Введение к работе
Актуальность проблемы. Мейоз является центральным событием жизненного цикла эукариотических организмов, размножающихся половым путем, которое инициирует переход от диплоидной к гаплоидной фазе развития, то есть создает необходимые предпосылки для образования гамет. Правильность мейоза обеспечивает фертильность и возможность успешного полового воспроизведения. Для редукционного деления в мейозе необходима тесная ассоциация гомологичных хромосом в профазе I мейоза. Взаимодействия гомологов, такие как попарное их выравнивание, спаривание, синапсис, то есть образование трехполосой белковой структуры синаптонемного комплекса (СК) между гомологичными хромосомами, и рекомбинация являются необходимыми для сегрегации гомологов и сопровождаются серией координированных параллельных событий реорганизации хромосом. Понимание регуляции генетического контроля мейотического деления продвинулось вперед за последнее десятилетие благодаря использованию молекулярной генетики применительно к генетическим моделям (на основе мейотических мутантов) в сочетании с их цитологическим изучением. Наибольшие усилия были сосредоточены на нескольких модельных объектах: Saccharomyces cerevisiae, Sordaria macrospora, Coprinus cinereus, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Mus musculus, Arabidopsis thaliana, Zea mays. Одним из стимулов этих параллельных исследований было установление сходства и различий в регуляции мейоза у различных эукариотических организмов (Loidl, 1990). Недавние молекулярно-генетические исследования выявили у разных видов много типов вариаций в мейотическом процессе, который ранее считался высоко консервативным (Zickler, Kleckner, 1998; 1999; Shaw, Moore, 1998; Walker, Hawley, 2000; Burgess, 2002; Page, Hawley, 2004; Higgins et al, 2004; Gerton, Hawley, 2005). Детали и особенности взаимодействия хромосом удалось охарактеризовать в результате анализа ряда мутаций по генам, контролирующим процессы рекомбинации и синапсиса (Nonomura et al., 2006; Sanchez-Moran et al. 2007; Yu et al., 2010). У разных организмов выявлены мутации, вызывающие негомологичный синапсис наряду с гомологичным (Nairz, Klein, 1997; Gerecke, Zolan, 2000; Tsubouchi, Roeder, 2002), часть из которых затрагивает гены, кодирующие белки СК (Higgins et al., 2005).
Анализ генетического контроля хода мейоза у организмов, находящихся на разных уровнях эволюционного развития, позволил вычленить ключевые этапы мейоза. Однако до настоящего времени нет ни одного объекта, у которого удалось бы детально изучить реализацию всех этапов. Результатом исследований сходных по проявлению наследственных нарушений мейоза у разных видов растений, животных и грибов явилось создание концепции универсальности генетического контроля мейоза. С другой стороны, результаты исследований последних пятнадцати лет показали, что этапы мейоза находятся под независимым генетическим контролем, и полный их спектр не является абсолютно необходимым для успешного осуществления этого процесса у каждого конкретного вида. Кроме того, может быть различна последовательность событий мейоза.
Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов регуляции мейоза у ржи проводится с использованием оригинальной «Петергофской» коллекции спонтанных мейотических мутантов лаборатории генетики растений СПбГУ. На основе этой коллекции создана модель для изучения предмейотической доменной организации ядра, гомологичного спаривания и компактизации мейотических хромосом, а также проявления генов, контролирующих молекулярные процессы, связанные с осуществлением рекомбинации и синапсиса. Проведение генетического анализа позволяет выяснить закономерности наследования, межгенных и межаллельных взаимодействий мейотических генов и их хромосомную локализацию, с дальним прицелом на последующее выделение и клонирование генов, контролирующих мейоз. Порядок включения генов синапсиса в процесс мейоза устанавливают на основании фенотипа двойных мутантов, а также реализации ключевых этапов мейоза у ржи. Другая часть исследований направлена на изучение проявления мутантных генов на различных стадиях мейотического цикла для выявления самого раннего дефекта, вызываемого мутантными аллелями, с использованием методов молекулярной цитогенетики.
Цель работы - сформировать представления о генетическом контроле ключевых событий мейоза, последовательности их осуществления, а также об иерархии связей между ними у ржи Secale cereale L. на основании изучения генетической коллекции мейотических мутантов; выявить признаки универсальности и специфичности этих событий, а также связь событий мейоза с особенностями организации генома у эволюционно различных видов растений.
Задачи:
-
Изучить зависимость между предсинаптическими событиями, а именно передислокациями центромерных (прицентромерных) и теломерных (субтеломерных) доменов хромосом в предмейотической интерфазе и в профазе I мейоза, и синапсисом у ржи.
-
Получить данные об осуществлении рекомбинационных событий у ржи и у ее синаптических мутантов путем иммуноцитохического выявления белков рекомбинации RAD51 и DMC1, секвенирования контролирующих их генов и изучения расположения мейотических (рекомбинационных) узелков на СК.
-
Изучить зависимость между взаимодействием хромосом, хиазмообразованием и интерференцией в мейозе при снятии контроля над гомологичностью синапсиса у ржи, вызванного десинаптической мутацией sy10.
-
Выяснить связан ли индискриминантный синапсис хромосом ржи с их предсинаптическим расположением в предмейотической интерфазе и ранней профазе I, использовав в качестве модели мутанты ph1b ржано-пшеничных дополненных линий.
-
Для выяснения особенностей взаимодействия генов синапсиса изучить иммуноцитохимическую локализацию белков СК в мейоцитах ржи дикого типа, у одиночных и двойных мутантов.
Научная новизна. Данная работа является первым комплексным молекулярно-цитогенетическим исследованием ключевых событий мейоза у ржи Secale cereale L., организма, который характеризуется низкой плотностью генетических карт и низким процентом кодирующих последовательностей относительно размера генома. Впервые проведено изучение расположения прицентромерных и субтеломерных доменов хромосом у синаптических мутантов ржи методом флуоресцентной гибридизации ДНК-ДНК in situ и установлено, на примере асинаптического мутанта sy9, что кластеризация этих доменов не является предпосылкой правильного синапсиса у ржи. Впервые показано, что отсутствие синапсиса у одного и того же асинаптического мутанта sy1 может быть связано как с нарушением кластеризации прицентромерных и субтеломерных доменов хромосом, так и с отсутствием рекомбиногенных белков Rad51/Dmc1 в профазе I мейоза, которое на данном этапе установлено иммуноцитохимически. Показана ассоциация доменов гомологичных хромосом ржи в предмейотической интерфазе у дополненной ржано-пшеничной линии, показано нарушение такой ассоциации под влиянием мутации локуса Phl. Впервые для нормальных и мутантных растений ржи клонированы и секвенированы последовательности, гомологичные генам RAD51 и DMC1, проведена иммуноцитохимическая локализация мейотических белков Rad51 и Dmcl, Asyl и Zypl, ортологичных соответствующим белкам S. cerevisiae, A. thaliana, Lycopersicon esculentum, сопоставлены нарушения в поведении хромосом у мутантов и наличие у них дефектных белков. Полученные данные позволяют сделать важные биологические обобщения относительно универсальности механизмов мейоза и вычленить специфические элементы реализации генетического контроля этого процесса у ржи Secale cereale L.
Теоретическое и практическое значение работы.
Совокупность данных, представленных в наших работах и в работах других авторов, позволяет утверждать, что результаты, полученные на разных мутационных системах при изучении мейоза оказались в некотором противоречии с принципом универсальности, характеризующим процесс данного деления ядер и клеток. Таким образом, исключительно возросла актуальность всестороннего изучения всех ключевых этапов мейоза на каждом изучаемом объекте.
Геном ржи велик, в 64 раза больше генома арабидопсиса, и избыточен, только 1% его составляют кодирующие последовательности. Поскольку, осуществить секвенирование генома ржи, в ближайшем будущем не удастся, то единственно возможной стратегией на ржи является составление фенотипических портретов спонтанных мутантов, и детальное сравнение их с фенотипами мутантов по известным генам, например дрожжей и арабидопсиса. Основой такого подхода являются Закон гомологических рядов в наследственной изменчивости Н.И. Вавилова и методы обратной геномики и протеомики. Последнее, в наших исследованиях, осуществлено при использовании иммуноцитохимического подхода и уникальной генетической коллекции мейотических мутантов ржи Secale cereale L. в качестве мутационной модели.
Приведенные ниже результаты призваны продемонстрировать успехи развития и перспективы дальнейшего использования коллекции мей-мутантов ржи, для выяснения механизмов меиоза у этого ценного, в хозяйственном отношении злака. Рожь Secale cereale L. особо важна как культурное растение в условиях Северо-Запада. Кроме того, рожь является родственником пшеницы - одного из самых древних культивируемых растений, значение которого для Европейской цивилизации трудно переоценить. По уровню финансирования научных исследований пшеница стоит на третьем месте после риса и ячменя. Селекционеры постоянно работают над созданием новых сортов пшениц, используя в том числе и рожь в качестве донора генов, контролирующих устойчивость к разнообразным неблагоприятным факторам окружающей среды. На этом пути стоит рекомбинационный барьер, преодолеть который возможно индукцией гомеологичной рекомбинации, в частности путем введения генов, кодирующих рекомбиногенные белки. Осознание молекулярных механизмов рекомбинации, в том числе и между чужеродными хромосомами, откроет возможности для направленного переноса генов, увеличения генетической изменчивости за счет рекомбинации между неродственными геномами и повышения эффективности селекции хлебных злаков.
Основные положения выносимые на защиту: Сравнительно-генетический подход и использование цитогенетической модели - оригинальной «Петергофской» коллекции мейотических мутантов ржи S. cereale L. в молекулярно-биологических экспериментах позволило выявить элементы консервативности и специфичности в реализации генетического контроля следующих ключевых этапов мейоза у ржи: кластеризации теломерных и центромерных доменов хромосом, рекомбинации, сборки СК.
-
Консервативность рекомбиногенных белков Rad51 и Dmcl, гомологичных двум доменам одного белка RecA кишечной палочки Esherichia coli, позволила нам амплифицировать и клонировать фрагменты ортологичных генов ржи, а консервативность устройства эпитопов этих белков - применить методы иммуноцитохимии и локализовать их с использованием антител к ортологичным белкам томатов на хроматине в мейозе у ржи дикого типа и у двух ее синаптических мутантов: асинаптика sy9 и десинаптика sy10.
-
Успешность иммуноцитохимической локализации белков синапсиса Asy1 и Zyp1 у ржи с использованием антител к ортологичным белкам арабидопсиса свидетельствует в пользу консервативности третичной структуры этих белков в районах эпитопов у отдельных представителей покрытосеменных растений, относящихся к разным классам, а именно к классам однодольных и двудольных.
-
Предложена гипотеза об иерархии связей между отдельными ключевыми событиями мейоза у ржи: кластеризация теломерных и центромерных доменов хромосом, а также правильная конденсация хромосом в ядрах микроспороцитов ржи на стадиях предмейотической интерфазы-профазы I, обеспечивают успешное осуществление ранних событий рекомбинации. События, связанные с инициацией и успешностью сборки линейных треков белка Asy1, являются определяющими для завершения рекомбинации, но не для ее инициации. Сборка трехполосой структуры СК также необходима для завершения рекомбинации и обеспечивается белком отличным от Zyp1.
Экспериментальным обоснованием предложенной концепции являются следующие результаты.
У ржи, как и у пшеницы, кластеризация теломерных доменов хромосом приурочена к переходу от предмейотической интерфазы к мейозу и происходит раньше, по сравнению с другими видами (например кукурузой), у которых она ассоциируется с началом синапсиса. Более того, формирование «раннего кластера» указанных доменов у ржи не является обязательной предпосылкой регулярного синапсиса, поскольку оно не нарушено ни у асинаптического мутанта sy9, ни у десинаптического мутанта sy10.
Продукт гена SY9 участвует в сборке линейных трактов белка Asyl. Мутация sy9 нарушает этот процесс, но не сопровождается нарушениями ни в формировании «раннего кластера», ни в образовании промежуточных продуктов рекомбинации, связанных с участием рекомбиногенных белков Rad51/Dmc1. С другой стороны, дефект «раннего кластера» и сопряженный с этим блок рекомбинации на этапе взаимодействия ДНК с белками Rad51 и Dmc 1 не сопряжены с нарушением сборки линейных трактов белка Asy 1. Об этом свидетельствует сборка протяженных осей, образованных белком Asy1, а также отсутствие иммуноцитохимического сигнала, соответствующего белкам Rad51 и Dmc1, у асинаптического мутанта sy1. Выявленный нами эпистаз гена SY9, над геном SY1, свидетельствует в пользу того, что ген SY9 действует в мейозе раньше, чем SY1, что, в свою очередь, явно указывает на независимость ранних событий рекомбинации на уровне ДНК от начальных этапов синапсиса.
Сборка белков Asy1 и Zyp1 на осях мейотических хромосом начинается у ржи до формирования «ранних кластеров», то есть в предмейотической интерфазе, с образования обособленных друг от друга точечных дисперсных центров, которые преобразуются в ранней профазе I в обособленные друг от друга линейные тракты. Характер сборки белков Asy 1 и Zyp 1 на осях мейотических хромосом отличает рожь от арабидопсиса, риса и кукурузы.
Белки Asy1 и Zyp1 в изобилии присутствуют на мейотических хромосомах у мутанта sy10, образуя двухполосые линейные треки. При этом сборка СК осуществляется индискриминантным образом, то есть имеются переключения с гомологичного партнера спаривания хромосом на негомологичный, а в рекомбинацию вовлечены как гомологичные хромосомы, так и негомологичные. Ген SY10, по-видимому, кодирует белок, необходимый для соединения двухполосых треков Asy 1 Zyp 1 в трехполосую структуру СК. Роль этого белка может заключаться в завершении рекомбинации по гомологичному и/или негомологичному сценарию.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конгрессах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и школах: V-м съезде Всесоюзного Общества генетиков и селекционеров им.Н.И.Вавилова (Москва, 1987); III Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, 1990); XI Международном симпозиуме по эмбриологии и семенной репродукции (Санкт Петербург , 1992); XII Конгрессе EUCARPIA (Анже, Франция, 1992); 11-ом совещании "Изогенные линии и генетические коллекции" (Новосибирск, 1993); XVII Международном генетическом конгрессе (Бирмингем, Великобритания, 1993); IV Хромосомной конференции в Кью (Ричмонд, Великобритания, 1994); I, II, III, V съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994; Санкт- Петербург, 2000; Москва, 2004; 2009); 12-й Международной хромосомной конференции, (Мадрид, Испания, 1995); 3-й, 6-й, 7-й Европейских конференциях по мейозу (Вагенинген, Нидерланды, 1997; Обертраун, Австрия, 2003; Сан Лоренцо де Эль Эскориал, Мадрид, Испания, 2005); Ежегодных совещаниях Общества экспериментальной биологии (SEB UK) Великобритании (Секция: Мейоз и рекомбинация, Йорк, Великобритания, 1998; Секция: Мейоз, Кентербери, Великобритания, 2001); 2-й Европейской конференции по цитогенетике (Вена, Австрия, 1999); Всероссийском симпозиуме "Клеточная биология на пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 2000); 14-й Международной хромосомной конференции (Вюрцбург, Германия, 2001); Всероссийском совещании "Актуальные проблемы генетики" (Москва, 2003); Международном симпозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, 2003); V Международном совещании и Школе молодых ученых по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений (Санкт-Петербург, 2005), Совместном совещании Биохимического и Генетического Обществ Великобритании «Мейоз и последствия рекомбинации» (Уорик, Великобритания, 2006); 2-м Конгрессе Междунароного общества по цитогенетике и изучению геномов (Кентербери, Великобритания, 2006); EUCARPIA - Международном симпозиуме по селекции и генетике ржи (Гросс- Люзевиц, Германия, 2006); II Вавиловской Международной конференции (Санкт- Петербург, 2007); Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 73 печатные работы, из них 27 в сборниках и ведущих международных и отечественных научных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 288 страницах, включая 42 рисунка, 17 таблиц, список литературы, содержащий 410 ссылок. Диссертация состоит из введения, семи глав, в шесть из которых включены материалы и методы, заключения и выводов.
