Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Структурно-функциональная организация кластера генов рибосомных РІЖ эукариот 12
1.1.1. Общая характеристика организации кластера генов рибосомных РНК эукариот 12
1.1.2. Сравнительный анализ структуры рДНК наиболее изученных видов насекомых 18
1.2. Рибосомная ДНК - биологический хронометр эволюционного процесса 24
1.2.1. Макроэволюция кластера рибосомных генов 24
1.2.2. Микроэволюция кластера рибосомных генов 29
1.3. Характеристика объекта исследований 34
1.3.1. Биология Blattella germanica 34
1.3.2. Обзор данных по генетике В. germanica 42
2. Материалы и методы 47
2.1. Перечень видов тараканов, использованных в данном исследовании 47
2.2. Выборки В. germanica из природных популяций 47
2.3. Условия содержания В. germanica в инсектарии 48
2.4. Постановка скрещиваний 48
2.5. Анализ тотальной ДНК тараканов 49
2.6. Получение зондов и их характеристика 51
2.7. Методы статистической обработки 56
3. Результаты и их обсуждение 60
3.1. Исследование внутривидовой изменчивости структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана (В. germanica L.) 60
3.1.1. Клонирование и анализ первичной последовательности фрагмента рДНК В. germanica 60
3.1.2 Анализ структурной организации кластера рибосомных генов В. germanica 66
3.1.3. Анализ наследования вариантов структуры кластера рибосомных генов В. germanica в индивидуальном скрещивании 73
3.1.4. Анализ вариабельности структуры кластера генов рибосомных РНК в лабораторных линиях и природных популяциях рыжего таракана 77
3.2. Изменчивость рДНК в отряде Blattoptera и возможность ее использования для выявления филогенетических связей В. germanica с представителями данного таксона 99
4. Заключение 107
5. Выводы 114
6. Список литературы
- Общая характеристика организации кластера генов рибосомных РНК эукариот
- Микроэволюция кластера рибосомных генов
- Условия содержания В. germanica в инсектарии
- Клонирование и анализ первичной последовательности фрагмента рДНК В. germanica
Введение к работе
Интерес к структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов обусловлен центральной ролью рРНК в биосинтезе белка, связью структуры рДНК со скоростью развития (Cluster et al, 1987), а также особенностями строения рДНК, отличающими ее не только от уникальных генов, но и от кластеров других многокопийных генов. Характеризуя гены рРНК, важно отметить, что они расположены в геноме в виде тандемного кластера, в каждой единице которого присутствуют высококонсервативные участки, кодирующие рРНК гены, и вариабельные спейсерные последовательности.
Вышеперечисленное, а также наличие механизмов, обеспечивающих согласованную эволюцию рибосомных повторов внутри тандемного кластера (Dover, 1982; Arnheim, 1983; Williams et al., 1989), позволяют использовать рДНК при решении многих вопросов популяционной генетики (Cluster, Allard, 1995; Crease, 1995; Demerida et al, 1995; Suzuki et al, 1994), селекции (Kavanagh, Timmis, 1986; Brown, 1990; Polanco, Perez de la Vega, 1997), систематики, эволюции (Cormean et al, 1992; Schlotterer et al, 1994; Nickrent et al, 1994; Titus, Larson, 1995; Halanych, 1996) и экологии. Кроме того, кластер генов рибосомных РНК является модельной системой для выявления закономерностей эволюции мультигенных семейств (Arnheim et al, 1980а; Long, Dawid, 1980; Coen etal., 1982; Dover, 1982; Coen, Dover, 1983).
Специфичность вариантов рДНК широко используют для паспортизации сортов растений, пород животных и для идентификации видов в сложных сообществах при симбиозе и паразитизме (Appels, Dvorak, 1982; Ellis et al., 1984; Thomas et al., 1993; Lee et al., 1993; Rehner, Uecker, 1994; Beck, Ligon, 1995; Сидоренко и др., 1997).
Вариабельность рДНК в природных популяциях обеспечивает дополнительные генетические маркеры, которые наряду с белковым полиморфизмом и морфологическими признаками используются для мониторинга окружающей среды, а таюке решения проблем микро- и макроэволюции (Kavanagh, Timmis, 1986; Brown, 1990; Polanco et al., 1997).
В настоящее время накоплена обширная информация о структуре рДНК насекомых (Beckingham, 1975; Jakubczak et al., 1990; Алешин и др., 1995), которая свидетельствует о существовании общих черт в макроструктуре рДНК различных видов (последовательность расположения генов, чередование их со спейсерными последовательностями в повторах тандемного кластера рДНК) и индивидуальных особенностей их микроструктуры (тонкое строение генов, высоковариабельных районов нетранскрибируемого и транскрибиремых спейсеров, степень внутривидовой изменчивости последних). Однако, большинство исследователей в своих работах ограничиваются изучением небольших участков кластера рДНК, размером от нескольких сот до полутора тысяч пар нуклеотидов (Harmsen et al., 1995; Cormean et ah, 1992; Kambhampati, 1995, 1996), что осложняет получение целостной картины структурной организации рДНК конкретного вида, а тем более ее внутри- и межвидовой изменчивости. При этом, вне поля зрения исследователей часто остаются не только виды, но семейства и даже отряды насекомых, среди которых отряд Blattoptera является одним из древнейших.
Представители его многочисленны (около 4000 видов) и сильно различаются по морфологическим и поведенческим признакам. Тараканы занимают различные экологические ниши (всеядные синантропные виды; лесные виды, перерабатывающие древесину) и характеризуются неодинаковыми адаптивными способностями.
Самый распространенный в России вид таракана, Blattella germanica (отряд Blattoptera, семейство Blattellidae), является генетически наиболее изученным по сравнению с другими представителями отряда Blattoptera. В отличие от Drosophila melanogaster - классического объекта генетических исследований, с детально изученной во всех отношениях структурой рДНК (Cluster et al., 1987; Terracol, Prud'homme, 1986; Tartof, 1973; Tartof, 1974; Jakubczak, 1990; Long et al., 1981; Williams et al., 1990), B. germanica обладает некоторыми преимуществами, имеющими существенное значение при генетическом анализе рДНК. Так, у D. melanogaster ядрышковый организатор расположен на обеих половых хромосомах, в то время как у рыжего таракана -на Х-хромосоме. С учетом типа определения пола у В. germanica (самки - XX, самцы - ХО), это позволяет исследовать структуру и описывать изменчивость рибосомной ДНК индивидуальных Х-хромосом при анализе отдельных самцов популяции.
В. germanica является представителем одного из наиболее древних отрядов класса Insecta (Ross, Cochran, 1975; Wootton, 1981), обладает высоким уровнем морфологического и генетического консерватизма. Так, мутационный груз у исследуемого вида составляет 0,02 - 0,04% на особь, для примера, у дрозофил - 0,5 - 1,5% (van de Hey, 1969), а у москитов - 0,5 - 3,0% (Craig, Hickey, 1967). Это позволяет рассматривать структуру рДНК В. germanica в качестве предковой для класса Insecta и ее исследование является важным для понимания процесса эволюции кластера рибосомных генов в пределах данного таксона.
Интерес к генетической структуре популяций В. germanica обусловлен широким распространением вида на всех континентах, его синантропностью, устойчивостью к инсектицидам. Кроме того, В. germanica является источником аллергенов и механическим переносчиком многих серьезных заболеваний человека.
Очевидно, что для проведения сравнительного анализа структуры рДНК В. germanica с насекомыми других отрядов, важно предварительно оценить внутривидовую изменчивость кластера рибосомных генов у этого вида и межвидовую изменчивость в пределах отряда Blattoptera. Отметим отсутствие каких-либо данных на эту тему.
Целью настоящей работы являлось изучение структурной организации и полиморфизма кластера ядерных рибосомных генов В. germanica из естественных и искусственных популяций, а также определение степени родства исследуемого вида с другими представителями отряда Blattoptera на основе анализа их ядерной рДНК.
Перед нами стояли следующие задачи: амплификация и секвенирование протяженного фрагмента ядерной рДНК В. germanica с целью получения первичной информации о структуре кластера рибосомных генов исследуемого вида, а также оценка возможности применения данного фрагмента в составе зонда для исследования полиморфизма структуры рДНК В. germanica; выявление характера наследования различных типов структуры кластера рДНК рыжего таракана в индивидуальном скрещивании; анализ внутри- и межпопуляционной изменчивости кластера рибосомных генов в выборках из лабораторных линий и природных популяций В. germanica; 4) оценка межвидовой изменчивости кластера генов рРНК 6 видов из отряда Blattoptera и определение возможности применения ядерной рДНК в качестве маркера филогенетических связей В. germanica с представителями данного отряда.
Общая характеристика организации кластера генов рибосомных РНК эукариот
Гены рибосомных РНК (рРНК) формируют в геноме эукариот группы тандемно расположенных повторяющихся единиц (Long, Dawid, 1980; Gerbi, 1985). Каждая из них содержит последовательности, кодирующие 18S; 5,8S и 28S рРНК, разделенные некодирующими районами - спейсерами (рис. 1). Одни из них входят в состав единицы транскрипции: наружный транскрибируемый спейсер (external transcribed spacer - ETS) и внутренние транскрибируемые спейсеры (internal transcribed spacers - ITSl, ITS2), другой - отделяет соседние транскрипционные единицы - нетранскрибируемый спейсер (nontranscribed spacer - NTS), иначе называемый межгенным спейсером (intergenic spacer - IGS). ETS локализуется между промотором и 18S геном рРНК (5 -ETS), а также между 28S геном и участком терминации транскрипции (З -ETS), ITS1 - между 18S и 5,8S генами рРНК, ITS2 - между 5,8S и 28S генами.
До недавнего времени считалось, что спейсерные последовательности не несут функциональной нагрузки. Однако, экспериментальные данные последних лет свидетельствуют об обратном. В экспериментах на Drosophila melcmogaster, была выявлена корреляция между структурой нетранскрибируемого спейсера и скоростью развития плодовой мушки (Cluster et al., 1987). Установлено, что в этом районе локализованы сайты инициации транскрипции, энхансеры и терминаторы транскрипции (Sollner-Webb et al., 1995), отвечающие за видоспецифичность транскрипции, что было показано в системе in vitro (Fan et al, 1995). Функциональный анализ ITS дрожжей выявил значимость структуры данных последовательностей для созревания первичного транскрипта (Musters et al., 1990; van der Sande et al., 1992; Thweatt, Lee, 1990).
Продуктом транскрипции кластера генов рРНК, осуществляемой РНК полимеразой I, является предшественник рибосомной РНК (про-рРНК), который подвергается последовательному процессингу (сначала на 5 -конце 5,8S-pPHK, а затем на 5 -конце 18S-pPHK и З -конце 28S-pPHK, соответственно) с образованием зрелых 18S-; 5,8S- и 28S-pPHK.
Число повторяющихся единиц в тандемном кластере генов рРНК на гаплоидный геном не зависит от уровня организации вида и варьирует у эукариот от нескольких десятков до нескольких тысяч (Hollenberg, 1976; Chattopadhyay et al., 1972; Schweizer et al, 1969; Cockbura et al, 1976; Bross, Krone, 1972; Birnstiel et al., 1966). Наблюдаются различия по числу генов рРНК не только у организмов разных таксонов, но и у близких видов, а также между линиями одного вида, как описано у D. melanogaster (Ritossa, Scala, 1969; Spear, Gall, 1973), у амфибий Ambystoma mexicanum (Sinclair et al., 1974). Обнаружены некоторые индивидуальные различия по этому показателю у амфибий Bufo marinus (Miller, Brown, 1969), у рыб Salmo irideus (Schmidtke et al., 1976). Эти данные позволяют предположить, что количество повторяющихся единиц в рДНК может являться полиморфным в любой популяции (Long, Dawid, 1980).
Многокопийность генов рибосомных РНК обычно связывают с потребностями клетки в большом количестве рРНК, которое не могло бы быть транскрибировано с единичной копии гена в соответствующий момент жизненного цикла. Однако, данные по числу рибосомных генов у D. melanogaster (Kiefer, 1968), Xenopus laevis (Miller, Gurdon, 1970) и у целого ряда растений свидетельствует, что их количество превышает минимум, необходимый для обеспечения жизнеспособности этих видов.
Микроэволюция кластера рибосомных генов
Анализ структуры рДНК позволяет не только решать проблемы филогении и систематики, но и выявлять внутри- и межпопуляционную изменчивость, особенно при сравнении быстро эволюционирующих у высших эукариот районов нетранскрибируемого (Arnheim, 1983) и транскрибируемого спейсеров (Schlotterer et al., 1994).
Полиморфизм длин рестриктных фрагментов в районе нетранскрибируемого спейсера позволил дифференцировать популяции мышей (Suzuki et al., 1986, 1994) и Drosophila (Williams et al., 1985). Интересные результаты получены при исследовании комплекса рибосомных генов у Атлантических лососей из Северной Америки и Европы (Cutler et al., 1991). Использование в Саузерн-блот анализе клонированного фрагмента рРНК D. melanogaster в качестве зонда и комбинации ферментов рестрикции Sad и Xbal позволило выявить два дополнительных фрагмента у лососей из Северной Америки, размером 3,6 т.п.о. и 2,6 т.п.о., частота которых соответственно составила 76% и 100%, тогда как ни один лосось из Европы не обладал фрагментами такого размера. Впервые различия между североамериканскими и европейскими лососями были обнаружены на цитологическом уровне (по числу хромосом) (Phillips, Hartley, 1988), затем -на изоферментном (Stahl, 1987).
Анализ рДНК-вариантов овса Avena barbata из 48 районов Калифорнии и Орегона показал, что в экологически однородных районах генетическая изменчивость рДНК меньше, чем в остальных районах, что коррелирует с распределением генотипов по 8 морфологическим и аллозимным локусам (Cluster, Allard, 1995).
У эндемичного для острова Масатерра (архипелаг Хуан Фернандес) растения лакториса фернандесовского Lactoris femandeziana выявлена внутривидовая вариабельность по длине межгенного спейсера, в то время как изменчивость по аллозимам не обнаружена (Brauner et al., 1992).
Высокая степень внутривидовой вариабельности выявлена при рестрикционном картировании рДНК повторов у гевеи бразильской Hevea brasiliensis (Besse et al., 1993), у огурца посевного Cucumis sativus (Kavanagh, Timmis, 1986), у винограда Vitis (Thomas et al., 1993). Значительный межсортовой полиморфизм по длине МТС наблюдается у различных сортов мягкой пшеницы Triticum aestivum, хотя внутри каждого сорта кластеры рДНК были гомогенны (Appels, Dvorak, 1982).
Выявлен полиморфизм межгенного спейсера у 58 сортов мировой коллекции и 14 испанских сортов гексаплоидного оъса. Avena sativa (Polanco, Perez de la Vega, 1997). Показана сортовая специфичность ПДРФ вариантов рДНК у гороха посевного Pisum sativum (Ellis et al., 1984; Сидоренко и др., 1997), позволяющая выделить несколько групп сортов по этому признаку. В то же время, при анализе сортов сои Glycine max внутривидовой полиморфизм не был выявлен (Varsanyi-Breiner et al., 1979; Doyle, Beachy, 1985). Таким образом, полиморфизм по длине рибосомных повторов в сочетании с другими биохимическими маркерами может оказаться весьма перспективным для сортовой паспортизации некоторых видов сельскохозяйственных культур.
Внутрииндивидуальная и популяционная гетерогенность в районе NTS была выявлена и у шотландской сосны Pinus silvestris L. (Karvonen et al., 1993).
При исследовании рДНК различных штаммов возбудителя чумы Yersinia pestis установлена четкая связь между тремя очагами чумы и риботипами (рестрикционными профилями рРНК генов) различных штаммов. Наибольшая гетерогенность рДНК установлена у африканских штаммов, менее выражена у азиатских изолятов, а в американских штаммах полностью отсутствует (Guiyoule et al., 1994).
Условия содержания В. germanica в инсектарии
Насекомых содержали в стеклянных банках, емкостью 0,5-1 л при температуре 25С. На дно банок помещали плотную бумагу в форме круга. Из этой же бумаги изготавливали "гармошки", высотой 8-10 см. Их располагали по периметру банки. В центр помещали пластиковые поилки с небольшим тампоном ваты. Верхнюю внутреннюю часть банок смазывали вазелиновым маслом. В качестве корма использовали "Dog Chow". Замену банок производили не реже одного раза в два месяца, предварительно их мыли и стерилизовали. Особого внимания требовала своевременная замена банок при появлении дрожжевого налета на их стенках и постоянное наличие чистой воды в поилках. Банки закрывали хлопчатобумажной тканью, затем полиэтиленовыми крышками с отверстиями (не менее десяти, диаметром 1 см).
С целью получения девственных самок В. germanica для постановки скрещиваний отбирали личинок четвертой - пятой личиночной стадии и содержали в отдельных банках до последней линьки. В каждом скрещивании использовали насекомых из разных районов г. Москвы. После появления потомства, из родительских особей выделяли ДНК, а подрощенных личинок (третья-четвертая личиночная стадии) рассаживали по одной в отдельные банки для недопущения случайных скрещиваний. По достижении личинками половозрелого состояния, из них выделяли тотальную ДНК. Далее, ДНК родительских особей и потомков первого поколения анализировали как описано в следующем разделе.
Выделение и очистка. Высокомолекулярную ДНК выделяли из целой особи В. germanica, или из 1/4-1/6 части тела представителей других, более крупных видов. Материал гомогенизировали стеклянной палочкой в 600 мкл буфера следующего состава: 0,2 М трис-HCl, рН 8,0; 50 мМ EDTA, рН 8,0; 0,5% додецилсульфат натрия; 200 мкг/мл протеиназы К. Инкубацию проводили в течении 3 часов при температуре 50С, после чего раствор охлаждали до комнатной температуры, добавляли раствор РНКазы до конечной концентрации 50 мкг/мл и выдерживали 15 минут при 37С. После фенол-хлороформной депротеинизации геномную ДНК осаждали двумя объемами этанола, затем осадок промывали 70%-ным этиловым спиртом, высушивали и растворяли в 50-100 мкл бидистиллированной воды.
Рестрикционный анализ. Рестрикционный анализ тотальной ДНК названных выше видов тараканов проводили с использованием следующих ферментов: Hindlll, Psil, EcoRl. Обработку высокомолекулярной ДНК эндонуклеазами рестрикции осуществляли в условиях, оптимальных для каждого фермента (согласно рекомендациям фирм-производителей - НПЦ "Биопол", Москва; "Ферментас", Вильнюс), при 37С в течении 6 часов, используя избыток фермента (20 ед. фермента на 1 мкг ДНК).
Электрофорез. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 0,8%-ном агарозном геле в ТАЕ-буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА) с добавлением бромида этидия (1 мкг/мл) при напряжении электрического поля 30-50 В/см в течение 18-20 часов. В качестве маркеров молекулярного веса использовали РМ-рестрикты ДНК фага лямбда.
Денатурация ДНК и перенос на фильтры. Денатурацию рестрицированной ДНК в геле проводили в течение 1 часа при комнатной температуре в растворе следующего состава: 0,5 М NaOH, 0,6 М NaCl. Этот раствор использовали и для вакуумного переноса фрагментов ДНК на нейлоновые мембранные фильтры "Hybond N" ("Amersham", Англия). Перенос осуществляли в течение 4-6 часов.
Клонирование и анализ первичной последовательности фрагмента рДНК В. germanica
В рамках данного исследования был амплифицирован фрагмент кластера рибосомных генов В. germanica методом полимеразной цепной реакции с использованием ранее описанных универсальных праимеров (Муха, Сидоренко, 1995; 1996; патент №2113481, Захаров и др., 1998), представляющих собой фрагменты последовательностей 25S и 17S рДНК Т. pyriformis, обладающих 100% гомологией с аналогичными районами рДНК организмов различных таксонов, эволюционно удаленных от Простейших (растения, грибы, млекопитающие, человек). Их локализация на внехромосомной рДНК Т. pyriformis показана на рисунке 2. Результат электрофореза продукта ПЦР в 1% агарозном геле изображен на рисунке 3. Полученный фрагмент имеет размер около 2,7 т.п.н. Более точно размер фрагмента, а также его нуклеотидная последовательность (рис. 4) были установлены секвенированием.
Различные структурные элементы в последовательности обозначены на рисунке следующими шрифтами: участок 28S рРНК гена - заглавным полужирным; фрагмент 18S рРНК гена - заглавным полужирным курсивом; 5,8 S рРНК ген - строчным полужирным; ITS1 и ITS2 участки - указаны прописными буквами; последовательности, соответствующие праймерам, использованным для амплификации фрагмента рДНК В. germanica, подчеркнуты одной чертой; последовательности, соответствующие сайту рестрикции HindUI фермента, выделены двойной чертой. амплифицированной и секвенированной последовательности рДНК В. germanica была осуществлена как описано в разделе 2.6 (глава "Материалы и методы") с использованием программ FASTA и BLAST (Wilbur, Lipman, 1983; Pearson, 1990; Altschul, 1990, 1994). Анализ проводили путем детального сравнения отдельных участков этого фрагмента с нуклеотидными последовательностями 18S, 28S, 5,8S генов рРНК организмов близких в систематическом отношении. Для этих целей были использованы базы данных EMBL и GeneBank. Показано, что в состав данного фрагмента рДНК рыжего таракана входят: З -конец гена 18S рРНК (188 п.н.), ITS1 (661 п.н.), ген 5,8S рРНК (142 п.н.), ITS2 (464 п.н.), начало гена 28S рРНК (1282 п.н.). Полная длина амплифицированного фрагмента составляет 2737 п.н.
Кроме того, были выявлены организмы, нуклеотидные последовательности которых, представленные в базах данных EMBL и GeneBank, проявляют значительное сходство с 18S- и 288-подобными фрагментами генов рРНК В. germanica. В таблицах 5 и 6 приведен перечень видов в порядке убывания сходства их последовательностей с анализируемыми последовательностями участков 18S- и 288-подобных рРНК генов В. germanica, соответственно. Хорошо видно, что фрагменты рРНК генов рыжего таракана обладают высоким сходством с аналогичными генами насекомых (табл. 4, 5). . Для фрагмента 288-подобного гена рыжего таракана такой последовательностью является 28S рРНК ген насекомого Vespa crabro.
Амплифицированный фрагмент рДНК В. germanica, встроенный по EcoRY сайтам рестрикции в плазмиду pUC19, использовали в качестве зонда №1.
Одной из задач данного исследования являлась характеристика структуры кластера генов рибосомных РНК рыжего таракана.
На рисунке 5 а и 56 приведены результаты блот-гибридизации тотальной ДНК индивидуальных особей рыжего таракана, обработанной эндонуклеазой HindHl, с меченными зондами №1 (содержит фрагмент рДНК исследуемого вида) и №2 (содержит последовательность 17S рРНК гена Т. pyriformis). Зонд №1 выявил у всех особей два фрагмента, размером приблизительно 1 и 2 т.п.о., и полиморфную зону, фрагменты которой находятся в интервале от 5 до 6,5 т.п.о. Паттерны особей различаются числом фрагментов в этой зоне (от 1 до 3) и интенсивностью гибридизации
