Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Генетическая природа автофертильности у ржи 11
1.2. Морфологические маркеры 14
1.3. Биохимические (изозимные и белковые) маркеры 15
1.4. Молекулярные маркеры 32
1.5. Анализ сцепления морфологических маркеров 37
1.6. Генетическое картирование на основе биохимических маркеров 39
1.7. Молекулярные генетические карты хромосом ржи 43
1.8. Картирование генов со сложноучитываемым качественным и количественным проявлением 49
ГЛАВА 2. Материалы и методы 58
2.1. Растительный материал 58
2.2. Эксперименты по картированию локусов количественных признаков
2.3. Анализ биохимических маркеров 63
2.4. Анализ молекулярных маркеров 71
2.5. Статический анализ моно - и дигибридных расщеплений 72
2.6. Способ идентификации и картирования мутаций автофертильности с помощью маркеров 74
2.7. Описание компьютерных программ, использованных для построения
генетических карт 77
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 82
3.1. Генетический анализ автофертильности у ржи 82
3.1.1. Сегрегационный анализ автофертильности з
3.1.2. Установление хромосомной локализации и идентификация мутаций автофертильности 86
3.1.3. Маркерный анализ с привлечением дополнительных источников автофертильности 93
3.1.4. Картирование мутаций автофертильности с помощью молекулярных маркеров 105
3.2. Построение генетических карт хромосом ржи 111
3.2.1. Анализ сцепления изозимных локусов 111
3.2.2. Картирование генов, контролирующих морфологические признаки 118
3.2.3. Картирование мейотических генов 127
3.2.4. Построение обобщающих генетических карт на основе RFLP - маркеров 131
3.3. Картирование локусов количественных признаков 147
3.3.1. Результаты предварительных экспериментов 147
3.3.2. Характеристика гибридов по количественным признакам 149
3.3.3. Построение скелетных генетических карт 154
3.3.4. QTL-анализ у межлинейных гибридов ржи 161
3.4. Использование генетических маркеров для решения некоторых задач генетики и селекции ржи 179
3.4.1. Обнаружение и картирование генов ржи, специфически проявляющихся у пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале 180
3.4.2. Повышение эффективности генетического изучения мейоза у ржи с помощью маркеров 189
3.4.3. Внедрение индивидуального отбора в селекцию сортов-популяций у ржи на основе генетического маркирования мутаций автофертильности 194
3.5 Перспективы генетических исследований у ржи 211
Заключение 221
Выводы 223
Список литературы
- Биохимические (изозимные и белковые) маркеры
- Анализ молекулярных маркеров
- Маркерный анализ с привлечением дополнительных источников автофертильности
- Использование генетических маркеров для решения некоторых задач генетики и селекции ржи
Введение к работе
Актуальность исследований. Генетика ржи отстает в своем развитии от генетики родственных видов – пшеницы и ячменя. Причинами этого являются меньшая экономическая важность ржи, как сельскохозяйственной культуры и сложности в экспериментальной работе с рожью, связанные с присущей ей строгой системой гаметофитной несовместимости. На протяжении многих лет интерес исследователей в первую очередь был связан с ролью ржи в улучшении пшеницы и создании тритикале. Рожь является в этих случаях источником генов устойчивости к неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям. Интерес ко ржи, как к самостоятельной сельскохозяйственной культуре, в странах основных производителях зерна ржи – России, Германии и Польше в последнее время заметно усилился (Гончаренко, 2006; Boros, 2007; Rode, 2007). Это связано как с уже упомянутыми биологическими особенностями, так и c расширением сферы использования зерна и зеленой массы озимой ржи (Рожь, 1989; Miedaner, 1997). В связи с этой задачей становится актуальной селекция сортов ржи целевого назначения. В Германии эта задача успешно решается с помощью сортов-гибридов, создание которых по традиционной схеме с использованием ЦМС стало возможным благодаря внедрению автофертильных форм ржи. В России внедрение сортов-гибридов экономически оправдано только в регионах с почвенно-климатическими условиями, обеспечивающими максимальную реализацию потенциала гибридов. Для районов с неблагоприятными условиями среды целесообразно создание спектра сортов-популяций, разного целевого назначения на основе современных районированных, высокоадаптивных сортов ржи и совершенствования методов их селекции. Внедрение автофертильности для улучшения и дифференциации существующих сортов ржи является в связи с этим актуальной задачей. Эта и целый ряд других научных и практических задач может эффективно решаться в настоящее время с помощью генетических маркеров, позволяющих манипулировать участками хромосом, включающими гены, представляющие интерес для исследователя или селекционера. Использование маркеров основано на генетическом картировании и подборе тех из них, которые тесно (абсолютно) сцеплены с интересующим нас геном. Таким образом, генетическое картирование у ржи является актуальной проблемой, на решение которой и были направлены наши исследования.
Цель и задачи исследований. Цель исследований – картирование генов, маркеров и локусов количественных признаков в геноме ржи и разработка на этой основе новых подходов к решению научных и практических задач, возникающих при работе с этой культурой.
Задачи исследований:
провести гибридологический анализ автофертильности;
идентифицировать мутации автофертильности у инбредных линий ржи Петергофской генетической коллекции;
картировать мутации автофертильности относительно морфологических, биохимических и молекулярных маркеров;
изучить сцепление между изозимными маркерами хромосом ржи;
с помощью изозимных локусов установить хромосомную локализацию ряда морфологических маркеров и мейотических генов, а затем картировать их относительно молекулярных маркеров;
обобщить полученные данные по сцеплению с помощью построения скелетных генетических карт хромосом ржи;
картировать локусы, отвечающие за морфологические хозяйственно-значимые количественные признаки;
разработать подход к выявлению и картированию генов ржи, специфически проявляющихся у пшенично-ржаных гибридов и тритикале;
развить генетическое изучение мейоза у ржи на основе точной идентификации генотипов по мейотическим мутациям с помощью маркеров;
обосновать для ржи схему селекции сортов-популяций на основе генетического маркирования мутаций автофертильности.
Научная новизна исследований:
установлен ген ржи (Т), мутации в котором ведут к автофертильности наряду с мутациями в основных локусах несовместимости S и Z;
впервые проведено молекулярное картирование локусов S, Z и Т;
идентифицированы мутации автофертильности у 19 инбредных линий ржи, представляющих 10 источников автофертильности Петергофской генетической коллекции;
с помощью изозимных и молекулярных маркеров впервые картированы пять морфологических маркеров и три синаптических гена;
в молекулярные карты генома ржи непосредственно включены 19 биохимических маркеров;
впервые установлен и локализован в хромосоме 6R мутантный ген ржи, отвечающий за эмбриональную летальность пшенично-ржаных гибридов;
впервые у ржи проведен маркерный анализ количественных признаков и картированы локусы, контролирующие урожай и его компоненты;
показано, что локусы количественных признаков (ЛКП), выявленные у ржи, характеризуются с одной стороны множественными эффектами, а с другой зависимостью их проявления от условий среды и генотипического фона.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы имеют значение для частной генетики ржи, сравнительной генетики злаков, селекции ржи и тритикале.
В итоге исследований у ржи идентифицированы новые гены, существенно пополнены генетические карты хромосом, впервые получено представление о числе, эффектах действия и положении в геноме локусов ржи, контролирующих количественные признаки.
Предложен и реализован подход по обнаружению и картированию генов, специфически проявляющихся у пшенично-ржаных гибридов и тритикале. Предполагается, что подобные гены, с одной стороны, могут отвечать за
несовместимость геномов при отдаленной гибридизации, а с другой – обеспечивать стабилизацию структуры и функций генома в ходе эволюции на основе отдаленной гибридизации.
Теоретически обоснована схема селекции сортов-популяций ржи, включающая в себя скрещивание источника автофертильности с растениями улучшаемого сорта, самоопыление полученных гибридов, отбор и переопыление лучших инбредных потомств с последующим устранением мутации автофертильности с помощью тесно сцепленного изозимного маркера и восстановлением вследствие этого перекрёстного опыления и популяционного гетерозиса. Возможность практической реализации схемы подкреплена разработкой соответствующего оборудования (патент РФ №2173453) и получением генетически охарактеризованного материала.
Результаты работы используются в практикумах и лекционных курсах, а также при выполнении исследовательских работ студентами и аспирантами кафедры генетики и селекции СПбГУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
автофертильность у ржи является следствием мутаций, по крайней мере, в одном из трех локусов (S, Z и Т), контролирующих реакцию несовместимости;
генетическое картирование мутантных генов у ржи можно эффективно проводить с использованием изозимных локусов в качестве якорных маркеров;
скрытые мутации генов ржи, ведущие к несовместимости геномов у пшенично-ржаных гибридов, можно выявлять и картировать с помощью предложенного варианта гибридологического анализа;
уровень спонтанной мутационной изменчивости у ржи обеспечивает возможность картирования множества локусов количественных признаков у гибридов между двумя неродственными линиями;
способ селекции сортов-популяций у ржи, основанный на генетическом маркировании мутаций автофертильности, может быть использован для
улучшения существующих сортов ржи и их дифференциации на сорта разного целевого назначения.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях и симпозиумах: IV съезде ВОГиС (Кишинев, 1982), I Всесоюзном совещании по проблемам эволюции (Москва, 1984), V съезде ВОГиС (Москва, 1987), VI Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1987), симпозиуме EUCARPIA по селекции ржи (Ленинград, 1988), XIII Конгрессе EUCARPIA (Франция, 1992), I съезде Вавиловского ОГиС (Москва, 1994), IX международной конференции EWAC (Германия, 1995), IV рабочем совещании по кооперации Германия-Россия в области биотехнологии (Санкт-Петербург, 1996), международной конференции «Агробиотехнологии растений и животных» (Киев, 1997), IV международном симпозиуме по тритикале (Канада, 1998), II съезде Вавиловского ОГиС (Санкт-Петербург, 2000), V международном симпозиуме по тритикале (Польша, 2002), международной
конференции по отдаленной гибридизации (Москва, 2003), XII международной конференции EWAC (Англия, 2002), международном симпозиуме EUCARPIA по селекции и генетике ржи (Германия, 2006), научно-практической конференции «Озимая рожь: селекция, семеноводство, технологии и переработка» (Саратов, 2006), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 54 печатные работы в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, глав материалы и методы, результаты и обсуждение, заключения, выводов, списка цитированной литературы, насчитывающего 391 наименование, и приложения в виде двух таблиц. Работа изложена на 269 страницах, включает 34 таблицы и 18 рисунков.
Биохимические (изозимные и белковые) маркеры
Локусы, контролирующие изозимы а- и Р-амилаз, нельзя отнести к числу удобных генетических маркеров, так как продукты генов, входящих в эти локусы, обнаруживаются преимущественно в эндосперме. Р-амилазы накапливаются в сухом эндосперме в ходе его созревания, в эндосперме созревающих и прорастающих зерновок наиболее активны а-амилазы. Работы по картированию амилазных локусов ржи, выполненные в последнее время, сочетают использование ИЭФ для обнаружения всего множества а- и Р-изоамилаз и зондов ДНК, полученных на основе последовательностей, кодирующих отдельные а- и Р-амилазы пшеницы ( Ainsworth et al., 1987; Masojc, Gale 1991) и Р-амилазы ячменя (Sharp et al., 1988; Rorat et al., 1991). Наиболее активные, "щелочные" по изоэлектрическои точке а-амилазы ржи (а-AMY-l) обнаруживаются при прорастании зерна (амилазы солода). Они контролируются тремя структурными генами, расположенными в пределах 3 сМ на плече 6RL. Менее активные "кислые" a-амилазы (a-AMY-2, зеленые a-амилазы) синтезируются в перикарпе в ходе развития семян и при их прорастании. Они контролируются двумя (или тремя) структурными генами, сцепленными в локусе а-Ату2 на плече 7RL. Данные по рекомбинации между тремя генами, входящими в локус а-АтуЗ (5RL) не получены. Авторы отмечают, что в изученном ими материале полиморфизм на уровне ДНК отражает полиморфизм на уровне изозимов а-амилаз, контролируемых генами локуса a-Amyl, а именно, каждому фрагменту рестрикции соответствует определенный аллозим. В случае локуса а-Ату2 это совпадение отсутствует -полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов ДНК сочетается с отсутствием различий в ИЭФ спектре (a-AMY-2) родительских линий. Благодаря высокому уровню полиморфизма амилаз ржи их легко обнаружить у пшенично-ржаных гибридов. Так, хромосомная локализация локусов a-Amyl и а-Ату2 была осуществлена с помощью H-KII, CS-KII и CS-I дополненных линий (Ainsworth et аі., 1987). Большое число полос Р-амилазной активности, выявляемое при ИЭФ экстрактов сухого эндосперма, является следствием посттрансляционной модификации одного (или двух) полипептидов, кодируемых локусом J3-Amyl (5RL). Второй Р-амилазный локус (Jl-Amy2) активен в тканях вегетативных органов, он локализован в хромосомах второй гомеологичной группы, включая 2R (Sharp et al., 1988).
Эстераза (ESI)
Для анализа изоэстераз наиболее адекватным является метод ИЭФ в ПАТ. Наиболее полным, включающим анализ дополненных и замещенных пшенично-ржаных линий и сегрегационный анализ, является исследование изоэстераз листьев, выполненное немецкими исследователями (Schmidt-Stohn, Wehling, 1983; Wehling et al., 1985). Ими описано десять локусов (Estl-EstlO). Локусы Est 3/5/6/7 не рекомбинируют между собой. В локусах 3 и 7 найдено по одной, а в локусах 5 и 6 по три активных аллели, и в каждой из них - нуль-аллели. В локусах Estl и Est2 помимо нуль-аллелей обнаружены, соответственно, четыре и две активные аллели, контролирующие аллозимы с разной ИЭТ. Все вышеперечисленные локусы сцеплены между собой и расположены в 5RL плече. В локусе Est4 (2R) известны активная и нуль-аллели. Локусы Est8 и Est9 тесно сцеплены (Est8/9) в хромосоме 6R (Wricke 1991). В последней работе приведена генетическая карта хромосомы 6R, на которой указан локус Estll, ранее не описанный этой группой исследователей. Возможно, это связано с обнаружением в новом генетическом материале изозимов, рекомбинирующих между собой в пределах комплекса полос, описанных ранее как продукты полностью сцепленных генов, составляющих сложный локус Est9 (Wehling, 1985). Локус Est 10 также контролирует несколько полос, составляющих пять аллельных вариантов. Эстеразы, кодируемые локусами Estl — EstlO являются мономерными белками. В ряде работ сообщается о димерной эстеразе ржи (Barber et al.,1968,1969; Jaaska, 1983; Salinas, Benito, 1985b) . С помощью электрофореза в ПАГ и крахмальном геле в листьях и корнях проростков, эндосперме и зародыше семян обнаруживается эстераза EST А, занимающая наиболее анодное положение и предпочтительно расщепляющая Р-нафтилацетат. В популяциях ржи S. montanum и S. cereale существует полиморфизм по EST А, объясняемый автором существованием четырех аллелей гена Est А, кодирующего субъединицы димерного фермента (Jaaska, 1983). У октоплоидных тритикале продукты гена Est А образуют димеры и с субъединицами, кодируемыми хромосомами третьей гомеологичной группы пшеницы (3AS, 3BS, 3DS) (Barber et al., 1969). У ржи этот ген также локализован в хромосоме, принадлежащей к третьей гомеологичной группе - 3R (Barber et al., 1969; Salinas, Benito,1985).
В. Яаска (Jaaska, 1983) с помощью электрофореза в ПАГ обнаружил у мягкой пшеницы и ржи колеоптиль-специфичные изозимы эстеразы. Триплет этих эстераз у пшеницы кодируется гомеологичной серией локусов Est2 в 3AL, 3BL и 3DL плечах. Гомеологичный локус ржи, по-видимому, локализован в хромосоме 3R.
Из-за очевидного снижения интереса к изозимам, как генетическим маркерам, многие вопросы по обозначению генов и их соответствию друг другу остаются невыясненными. В частности, в хромосоме 3R с помощью горизонтального электрофореза в ПАГ бьш локализован ген, обозначенный авторами как Est-2 (Figueiras et al., 1985). Поскольку этот ген контролирует не самые подвижные эстеразы и его продукты присутствуют в зеленых тканях, можно предположить, что он соответствует гену, контролирующему колеоптиль-специфичные эстеразы ржи, установленному В. Яаска. Основываясь на аналогичных соображениях и множестве изоэстераз, контролируемых одним локусом, можно считать, что локус хромосомы 6R, названный авторами Est-R6 (Jouve, Diaz, 1990) соответствует локусу Est8/9 из вышеприведенных работ немецких авторов. В этой же хромосоме обнаружен локус Est-R5, принадлежащий, по всей видимости, гомеологичной серии локусов Est5, локализованной у пшеницы в 3AL, 3BL и 3DL плечах и контролирующих множественные эстеразы эндосперма (Ainsworth et al., 1986). Сцепление между Est-R5 и Est-R6 не исследовалось. В соответствии с номенклатурой генов пшеницы предложено именовать серию локусов Est-6 (Est8/9), экспрессирующихся в листьях, как Est-8 (Liu, Gale, 1994). При использовании для разделения изоэстераз щелочного диапазона рН (6-10) методом изофокусирования обнаружена дополнительная серия локусов, представленная у пшеницы гомеаллельной серией в коротких плечах хромосом 2А, 2В, 2D (Petchey et al., 1990). Эта серия локусов обозначена авторами также Est-б. Однако вновь обнаруженные локусы контролируют эндосперм-специфичные эстеразы, которые являются димерами. У ржи обнаружен локус с аналогичным проявлением. Этот локус картирован в плече 2RS (Bednarek et al., 2003). Исходя из локализации в хромосоме 2R локусов Est4 (Wricke, 1991) и Est-R7 (Liu, Gale, 1990), которые оба контролируют отдельные щелочные эстеразы листьев, можно высказать предположение об аллелизме этих локусов.
Анализ молекулярных маркеров
. Еще три линии (470, 437 и 454) происходят от автофертильного растения, обнаруженного в популяции Белозерная без воскового налета. Линия 470 получена непосредственно от этого растения и прошла 15 поколений инбридинга. В родословной линий 437 и 454 после трех поколений инбридинга присутствуют скрещивания с самонесовместимыми формами: линия 437 получена после скрещивания с белозерным черноколосым образцом с последующим инбридингом в течение 10 поколений, линия 454 получена после скрещивания с карликовой формой без лигулы и строгого инбридинга в течение восьми поколений. Три линии (498, 527 и 7) берут свое начало от одного и того же автофертильного растения из сорта Вятка и насчитывают восемь поколений строгого самоопыления, причем родословные линий 498 с одной стороны и линий 527 и 7 с другой разошлись после одного поколения инбридинга. Линии 4 и 475 насчитывают в своих родословных семь поколений строгого самоопыления (разошлись после четырех поколений инбридинга) и берут начало от автофертильного растения из шведского сорта Сталь (Steel). Линия 525 близкородственна линии 8, они разошлись в поколении 16; полученном от исходного автофертильного растения немецкого сорта Петкус (Petkus). Линия 112 выделена из самонесовместимого образца генетической коллекции Черноколосая фиолетовозерная и прошла три поколения строгого инбридинга. Близкородственные линии 2 и 3 получены путем прямого инбридинга из образца Ветвистоколосая, который в свою очередь выделен из сорта Вятка Московская.
В соответствии с разными этапами генетического изучения автофертильности получали необходимые гибриды. Для гибридологического анализа автофертильности получали гибриды Fi от диаллельных скрещиваний линий 2-8, а также гибриды этих линий с самонесовместимыми (самостерильными) растениями сорта Волхова. Далее проводили индивидуальные скрещивания гибридов Fi с одними и теми же самонесовместимыми клонами сорта Волхова. Для дальнейших исследований отбирали гибриды, полученные в скрещиваниях с клонами, обладавшими автофертильностью меньшей 1%. При всех других скрещиваниях, проводимых для изучения генетики автофертильности, также контролировали завязываемость семян путем самоопыления материнских растений сорта. Для этого на каждом растении изолировали по два-три колоса с помощью пергаментных изоляторов, а один-два колоса кастрировали и использовали для скрещиваний с автофертильными линиями. Семена гибридов F2 (инбредные потомства) получали путем изоляции колосьев у отдельных растений Fi.
Анализ сцепления морфологических маркеров с изозимными локусами и их молекулярное картирование проводили с помощью специально полученных гибридов F2. Гибриды Fi получали путем скрещивания растений образцов генетической коллекции с автофертильными линиями, несущими идентифицированные мутации автофертильности. В ряде случаев образцы генетической коллекции несли не один, а несколько сцепленных или несцепленных морфологических маркеров. Описание проявления мутантных генов приведено в соответствующем разделе диссертации. Гибридный материал, созданный для генетического изучения автофертильности, использовали и для анализа сцепления изозимных локусов между собой. Инбредные потомства с расщеплениями по изозимным маркерам отбирали путем скрининга выборок численностью 10-12 растений.
Наиболее трудоемким было создание картирующих популяций для анализа синаптических мутаций. Эти мутации в гомозиготе ведут к стерильности и поэтому их поддерживают в гетерозиготном состоянии путем самоопыления растений в пределах линий с последующим цитологическим анализом потомства (Соснихина и др., 1994). В семьях с расщеплениями по синаптическим мутациям syl, sy9 и syl9 проводили индивидуальные скрещивания фертильных растений с автофертильной линией 6. Гибриды Fi изолировали для получения инбредных потомств. Далее в F2 проводили скрининг на выщепление стерильных растений, результаты которого на следующий год подтверждали с помощью цитологического анализа. Анализ расщепления по мейотическим мутациям проводили сотрудники лаборатории генетики растений БиНИИ СПбГУ согласно методам, принятым в лаборатории (Соснихина и др. 1994).
Картирование локусов количественных признаков (QTL-анализ) осуществляли с помощью двух групп гибридов. Первую группу составляли гибриды F2, полученные от самоопыления двух реципрокных гибридов (растений) Fi. Эти гибриды использовали и для включения изозимных локусов в молекулярные генетические карты (Korzun et al., 2001). Гибридные популяции (Минские картирующие популяции, МКП) были получены в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси др. Т.С. Шилко на основе скрещивания двух родственных линий — 87 и 105, выделенных из инбредного потомства сложного межсортового гибрида. Вторую группу гибридов составили гибриды F2, полученные на основе скрещивания трех неродственных линий (линий 2, 6 и 7) из Петергофской генетической коллекции (Петергофские картирующие популяции, ПКП).
Маркерный анализ с привлечением дополнительных источников автофертильности
В случае блока эстеразных генов эти отклонения свойственны только отдельным семьям гибридов F2. Однако при объединении данных на основе расчета критерия однородности наблюдается достоверное отклонение от моногибридности как для семей с доминантно-рецессивным, так и для семей с кодоминантным проявлением локуса Est6/9.
Наиболее показательно расщепление по AadhNADP, говорящее о тесном сцеплении этого гена с мутацией автофертильности (табл. 3.7). Во всех восьми семьях F2 обнаружен значительный недостаток растений, гомозиготных по аллели, полученной от самонесовместимого родителя. Однако в двух семьях 2/4 и 2/5 этот недостаток сопровождается достоверным избытком гетерозигот, что можно отнести и к ошибке выборочности. При суммировании данных по шести семьям сохраняются оба статистических условия гаметической селекции у одного пола — доля гетерозигот равняется 0,5 и наблюдается значимый избыток гомозигот по маркерной аллели от автофертильной линии.
В масштабных мутационных экспериментах у канареечника (Phalaris coerulescens Desf.) был обнаружен третий локус самонесовместимости (7), помимо двух мультиаллельных локусов S и Z, установленных у этого вида ранее (Hayman, Richter, 1992). Учитывая систематическую близость ржи, канареечника и других самонесовместимых видов семейства злаковых (Hayman, 1956; Hayward, Wright, 1971; Fearon et al., 1983), можно думать, что третий локус самонесовместимости входит в общую для этих видов систему генетического контроля внутривидовой несовместимости наряду с локусами S и Z. На существование третьего локуса несовместимости, обнаруживаемого только через его мутантное состояние - аллель самосовместимости (автофертильности), указывал и А. Лундквист (Lundqvist, 1968). Вывод о существовании этого локуса был основан на косвенных данных, полученных при идентификации мутаций автофертильности в локусах S и Z. Возможно, что отклонения в наследовании морфологических маркеров, установленные И.М. Суриковым (Суриков, Романова, 1982) также связаны с действием дополнительного локуса несовместимости. По аналогии с канареечником мы предложили использовать символ Т и для обозначения третьего локуса самонесовместимости у ржи (Егорова, Войлоков, 1998а,Ь).
В результате работы по идентификации мутаций автофертильности у инбредных линий ржи мы пришли к заключению о существовании трех локусов самонесовместимости, мутантные аллели которых нарушают функционирование этой системы- и приводят к самосовместимости (автофертильности). Мутации во всех трех локусах обладают четырьмя общими свойствами в наследовании у гибридов между SS и SF формами, вытекающими из гаметофитного характера их проявления: 1. Автофертильность, определяемая этими мутациями, «доминирует» у гибридов Fb 2. В инбредных потомствах гибридов SS х SF отсутствует расщепление по автофертильности, контролируемой /-мутациями. 3. В потомстве от самоопыления гетерозигот по sf-мутациям наблюдаются отклонения в наследовании маркеров, сцепленных с этими мутациями. 4. Соотношение генотипов в F2 по маркерам, сцепленным с /-мутациями, зависит от числа мутаций автофертильности, находящихся в гетерозиготном состоянии у гибридов Fi. Следует заметить, что вывод о принадлежности мутаций из 1R и 2R хромосом к локусам S и Z, соответственно, основан только на близости значений частоты рекомбинации между маркерами и локусами несовместимости, полученными в нашей работе и известными из литературы. Очевидно, что строгое доказательство принадлежности sf-мутацш. к генам, входящим в сложные локусы S и Z, можно осуществить только на уровне ДНК. Частота рекомбинации, рассчитанная нами по объединенным данным, составляет между S и Ргх 7 - 0,8 ±0,6%, между Z и fi-GIu - 16,7±5,4%, между Т и AadNADP - 1,6±1,5%. 3.1.3. Маркерный анализ с привлечением дополнительных источников автофертильности
В результате проведения сегрегационного и маркерного анализов автофертильности нами было установлено соответствие между моногибридным расщеплением по автофертильности и наличием мутантной аллели в локусах несовместимости S, Z или Т. Это позволило перейти к целенаправленной идентификации мутаций автофертильности из других источников, а также облегчило задачу идентификации и локализации /-мутаций у автофертильных линий ржи, имеющих родственное происхождение по отношению к уже исследованным семи линиям.
Очевидно, что чем теснее сцеплены изозимный маркер и мутация автофертильности, тем сильнее будет проявляться отклонение в расщеплении по маркеру. Следовательно, при установлении генотипа инбредной линии ржи по /-мутациям в первую очередь необходимо провести анализ расщеплений по л оку су Ргх7, тесно сцепленному с локусом S, и в зависимости от результатов вовлекать в анализ изозимные маркеры других локусов несовместимости. На этом этапе работы в эксперименты были вовлечены двенадцать инбредных линий, представляющие семь независимых источников автофертильности. Происхождение этих линий, а также родственные связи между ними и линиями, изученными ранее, представлены на схеме в разделе «Материалы и методы».
Тесное сцепление локуса S с геном Ргх7 позволяет легко идентифицировать мутации автофертильности в этом локусе (табл.3.8). Анализ данных по гибридам F2 приводит к заключению о том, что линии 527, 525 и 112 несут /-мутации именно в локусе S. Расщепление по Ргх7 в девяти семьях F2 с участием этих линий близко к соотношению 1:1, ожидаемому при абсолютном сцеплении Sfn Ргх7. Этот вывод подтверждается тем, что линии 7 и 8, родственные линиям 527 и 525 соответственно, также мутантны по локусу S. Однако у гибридов с линией 498, родственной линиям 7 и 527, расщепление по Ргх7 в шести семьях F2 соответствует соотношению 1:2:1. Это говорит о том, что линия 498 мутантна по другому локусу несовместимости.
Анализ соотношений генотипов по Ргх7 в инбредных семьях гибридов с линией 524 также не выявил отклонений от соотношения 1:2:1, что свидетельствует об отсутствии /-мутации в локусе S у этой линии и соответствующего источника автофертильности. Этот же вывод может быть сделан в отношении трех родственных линий: 437, 470 и 454. Данные по 16 гибридам F2 с линиями 437 и 470 однородны и соответствуют расщеплению 1: 2:1. Данные, полученные в трех семьях F2 с участием линии 454, неоднородны, отклонение от соотношения 1:2:1 наблюдается только в одной семье и вызвано избытком гетерозигот, что, очевидно, нельзя объяснить, исходя из сцепления локуса Ргх7 с /-мутацией в локусе S.
Использование генетических маркеров для решения некоторых задач генетики и селекции ржи
Наиболее важные хозяйственно-ценные признаки культурных растений относятся к категории количественных. Маркерный анализ количественных признаков (QTL-анализ) позволяет выявлять локусы количественных признаков (QTL), определять их эффекты и картировать на генетических картах (Серебровский, 1970; Король и др., 1990). Сложность проведения QTL-анализа у озимой ржи связана, в первую очередь, с длительным жизненным циклом, в течение которого растения в полевых условиях подвергаются влиянию резко меняющихся условий среды, переносят заболевания и повреждаются насекомыми. Все это значительно увеличивает ненаследственную изменчивость, в которой могут «потонуть» генетически контролируемые различия. Поэтому главной из наших задач было установить саму возможность проведения успешных экспериментов по картированию QTL у озимой ржи.
Первые данные по анализу QTL, полученные нами в предварительных экспериментах (Borner et al., 1999) показали, что картирование QTL у ржи является реальной задачей. В популяции, генотипированной по RFLP-маркерам хромосомы 5R и расщепляющейся по гену доминантной короткостебельности (Ddw), в прицентромерном районе плеча 5RL между маркерами AadhNADP и Xwgl026, был картирован не полностью доминантный QTL, отвечающий за два тесно скоррелированных признака - длину колоса и число колосков в нем. В дистальном участке этого же плеча локализован ген Ddw, эффекты которого на длину стебля также были обнаружены при проведении маркерного анализа. Более масштабные эксперименты были проведены с потомствами F3, полученными на основе Минской картирующей популяции (Borner et al., 2000). Эксперименты проводили в трех вариантах условий выращивания растений - в полевых условиях в Гатерслебене (Германия) и в Старом Петергофе, а также в теплице после предварительной яровизации растений. Эта популяция также расщеплялась по гену Ddw, поэтому значительную часть выявленных QTL (10 из 21) можно отнести за счет плейотропных эффектов этого гена. Дополнительный локус с плейотропным эффектом на компоненты урожайности был обнаружен в прицентромерном районе хромосомы 2R. Остальные локусы со специфическими эффектами отнесены к хромосомам 1R, 2R, 4R, 6R и 7R. Как и в большинстве исследований по картированию QTL (Tanksley, 1993; Kearsey, Farquhar, 1998; Asins, 2002), эффекты выявленных локусов обнаружены не для всех условий выращивания растений.
Небольшое число локусов, выявленных в этих экспериментах, могло быть связано с тремя причинами. Во-первых, картирующая популяция расщеплялась по гену доминантной короткостебельности Ddw, обладающему сильными эффектами на анализируемые количественные признаки. Это резко увеличивало неконтролируемую изменчивость в QTL - группах, включающих интервалы, несцепленные с геном Ddw, и тем самым снижало вероятность обнаружения QTL с более слабыми эффектами. Во-вторых, использованная для QTL-анализа версия программы MAPMAKER/QTL 1.1. (Paterson et al., 1988) обладает ограниченными возможностями, в частности, она не позволяет исключить эффекты главного гена путем проведения доступных в настоящее время вариантов множественного интервального картирования. В-третьих, родство родительских линий МКП могло значительно снизить шансы обнаружения QTL в силу низкой степени гетерозиготности по этим локусам.
Для устранения этих причин в последующих экспериментах по QTL-анализу мы использовали гибриды между тремя неродственными линиями Петергофской генетической коллекции (линии 2, 6 и 7), не несущими гена Ddw. Картирование QTL осуществлялось с помощью коммерческой программы MultiQTL v. 2.5 (http://www.multiqtl.com), позволяющей проводить комплексный QTL-анализ. Использование трех линий увеличивало вероятность обнаружения полиморфных QTL. Диаллельность скрещиваний позволяла решить еще одну задачу - изучить влияние генотипического фона на выявляемость и эффекты QTL (оценить эпистатические взаимодействия). При отсутствии эпистаза, в случае обнаружения QTL у одного из гибридов, этот QTL должен выявляться еще у одного гибрида (две аллели у родительских линий) или у всех трех (случай трех QTL аллелей). Аналогичный прогноз возможен и в отношении эффектов обнаруженных QTL. Таким образом, выявление QTL только у одного из гибридов или различия в направлении действия его аллелей у разных гибридов могут свидетельствовать о влиянии генотипического фона на экспрессию QTL.
Итоги экспериментов по QTL-анализу в ПКП включают в себя данные по количественным признакам, описание генетических карт и собственно результаты картирования QTL. В целях сравнения с результатами предварительных экспериментов в диссертацию включены данные только по тем признакам, анализ которых был проведен в МКП.
Важным условием проведения QTL-анализа является соответствие распределения количественных признаков нормальному распределению. Использование средних арифметических, рассчитанных для каждой семьи F3 в качестве характеристик растений F2, позволило не только снизить средовую изменчивость, но и для большинства признаков обеспечило нормальность распределений. В нескольких случаях несоответствие устраняли исключением выскакивающих вариант, число которых не превышало трех. Нормальность распределений контролировали с помощью коэффициентов эксцесса и асимметрии, расчет которых обеспечивался программой MultiQTL.
В табл. 3.21 приведены символы, названия и краткие описания восьми признаков, отобранных для QTL-анализа. Выбор признаков был, в первую очередь, связан с их хозяйственной важностью. В этом отношении ведущим показателем является урожай, оцениваемый как масса зерна с единицы площади. В строгом генетическом смысле этот показатель, как и густота стеблестоя, не являются признаками, так как их оценка оторвана от конкретного генотипа (особи). Поэтому в наших экспериментах для оценки урожая мы использовали массу зерна с растения.
