Введение к работе
Кластер рибосомных генов (рДНК) является классическим примером мультигенного семейства, у разных видов эукариот в пределах одного кластера располагается от нескольких сотен до нескольких тысяч структурных единиц У всех видов эукариот каждая единица транскрипции рДНК кодирует 18S, 5,8S, 28S, перечисленные в порядке их расположения, начиная с 5'-конца При этом повторяющиея единицы не разбросаны по геному, а формируют кластеры, в которых гены рРНК (18S, 5,8S, 28S) разделены рядом спейсерных последовательностей -внутренними транскрибируемыми (ITS1 и ITS2), внешним транскрибируемым (ETS) и межгенными (IGS), или нетранскрибируемыми (NTS) спейсерами (рисунок 1)
Одной из отличительных черт эволюционной изменчивости рДНК является тот факт, что степень вариабельности различных участков этих генов сильно отличается Гены рибосомных РНК представляют собой наиболее эволюционно консервативные последовательности кластера рДНК, а межгенный спейсер (IGS) -наиболее изменчивую часть этого участка генома В пределах одного генома может содержаться несколько типов IGS Анализ изменчивости данного района рДНК позволяет проследить первые этапы эволюционного процесса, т е возникновение индивидуальных, внутрипопуляционных и межпопуляционных генетических различий, предшествующих возникновению нового вида Регуляторные элементы IGS, такие как промоторы, энхансеры и терминаторы транскрипции рРНК, играют важную роль в регуляции транскрипции рРНК, процессинге пре-рРНК и возможно, в регуляции числа повторов рДНК Очевидно, что структура IGS имеет важное функциональное значение, поскольку различные типы IGS обуславливают различный уровень экспрессии находящихся под их контролем генов рРНК Описание структуры различных вариантов нетранскрибируемых спейсеров эукариот позволит прояснить влияние данных последовательностей на транскрипционную активность рибосомных генов
В настоящее время структура IGS многих видов остается неизвестной В данной работе описана структурная организация двух вариантов IGS рыжего таракана Blattella дегтапюа и проведен сравнительный анализ этих последовательностей
Известно, что одной из важных составляющих генома эукариот являются мобильные генетические элементы (МГЭ) Доля генома, приходящаяся на мобильные элементы может составлять десятки процентов Изучение МГЭ является
важным направлением исследований в области молекулярной генетики и молекулярной эволюции
Известно, что кластеры рибосомных генов многих эукариот служат так называемой «нишей» для множества семейств мобильных элементов Первыми в данном участке генома были идентифицированы R1 и R2 ретротранспозоны D melanogaster, которые интегрируются в высококонсервативный район 28S гена [Dawid and Rebert, 1981, Roiha et a! 1981] Оба элемента (как R1, так и R2) выявлены в идентичных сайтах у всех исследованных видов типа Членистоногие и, в частности, насекомых Данные элементы относятся к несодержащим длинных концевых повторов (non-LTR) ретротранспозонам и являются стабильным компонентом генома членистоногих, несмотря на то, что инсерциии приводят к инактивации генов 28S рРНК
Механизм интеграции R1 и R2 ретротранспозонов являлся предметом изучения многих авторов Несмотря на общность этого механизма для всех non-LTR ретротранспозонов, детали процесса интеграции R1 и R2 ретротранспозонов значительно различаются между собой и, следует отметить, не каждый этап жизненного цикла этих мобильных элементов изучен к настоящему времени достаточно полно
В настоящее время во многих лабораториях мира активно ведутся исследования R1 и R2 мобильных элементов, однако полной ясности в понимании особенностей «жизнедеятельности» данных ретротранспозонов еще не получено
Цели и задачи исследования
Целью данной работы являлась характеристика внутривидовой структурной вариабельности рДНК рыжего таракана, выявляемой на уровне анализа полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), и последующее сравнительное описание структуры нескольких компонентов рДНК, а именно, R1/R2 ретротранспозонов и нетранскрибируемого спейсера, как гипервариабельных участков этого участка генома, способных обуславливать изменчивость рДНК
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи данного исследования
Провести анализ наследования различных структурных вариантов (Hff?dlll паттернов) рДНК рыжего таракана в ряду 12 поколений
Амплифицировать, клонировать и секвенировать протяженные фрагменты R1 и R2 мобильных элементов рыжего таракана (5'-укороченные копии),
интегрированные в 28S гены рибосомных РНК, и провести их структурно-функциональный анализ
Дать структурно-функциональную характеристику клонов, содержащих нативные копии R1 и R2 ретротранспозонов библиотеки генов рыжего таракана, полученной на основе космидного вектора (SuperCosI cosmid "Stratagene") Описать структуру полноразмерной копии R2 ретротранспозона
Амплифицировать, клонировать и секвенировать один из вариантов межгенного спейсера рДНК рыжего таракана и провести сравнительный анализ его структуры с ранее описанным в лаборатории вариантом IGS
Научная новизна и практическая ценность работы
Разработка молекулярно-генетических маркеров, позволяющих
дифференцировать популяции живых организмов, представляется актуальной задачей, особенно, когда объектом исследования является генетически мало изученный синантропный паразит - рыжий таракан В рамках диссертационной работы показано стабильное наследование различных структурных вариантов рДНК (Hmdlll паттернов) в ряду 12 поколений этого вида насекомых, то есть в течение трех лет существования изосамочьей линии Исследование стабильности наследования молекулярно-генетического маркера является необходимым этапом на пути к практическому применению изучаемого маркера для дифференциации популяций тараканов, определения генетических дистанций между ними и уровня миграции Успешное развитие исследований в данном направлении позволит установить основные пути переноса тараканов и, соответственно, сфокусировать санэпидемиологический надзор в правильном направлении
Впервые выявлены, клонированы и секвенированы протяженные фрагменты (5'-укороченные копии), интегрированных в геном R1 и R2 ретротранспозонов рыжего таракана В дегтатса Сравнительный структурный анализ полученных клонов позволил выделить два подсемейства элементов R1, значительно отличающихся по нуклеотидной последовательности Однако все клоны R1 элементов В дегтатса имели две общие черты - политимидиновый участок (поли (Т)) и сходные дупликации сайта интеграции В нуклеотидной последовательности элементов R2 найдены характерные делеции в З'-области сайтов-мишеней и отсутствие гомополинуклеотидных участков
Показано, что ретротранспозоны R1 В дегтапюа являются первыми представителями мобильных элементов клады R1 ретротранспозонов, содержащими на З'-концах политимидиновые последовательности
Определена полная последовательность нуклеотидов R2 мобильного элемента В дегтапюа Показано, что полноразмерная копия R2 мобильного элемента имеет размер 4343 пн, из которых 3477 пн соответствуют единственной открытой рамке считывания (ORF) В предсказанной in silico последовательности аминокислот выявленной ORF определены функционально значимые домены три домена цинковых пальцев и высококонсервативный домен обратной транскриптазы (Rt)
Проведен филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей аминокислот, соответствующих высококонсервативному домену обратной транскриптазы ORF R2 мобильных элементов различных видов насекомых и ракообразных Можно заключить, что R2 ретротранспозон В дегтапюа является наиболее древним представителем этого класса мобильных элементов насекомых
Известно, что межгенный спейсер рДНК (IGS) эукариот содержит субповторы, обуславливающие регуляцию активности промотора РНК полимеразы I -потенциального уникального инструмента для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии [Paule & Lofquist, 1996, Sollner-Webb & Tower, 1986, Massin et al, 2005] В рамках данной работы впервые проведен сравнительный анализ двух вариантов IGS S дегтапюа и показаны различия в количестве и типе внутренних субповторов данных последовательностей Впервые описана структура и локализация выявленных субповторов, что открывает возможность дальнейшей экспериментальной проверки их функциональной значимости
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на 9-й конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2005, 10-й школе-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН Пущино, 2006, Конкурсе научных работ молодых ученых, Москва, ИОГен РАН и кафедра генетики Биофака МГУ, 2005, Международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы», Новосибирск, 2005, XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006», Москва,
2006, Отчетной конференции «Динамика генофондов растений, животных и человека», Москва, 2006, Отчетной конференции «Биоразнообразие и динамика генофондов», Москва, 2007, 4-м Международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 2007
Объем и структура работы
