Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
Денсовирусы 8
Общая характеристика денсовирусов 8
Краткое описание структурно-функциональной организации денсовирусов, инфицирующих различные виды насекомых 13
Генетические элементы, содержащие домен обратной транскриптазы 48
Мобильные элементы 56
Типы мобильных элементов 57
Дупликация сайтов-мишений 58
Мобильные элементы как диспергированные повторяющиеся последовательности. 60
Индукция мобильных элементов под действием стресса 61
Материалы и методы 65
Условия содержания В. germanica 65
Постановка скрещиваний 65
Линии В. germanica, использованные в работе 66
Выделение тотальной ДНК рыжего таракана 66
Электрофорез в агарозном геле 67
Полимеразная цепная реакция 67
Получение очищенных продуктов ПЦР 68
Лигирование фрагментов ДНК 68
Трансформация клеток Е. coli 69
Выделение и очистка плазмидной ДНК для идентификации рекомбинантных молекул 70
Рестрикция рекомбинантных плазмид для установления длины вставки 72
Секвенирование ДНК 72
Компьютерный анализ 72
Саузерн-блот гибридизация 73
Поддержание пересеваемой культуры клеток B.germanica 73
Облучение клеток у-лучами 75
Микроинъекции вирусных частиц под кутикулу тараканов 75
Электронная микроскопия срезов ткани тараканов 76
Результаты и обсуждение 77
1. Распространенность денсовируса BgDNV в популяциях рыжего таракана 78
2. Пересеваемая культура клеток рыжего таракана как модель для изучения денсовируса 80
3. Анализ тканеспецифичности развития вирусной инфекции 87
4. Заражение рыжего таракана денсовирусом Bp/DNV методом микроинъекций. Поддержание вируса в лабораторных условиях 89
5. Определение видоспецифичности вируса 92
6. Обнаружение ретроэлементов рыжего таракана и анализ их взаимодействия с денсовирусом BgDNV 93
Обнаружение ретроидных элементов рыжего таракана Активизация выявленных ретроэлементов под действием денсовируса BgDNV
Выводы
Список литературы
- Общая характеристика денсовирусов
- Генетические элементы, содержащие домен обратной транскриптазы
- Линии В. germanica, использованные в работе
- Распространенность денсовируса BgDNV в популяциях рыжего таракана
Введение к работе
Актуальность проблемы
К настоящему времени описано около 25 денсовирусов различных видов беспозвоночных. Денсовирусы содержат линейную однонитевую молекулу ДНК. Размер вирионов денсовирусов составляет 18-25 нм. Длины геномов варьируются от 4000 до 6100 п.о. На флангах геномов денсовирусов находятся концевые инвертированные повторы (КИПы), образующие вторичные структуры. КИПы играют важную роль в автономной репликации вирусной ДНК.
Денсовирусы входят в семейство Parvoviridae, которое состоит из двух подсемейств - Parvovirinae и Densovirinae. Парвовирусы инфицируют клетки млекопитающих животных, денсовирусы - клетки членистоногих, главным-образом насекомых. Свое название они получили из-за содержания в ядрах зараженных клеток плотных, темных масс вирионов. Большинство денсовирусов вызывают летальные заболевания организма-хозяина.
Известно, что денсовирусы - эффективные переносчики генетической информации и могут быть использованы в качестве вектора в генетической инженерии, в частности, для экспрессии чужеродного генетического материала в клетках насекомых. В настоящее время несколько видов денсовирусов были успешно использованы для этих целей [Afanasiev B.N., Ward T.W., Beaty В. J., Carlson J.O., 1999].
Кроме того, описанная «особенность» позволяет на стадии клонированного в плазмидном векторе вируса осуществлять с его ДНК любые генно-инженерные манипуляции, а затем изучать, как внесенные изменения скажутся на фенотипе (свойствах) вируса.
В 2000 году Д.В. Муха и К. Шал обнаружили новый денсовирус - денсовирус рыжего таракана (BgDNV) [Муха Д.В. Шал К., 2003] и приступили к его изучению.
Данный вирус на сегодняшний момент является единственным описанным денсовирусом рыжего таракана.
Можно надеяться, что создание векторных конструкций на основе BgrDNV позволит на новом уровне изучать молекулярно-генетическую организацию данного вида насекомых и разработать новые экологически чистые методы регуляции численности этого синантропного паразита.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было изучение взаимодействия между денсовирусом (SgDNV) и его хозяином (В. germanica).
Были поставлены следующие задачи:
1) Изучить распространенность денсовируса в популяциях рыжего таракана;
2) Исследовать динамику роста вируса BgDNV в культуре клеток;
3) Описать цитопатологические эффекты, вызываемые вирусной инфекцией;
4) Исследовать тканеспецифичность денсовирусной инфекции рыжего таракана;
5) Разработать метод поддержания вируса в лабораторных условиях;
6) Исследовать степень видоспецифичности BgDNV;
7) Исследовать геномные изменения в организме рыжего таракана, вызываемые вирусной инфекцией.
Общая характеристика денсовирусов
Денсовирусы (DNVs) являются членам семейства Parvoviridae, которое состоит из двух подсемейств: Parvovirinae и Densovirinae. Парвовирусы - вирусы позвоночных, тогда как денсовирусы - вирусы членистоногих животных, главным образом насекомых. В настоящее время известно пять различных отрядов насекомых (Lepidoptera, Orthoptera, Diptera и Odonate) у представителей которых обнаружены денсовирусы [Fediere, 2000]. К настоящему времени открыто около 25 денсовирусов [Tijssen P., Li Y., El-Far М., Szelei J., Letarte M., Zadori Z., 2003].
Около 25 денсовирусов были выделены из различных видов беспозвоночных: насекомых, креветок [Shike Н., Dhar А.К., Burns J.C., Shimizu С, Jousset F.-X., Klimpel K.R., Bergoin M., 2000]. Физико-химические свойства денсовирусов подобны свойствам парвовирусов позвоночных, хотя они имеют очень небольшое сходство нуклеотидных последовательностей [Chapman М. S., Rossmann М. G., 1993].
Подсемество денсовирусов делится на три рода: один род (Densovirus) содержит денсовирусы, цепи ДНК которых упаковываются примерно в одинаковом количестве, с геномом размером около 6 т.п.о, содержащем длинные инвертированные терминальные повторы, такие, как Junonia coenia DNV (JcDNV) и денсовирус Galleha mellonella, GmDNV; второй род (Brevidensovirus) состоит из денсовирусов, у которых упаковывается преимущественно одна цепь, с геномом размером около 4 т.п.о., неодинаковые терминальные «шпильки», например, денсовирус Aedes (AaeDNV); в третий род (Interavirus) входят вирусы, у которых упаковывается преимущественно одна цепь, с геномом размером около 5 т.п.о., содержащим довольно короткие КИПы (Casphalia DNV, Bombix mori DNV). Некоторые денсовирусы, нуклеотидная последовательность которых определена к настоящему времени не подходят под данное разделение на три рода. Многие другие денсовирусы остаются неклассифицированными из-за отсутствия их молекулярных характеристик.
Ядра зараженных денсовирусами клеток становятся темными, электронная микроскопия позволяет рассмотреть плотные массы вирионов. Из-за этого свойства денсовирусы получили свое название [Vago С, Duthoit J.L. Delahaye F., 1966].
Это предположительно обусловлено тем, что эти вирусы автономно реплицируются и собираются в ядре. Как правило, денсовирусы вызывают смертельные заболевания хозяев [TanadaY., Кауа Н. К., 1993]. Первые симптомы - потеря аппетита, вялость, подавление линьки и метаморфоза. Личинки насекомых становятся белесыми, у них наблюдаются признаки паралича конечностей. Такие симптомы у 4aeDNV и M/DNV. Таракан P. fuliginosa, зараженный P/DNV, проявляет сходные симптомы: перед смертью задние ноги парализуются, и их движения становятся нескоординированными. Другие денсовирусы вызывают опухоли в кишках хозяев, эпителиальные клетки средней кишки зараженных личинок разрастаются, становятся тонкими и полупрозрачными.
Денсовирусы имеют гексагональную форму с диаметром 19-22 нм и содержат линейную однонитевую молекулу ДНК протяженностью примерно 5-6 т.п.о. В зависимости от типа вируса вирусные частицы могут содержать или преимущественно комплементарную мРНК нить ДНК (например, /AaeDNV), или обе нити примерно в равном отношении (например, JcDNV) [ Bergoin М., Tijssen P., 2000]. В том случае, когда в различных вирусных частицах упакованы как «плюс», так и «минус» нити, при выделении тотальной ДНК в условиях высокой концентрации соли происходит формирование двухцепочечной ДНК.
Фланги ДНК денсовирусов содержат концевые инвертированные повторы (КИП), способные формировать вторичные структуры. У некоторых вирусов, например у JcDNV, КИП являются одинаковыми на обоих концах вирусной ДНК [Dumas В., Jourdan М., Pascaud А.-М., Bergoin М., 1992]; у других, например, у AaeDNV, КИП представлены различающимися последовательностями [Afanasiev B.N., Galyov Е.Е., Buchatsky L.P., Kozlov Y.V., 1991]. Показано, что КИП играют важную роль в процессе автономной репликации вирусной молекулы [Astell C.R., 1990]. Все денсовирусы, нуклеотидная последовтельность которых определена к настоящему времени, имеют несколько открытых рамок считывания (ОРС). В зависимости от типа вируса ОРС могут быть локализованы в одной или обеих цепях вирусной ДНК. Часть из них кодирует последовательности, экспресирующие белки вирусной капсулы, другие ОРС экспрессируют неструктурные регуляторные белки [Bergoin М., Tijssen Р., 2000].
Вирус - эффективный переносчик генетической информации и может быть использован как вектор в генетической инженерии. Денсовирусы, измененные методами генетической инженерии, могут быть использованы в качестве удобных векторных систем для генетических манипуляций с насекомыми; в настоящее время несколько денсовирусов были успешно использованы для этих целей. Другая интересная возможность заключается в использовании вирусов насекомых для контроля над численностью, используя вирус для доставки гена специфического для насекомых токсина.
Генетические элементы, содержащие домен обратной транскриптазы
Около 30 лет назад при исследовании вирусов был обнаружен фермент -обратная транкриптаза - обладающий способностью синтезировать однонитевую ДНК, используя в качестве матрицы РНК. Вирусы, геном которых кодирует данный фермент, были названы ретровирусам. Ретровирусы составляют большое семейство вирусов животных. Их свойства - это одноцепочечный PHK-содержащий геном и репликация с помощью обратной транскриптазы, которую кодирует вирусный геном. Хотя ретровирусы различаются друг от друга в деталях, все они имеют три гена: gag, рої и env, и фланкируются двумя длинными. концевыми повторами (ДКП) [Varmus Н. Е., 1983]. Ген рої кодирует несколько различных энзимов, среди которых есть обратная транскриптаза. Участок гена рої, который кодирует обратную транскриптазу, является наиболее консервативным участком ретровирусного генома и используется для определения филогенетического родства среди ретровирусов [Chui I.-M. et al., 1988]; а также для определения родства между ретровирусами и ретротранспозонами дрозофилы [Toh Н., et al., 1986]. Ген gag кодирует белок капсида, ген env- белок оболочки.
С того времени были найдены многие генетические элементы, содержащие ОРС, кодирующие белки со структурой, сходной с ретровирусной обратной транскриптазой [Weiner А. М., Deininger P. L.„ Efstratiadis А., 1986]. Последовательности, кодирующие обратную транскриптазу, были обнаружены во многих различных элементах, включая ДНК-содержащие вирусы растений и животных [Toh Н., Hayashida Н., Miyata Т., 1983]. Элемент млекопитающих L1 [Hattori М., Kuhara S., et al., 1986], мобильные элементы дрозофилы, дрожжей, трипаносомы [Saigo K.,et. al., 1984; Clare J., 1985; Kimmel B. E., Ole-Moiyou О. K„
Young J. R., 1987] и митохондриальные плазмиды и интроны грибов [Michel F., Lang F., 1985; Matsuura E. Т. Domenico J. M., Cummings D. J., 1986].
В настоящее время генетические элементы, содержащие домен обратной транскриптазы, делятся на несколько групп: гепаднавирусы - вирусы животных и каулимовирусы - вирусы растений, ДНК-содержащие вирусы; мобильные элементы дрожжей и дрозофилы, которые содержат гены gag и рої и длинные концевые повторы; интроны II группы дрожжей и митохондриальные плазмиды; и і группа мобильных элементов, обнаруженных у млекопитающих и дрозофилы, которые также содержат гены gag и рої, но не содержат длинные концевые повторы (ДКП) [Fawcett D. Н., Lister С. К., Keller Е., Finnegan., 1986]. Сходство последовательностей аминокислот данных элементов приводит к выводу об общем их происхождении. Элементы, в отличие от вирусов не образуют вирусных частиц, так как не кодируют необходимые для этого белки, но так же, как и ретровирусы, имеет обратную транскриптазу, обладают способностью перемещаться по геному и интегрировать.
Хотя сходство нуклеотидных последовательностей может быть обнаружено и в других кодирующих участках данных групп генетических элементов, только участок, кодирующий обратную транскриптазу, является общим для всех данных элементов и может быть использован для филогенетического анализа ретроэлементов. Ретроэлементы могут быть разделены на две большие ветви. Первая ветвь содержит митохондриальные интроны II порядка и ретротранспозоны, не содержащие длинные концевые повторы (non-LTR). Вторая ветвь включает в себя ретровирусы и содержащие ДКП ретроэлементы. Гепаднавирусы, copia-элементы и Ту-элементы составляют наиболее отдаленную часть этой ветви, тогда как каулимовирусы близки к ретровирусам.
Дополнительные генетические элементы из всех данных категорий были обнаружены в различных таксонах, в том числе в растениях и простейших. Данные ретроэлементы нельзя отнести к какой-либо ветви. Интересная последовательность, кодирующая обратную транскриптазу, обнаружена в бактериях. Данная обратная транскриптаза производит многокопийную одноцепочечную ДНК, содержащую как ДНК, так и РНК, связанную ковалентно с ДНК (msDNA) [Lim D., Mass W., 1989; Lampson B.C., Sun J„ et al., 1989].
Линии В. germanica, использованные в работе
В данной работе были использованы несколько линии рыжего таракана. 1-я линия (Р6) была получена в 1995 году из тараканов, пойманных на американской свиноферме. Данная линия инфицирована денсовирусом BgDNV. 2-я линия (Normal) была получена в 1993 году из тараканов, пойманных в жилых помещениях США. Было показано, что линия Normal не содержит денсовируса. Также были использованы линии "Orange" и "Black".
Выделение тотальной ДНК рыжего таракана Выделение тотальной ДНК из тараканов проводили согласно стандартной методике с обработкой лизата протеиназой К и последующей экстракцией ДНК смесью фенол-хлороформ [Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984]. .Особь гомогенизировали в 800 мкл раствора, содержащего ТрисНСІрН8,0 0,2 М ЭДТАрН8,0 0,5 М SDS 0,5% Протеиназа К (10мг/мл) до конечной концентрации 1% Лигировали в течение 4 часов при 55 С. Затем добавляли 8 мкл РНКазы, до конечной концентрации 50 мкг/мл оставляли на 15 минут.
После этого добавляли 700 мкл фенола. Перемешивали, центрифугировали при 5000 об./мин. Верхнюю фазу переносили в стерильный эппендорф. Добавляли 700 мкл фенол-хлорофома, перемешивали, центрифугировали, отбирали верхнюю фазу. Повторяли 2 раза. Добавляли к верхней фазе 30 мкл 5 М NaCI. Перемешивали. Добавляли 600 мкл хлороформа, перемешивали, центрифугировали, отбирали верхнюю фазу. ДНК осаждали 96% этанолом (1000 мкл), промывали сначала 70% этанолом, затем 96% этанолом.
Спирт отбирали, высушивали при 55 С, растворяли в 100 мкл стерильной воды. Качество выделения ДНК проверяли в агарозном геле. Электрофорез в агарозном геле
Разделение фрагментов ДНК осуществляли с помощью электрофореза в 0,8-1,2% горизонтальном агарозном геле с использованием трис-ацетатного буфера (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА). В гель добавляли бромистый этидий (1 мкг/мкл). Форез вели при напряженности электрического поля от 2 до 15 В/см и комнатной температуре. После разделения окрашенную бромистым этидием ДНК наблюдали при освещении геля ультрафиолетовыми лучами.
Полимеразная цепная реакция Реакцию проводили по следующей схеме: 5 минут при 95 С; 1 мин при 94 С (денатурация), 2 мин при 55 С (отжиг), 3 мин при 72С (элонгация) - 30 циклов; 7 мин при 72 С.
Для амплификации использовали набор реактивов «GenePakCore» фирмы «Лаборатория Изоген», в состав которого, в частности входят такие усилители полимеразной цепной реакции, как betain Na и (NH4)2S04. Результат реакции оценивали с помощью электрофоретического разделения фрагментов ДНК в агарозном геле.
Получение очищенных продуктов ПЦР Электрофорез ДНК проводился в 1% геле из легкоплавкой агарозы. Острым скальпелем вырезали из геля кусочки, содержащие нужные фрагменты ДНК, и помещали их в стерильные эппендорфы. Инкубировали при температуре 70 С до полного растворения агарозы. Последующую очистку проводили с использованием набора реактивов Wizard PCR DNA Purification Systems (Promega). Чистка продуктов ПЦР проводилась в соответствии с протоколом этой фирмы. В эппендорфы с ДНК добавляли по 1 мл Resin и перемешивали 20 секунд. Раствор помещали в колонку, соединенную с вакуумным насосом. После удаления жидкости из колонки наливали по 2 мл 80%-ного изопропилового спирта. Далее переносили миниколонку с ДНК в стерильный эппендорф и центрифугировали при 10 тыс. об./мин в течение 2-х минут при комнатной температуре. Снова переносили миниколонку в чистый эппендорф и добавляли 50 мкл бидистиллированной воды, центрифугировали 20 секунд при 10 тыс. об./мин. Проверяли чистоту и концентрацию ДНК в 1%-ном агарозном геле электрофорезом.
Распространенность денсовируса BgDNV в популяциях рыжего таракана
Как видно на рисунке 5, часть препаратов содержат как ДНК из вирусных частиц, так и репликативные формы вирусной ДНК (дорожки 1, 5, 8), часть - только ДНК из вирусных частиц (дорожки б, 7), часть препаратов - только ДНК репликативной формы вируса (дорожка 2) и, наконец, у части образцов используемым методом вирусная ДНК выявлена не была (дорожки 3, 4).
Интересен факт выявления препаратов тотальной ДНК, содержащих только репликативные формы вируса (дорожка 2). Вероятно, это аргумент в пользу интеграции вируса в геном. Возможно, вирусная ДНК интегрирована в геном хозяина и при определенных условиях происходит активизация вируса и начало репликации вируса вне хромосомы. Можно предположить, что в данном образце ДНК вирус начал реплицироваться, но еще не образовал вирусные частицы.
В то же время, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, комплементарными ДНК денсовируса (Vir1 - caggattgccataatagaag, Vir2 - catcatcttggttagactgtc), во всех образцах ДНК тараканов данной линии был выявлен продукт амплификации (рисунок 6). Рисунок 6. Результат амплификации ДНК тараканов п.о. линии Р6 с праймерами, комплементарными ДНК денсовируса (Virl/Vir2). Во всех образцах (дорожки 1-6) присутствует продукт амплификации. 500
Таким образом показано, что вирус в инфицированных тараканах может находиться в двух формах - активной и неактивной. Можно предположить, что в неактивной форме ДНК вируса находится не в виде эписомной ДНК и/или в вирусных частицах, так как в этих случаях методом блот-гибридизации должна была бы выявляться фракция вирусной ДНК, а интегрирована в геном хозяина.
Показано, что ареал обитания исследуемого денсовируса не ограничен охарактеризованной выше популяцией тараканов. При исследовании выборок тараканов из популяций этих насекомых, обитающих в свинарниках двух других коммерческих компаний - "Britt" и "Riverside" (обе расположены на территории США) - было показано, что часть особей данных популяций инфицированы денсовирусом.
Методом ПЦР тотальной ДНК тараканов (по 30 особей из каждой популяции) с праймерами Vir1/Vir2 BgrDNV был обнаружен у 50% особей популяции "Britt" и у 20% особей популяции "Riverside" (рисунок 7).
В работе использовали два типа пересеваемых культур клеток рыжего таракана: BGE-1 и BGE-2 [Kurtti T.J., Brooks М. А., 1976 (2)]. Клетки поддерживали на клеточной среде ранее описанного состава [Kurtti T.J., Brooks М. А., 1976 (1)] при температуре 25 С. Культуру клеток пересевали каждые 10 дней путем разведения суспензии клеток 1:10. Заражение культуры клеток денсовирусом проводили следующим образом. Несколько зараженных денсовирусом тараканов на стадии поздней инфекции гомогенизировали тефлоновым пестиком в культуральной клеточной среде. Полученный гомогенат пропускали через фильтр 0,22 мкм, и очищенный раствор добавляли в культуральную среду на стадии пересева клеток из расчета 1 часть гомогената на 50 частей культуральной клеточной среды.
Для анализа инфекционности вируса после 3-4т пересева зараженных денсовирусом клеток из последних выделяли тотальную ДНК, которую анализировали методом электрофореза в 1% агарозном геле. Показано, что активная репликация вирусной ДНК происходит только в клетках BGE-2 (см. рисунок 8). На рисунке 8 (дорожка 2) вирусная ДНК представлена в виде дополнительной фракции размером около 5 т.п.н. В пересеваемой культуре BGE-1 репликация вирусной ДНК используемым методом не выявляется (см. рисунок 8, дорожка 1).
В тоже время, при использовании более чувствительного метода, а именно, полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, комплементарными к ДНК денсовируса, было показано, что вирусная ДНК присутствует в образцах тотальной ДНК обеих инфицированных линий как на стадии 3-4Ш пересева после заражения (см. рисунок 9), так и при более длительном культивировании.
