Введение к работе
Актуальность проблемы
Неотъемлемой частью генома любого эукариотического организма является кластер рибосомной ДНК (рДНК), представляющий собой тандемно повторенные гены рибосомных РНК (18S-, 5.8S-, 283-подобные), разделенные рядом спейсерных последовательностей - внутренними транскрибируемыми (ITS1 и ITS2), внешним транскрибируемым (ETS) и межгенными, или нетранскрибируемыми (NTS) спейсерами [Gerbi, 1985].
Описанные структурные элементы рДНК обладают различной степенью эволюционного консерватизма - наиболее вариабельными являются спейсерные последовательности [Gerbi, 1985]. Сравнительный анализ молекулярно-генетической изменчивости этой части генома эукариот многие годы используется в качестве удобного инструмента для понимания закономерностей эволюционного процесса [Алёшин и др., 1995; Forterre and Phillipe 1999; Hillis et al., 1996; Hillis and Dixon, 1991].
Кластер рДНК насекомых, в частности тараканов, содержит в своем составе несколько сотен повторяющихся структурно-функциональных единиц и, таким образом, представляет собой типичный пример мультигенного семейства [Dover and Coen, 1981]. Известно, что кластер рДНК представляет собой удобную модель для анализа механизмов изогенизации («согласованной» эволюции) членов мультигенного семейства. Основные генетические процессы, лежащие в основе изогенизации, были описаны на примере рДНК различных эукариот.
Молекулярно-генетическая организация рДНК различных эукариот во многом сходна, в то же время, каждый вид обладает рядом структурных и функциональных особенностей, характерных для данного участка генома. С нашей точки зрения, для комплексного понимания всего разнообразия генетических процессов, лежащих в основе функциональной активности и эволюционной изменчивости живых организмов, необычайно важным является изучение новых, ранее не исследованных видов, то есть традиционно не являющихся «модельными».
Экспериментальные данные последних лет убедительно свидетельствуют в пользу функциональной значимости спейсерных последовательностей рДНК [Sardana et al., 1993] - можно предположить, что структура ETS влияет на интенсивность синтеза рРНК с промотора, локализованного рядом с этой
спейсерной последовательностью. Известно, что эволюция тараканов рода Blatfella сопровождалась освоением новых экологических ниш, для которых более адаптивными являются разные уровни интенсивности метаболизма. Описание структуры ETS близкородственных видов насекомых и «минорных» вариантов ETS в пределах вида и/или в пределах генома индивидуальной особи, с нашей точки зрения, представляется актуальным подходом для изучения механизмов, лежащих в основе эволюционной изменчивости как рДНК, так и геномов живых организмов в целом.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы являлось исследование межвидовой и внутривидовой изменчивости структуры внешнего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК близкородственных видов тараканов рода Blattella: В. germanica, В. asahinai (виды близнецы) и В. lituricollis.
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи данного исследования:
1) Амплифицировать, клонировать, секвенировать и провести
сравнительный анализ структуры ETS близкородственных видов тараканов рода
Blattella: В. germanica, В. asahinai и В. lituricollis.
2) Провести сравнительный анализ внутривидовой и внутригеномной
изменчивости ETS рыжего таракана В. germanica.
Клонировать, секвенировать и провести сравнительный анализ структуры «минорных» вариантов ETS рыжего таракана, то есть тех вариантов ETS, которые не являются основными членами мультигенного семейства рДНК.
Определить закономерности наследования «минорных» вариантов ETS рыжего таракана в индивидуальных скрещиваниях.
5) Для определения эволюционного времени образования минорных
вариантов ETS рыжего таракана
а) клонировать и секвенировать протяженные фрагменты рДНК, содержащие два типа спейсерных последовательностей; «минорные» варианты ETS и ITS1 / ITS2;
6) исследовать уровень внутри- и межпопуляционной изменчивости ITS1
рыжего таракана.
Научная новизна и практическая ценность работы
Впервые проведено исследование структуры ETS трех близкородственных видов тараканов. Показано, что основные межвидовые отличия структур ETS сравниваемых видов заключаются в различном количестве субповторов, формирующих данный тип спейсеров.
Проведен анализ внутривидовой и внутригеномной изменчивости структурной организации ETS рДНК рыжего таракана. Помимо основного варианта внешнего транскрибируемого спейсера, являющиеся основными компонентами рДНК данного вида, выявлены минорные варианты ETS. Впервые показано, что описанные минорные варианты ETS S. germanica, имеют, во-первых, определенные структурные отличия от повторов, характерных для данного вида, и, во-вторых, тип выявляемых отличий соответствует таковым, характерным для межвидовой изменчивости, Можно предполагать, что описанные минорные варианты ETS представляют собой генетический материал для дальнейшей эволюции вида и могут формировать новые варианты кластеров рДНК.
Впервые показано, что минорные варианты ETS формируются за счет рекомбинационных процессов в пределах времени существования вида, и не являются реликтовыми формами, соответствующими предковым таксонам.
Клонированные и секвенированные фрагменты ДНК, выявленные в геноме рыжего таракана и представляющие собой различное сочетание субповторов, лежащих в основе структуры ETS данного вида, могут быть использованы для изучения механизмов регуляции промотора РНК полимеразы I посредством создания соответствующих векторных конструкций, содержащих описанные варианты ETS в качестве элементов модулирующих уровень экспрессии маркерного гена.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на 9-й конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2005; 10-й школе-конференции молодых учёных посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН, Пущино, 2006; XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2006», Москва, 2006; Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, 2006.
Структура и объем диссертации. Публикации.
