классу Двудольных (Arabidopsis thaliana L.).
-
Определить структуру новых обнаруженных цитокинин-связывающих белков растений Arabidopsis thaliana L.и Oryza sativa L.
-
Сравнить степень сродства цитокинин-связывающего белка аденозинкиназы Hordeum vulgare L. к природному цитокинину транс-зеатину со сродством к природному цитокинину зеатинрибозиду, синтетическому цитокинину 6-БАП, производным аденина и нуклеотидам: аденину, аденозину, АТФ, ГТФ, УТФ.
Научная новизна. Впервые показано, что ЦСБ67 не имеет структурного сродства с мембранным рецептором цитокининов - гистидинкиназой CRE1/WOL/AHK4. Впервые сделано предположение о возможной идентичности цитокинин-связывающего белка ЦСБ67 и ауксин-связывающего белка АСБ65 на основании сходных структурных, иммунохимических и функциональных свойств. Показана высокая консервативность белка ЦСБ67 и транскрипционных систем, выделенных из растений Класса Однодольных (Hordeum vulgare L.) и Класса Двудольных (Arabidopsis thaliana L.). Показано сходство структурных и функциональных свойств двух изоформ аденозинкиназы Arabidopsis thaliana L. (At3g09820 и At5g03300). Изучена степень сродства белков аденозинкиназ Hordeum vulgare L. к различным производным цитокининов и гомологичным им молекулам in vitro. В частности, обнаружено, что аденозинкиназа Hordeum vulgare L. не связывает синтетический цитокинин 6-БАП. Впервые показано, что тиаминаза Arabidopsis thaliana L. связывает цитокинин транс-зеатин in vitro.
Практическое значение работы. Метаболизм фитогормонов и механизм их действия исследуется для понимания того, как реализуется онтогенетическая программа растения и как растение реагирует на внешние воздействия. Эти знания крайне важны для решения практических задач биотехнологии и сельского хозяйства, то есть для получения полезных продуктов растительного происхождения в поле, в лаборатории и в заводских условиях.
В ходе проведения данной работы были разработаны и утверждены методические указания для определения индивидуальной чувствительности к пищевым продуктам (в частности, растительного происхождения) мелких домашних и сельскохозяйственных животных.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на V Съезде Общества физиологов растений, Пенза, 15-21 сент. 2003г, на Международной научной конференции «Ломоносов-2008», Москва, 7-11 апр. 2008г, а также на III Всероссийской конференции-школе «Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов», Астрахань, 14-17 авг. 2008г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 3 тезиса докладов, а также 1 методические указания.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, одного приложения и списка литературы.
