Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Митохондриальная ДНК как инструмент эволюционных и популяционных генетических исследований 8
1.2. Некоторые таксономические и филогенетические проблемы гольцов рода Salvelinus 21
1.3. Дифференциация гольцов рода Salvelinus на основе кариологического, биохимического и молекулярно-генетического анализов 30
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы 42
2.2. Методы ; 42
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Дифференциация популяций мальмы и гольца Таранца по данным рестрикционного анализа гена цитохрома b мтДНК 52
3.2 . Дифференциация популяций мальмы и гольца Таранца по данным рестрикционного анализа участка ATPase6/ND4L мтДНК 60
3.3. Дифференциация северной и южной форм мальмы по данным рестрикционного анализа участков цитохрома b и ATPase6/ND4L мтДНК 71
3.4. Сравнительный рестрикционный анализ мтДНК в популяциях озерного гольца 82
3.5. Изменчивость нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b мтДНК гольцов рода Salvelinus 98
Глава 4. Заключение 171
Выводы 180
Список литературы 182
Приложение 1 202
Приложение 2 209
- Некоторые таксономические и филогенетические проблемы гольцов рода Salvelinus
- . Дифференциация популяций мальмы и гольца Таранца по данным рестрикционного анализа участка ATPase6/ND4L мтДНК
- Сравнительный рестрикционный анализ мтДНК в популяциях озерного гольца
- Изменчивость нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b мтДНК гольцов рода Salvelinus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Гольцы рода Salvelinus - относительно молодая группа лососевых рыб, привлекающая внимание ученых, как в России, так и за рубежом уже несколько десятилетий. Гольцы отличаются циркумполярным распространением, значительным фенотипическим разнообразием, обилием видов и внутривидовых форм, высокой географической изменчивостью на огромном ареале и экологической пластичностью, которая позволила им освоить большинство пресных и морских водоемов Голарктики. Эти уникальные особенности определяют повышенный интерес к гольцовым рыбам как модельным объектам для исследования морфологической, экологической и генетической изменчивости, закономерностей микроэволюции и формообразования. Изучение гольцов представляет значительный интерес еще и потому, что они являются наиболее типичными представителями северных экосистем и могут служить индикаторами их состояния и динамики. Научный интерес определяется, несомненно, и важным хозяйственным значением этих ценных лососевых рыб. Нерешенные проблемы систематики и филогении рода Salvelinus также активизируют дальнейшие исследования, связанные с привлечением новых методических подходов.
В последние десятилетия для изучения биологического разнообразия популяций, эволюции организмов и механизмов видообразования широко используются молекулярные методы анализа ДНК. Особое место среди высокополиморфных генетических систем занимает митохондриальная ДНК (мтДНК). Материнский характер наследования, отсутствие рекомбинации, высокий уровень изменчивости - эти уникальные свойства делают мтДНК высокоинформативным инструментом генетического анализа. Исследования мтДНК успешно применяются для выяснения филогении близкородственных видов, изучения гибридизации видов, реконструкции истории видов и популяций. Сравнительные исследования структуры генома, изменчивости и дивергенции нуклеотидных последовательностей позволяют выяснить закономерности эволюции животных на молекулярном уровне. Анализ генетической изменчивости является сегодня одним из основных методов для изучения популяционно-генетической структуры видов.
К настоящему времени накоплены данные по изменчивости ДНК популяций арктического гольца S. alpinus, мальмы S. malma, озерной S. namaycush и ручьевой S. fontinalis палий, кунджи S. leucomaenis и других видов (форм) из США, Канады, Японии, Англии, Ирландии, стран Скандинавии (Вrunner et al., 2001; Davidson, 1994; Grewe et al., 1990; Phillips et al., 1995; Phillips et al., 1999; Wilson et al., 1996). Недостаточно изученными как в плане видового разнообразия, так и по широте охвата ареала остаются российские популяции гольцов (Олейник, Скурихина, 1999; Salmenkova et al., 2000).
Перечисленный круг проблем определил актуальность проведенного исследования, а также цель и задачи данной работы.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение генетического разнообразия гольцов рода Salvelinus на основании данных о рестрикционном полиморфизме и изменчивости нуклеотидных последовательностей мтДНК.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Определить уровень межвидовой генетической изменчивости ивнутривидовых различий мальмы S. malma и гольца Таранца S. taranetzi на основе данных о рестрикционном полиморфизме двух участков мтДНК, сегмента ATPase6/ND4L и гена цитохрома Ь.
2. Установить степень дифференциации популяций северной S. m. malma и южной S. т. krascheninnikovi мальмы, используя рестрикционный анализ сегмента ATPase6/ND4L и гена цитохрома b мтДНК.
3. Исследовать в сравнительном аспекте изменчивость мтДНК в популяциях озерных гольцов из разных участков ареала.
4. Оценить уровень и время дивергенции мтДНК популяций и форм гольцов рода Salvelinus на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена цитохрома Ь.
5. Определить родственные взаимоотношения изученных гольцов рода Salvelinus на основании филогенетического анализа данных об изменчивости нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b мтДНК.
Научная новизна работы.
1. В работе впервые определены нуклеотидные последовательности гена цитохрома b мтДНК гольцов Дальнего Востока России. Показано, что исследование этого участка митохондриального генома может использоваться для дифференциации некоторых видов гольцовых рыб.
2. Впервые исследован полиморфизм мтДНК некоторых популяций мальмы и гольца Таранца из рек бассейнов Охотского и Берингова морей. Показана значительная генетическая гетерогенность северной формы мальмы и существование в митохондриальном генофонде этого подвида линий ДНК, отличающихся от основного пула мтДНК S. m. таїта. В генофонде проходного гольца Таранца обнаружен тип мтДНК, характерный для популяций мальмы, что, возможно, является отражением имевшей место в прошлом интрогрессивной гибридизации.
3. Получена уникальная информация об изменчивости мтДНК малоизученных озерных гольцов из водоемов Охотоморского побережья и бассейна р. Колымы. Предполагается, что озерные гольцы Охотоморья произошли от предков современной мальмы в Тихоокеанском бассейне, аколымские озерные гольцы, а также голец Таранца, малоротая и боганидская палии Чукотки - от другой предковой формы в Арктическом бассейне.
Впервые проведен анализ рестрикционного полиморфизма сегмента ATPase6/ND4L и определена нуклеотидная последовательность гена цитохрома b мтДНК боганидской палии Таймыра. Фиксация у S. boganidae из оз. Эльгыгытгын и оз. Лама типов мтДНК, специфичных для разных групп гольцов указывает на то, что боганидская палия Чукотки и боганидская палия Сибири принадлежат к различным эволюционным линиям и не могут относиться к одному виду.
В популяциях мальмы северного Охотоморья впервые обнаружены гибриды между мальмой и кунджей, что свидетельствует о вторичном контакте и интрогрессии мтДНК между этими видами. Предполагается, что межвидовая гибридизация происходила как в отдаленном прошлом, так и относительно недавно, поскольку один из обнаруженных гибридов фенотипически определен как мальма, а другой характеризуется промежуточным (гибридным) фенотипом, но оба имеют мтДНК кунджи.
6. У северной формы мальмы зафиксированы типы мтДНК, специфичные для южной формы этого вида, что может свидетельствовать о прошедшей между S. m. krascheninnikovi и S. т. таїта интрогрессивной гибридизации.
7. Разработан метод генетической идентификации гольцов на уровне видов (северная и южная мальма, арктический голец, голец Таранца, кунджа) и филогеографических групп (Охотская, Колымско-Чукотская, Сибирская) с помощью анализа рестрикционного полиморфизма участка ATPase6/ND4L мтДНК.
Практическая значимость работы. Лососевые рыбы рода Salvelinus являются важными компонентами водных экосистем Дальнего Востока. Для гольцов характерно повышенное биологическое разнообразие, а также существование редких, эндемичных форм. Гольцовые рыбы - ценные объекты рыболовного промысла. Они имеют особое значение для экономики коренных народностей, для любительского и спортивного лова. Кроме того, достаточно велик потенциал гольцов как объектов искусственного воспроизводства. В настоящее время недостаток сведений о современном состоянии популяций лососевых рыб рода Salvelinus, а также несовершенные природоохранные мероприятия и управление промыслом приводят к обеднению, а иногда и к критическому состоянию рыбных ресурсов. Нередки примеры ведения хозяйственной деятельности и промысла в водоемах, где обитают узкоареальные эндемичные формы гольцов, представленные единственной популяцией.
Эти обстоятельства свидетельствуют о высокой практической ценности исследований, расширяющих представления о популяционно-генетической структуре, характере межвидовой и внутривидовой дифференциации, родственных взаимосвязях лососевых рыб рода Salvelinus. Такие исследования являются базовыми для любых прикладных разработок по охране, восстановлению численности, искусственному разведению и оптимальному использованию промысловых ресурсов гольцовых рыб.
Результаты данного исследования были использованы для обоснования рекомендаций природоохранного характера в ходе выполнения работ по проектам Дальневосточного Морского Фонда (МФ ФЭФ РФ «ДМФ») и Государственного Комитета по охране окружающей среды Магаданской области.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на научных сессиях ИБПС ДВО РАН (Магадан, 1997, 1999, 2002); 1-ой Международной научно-практической конференции молодых исследователей (Магадан, 1995); 2-ой и 3-ей научных конференциях аспирантов «Идеи, гипотезы, поиск» (Магадан, 1995, 1996); 3-ей Международной научно-практической конференции «Роль университетов в развитии территорий Северного Форума» (Магадан, 1996); 2-ой Международной научной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1996); 1-ом Всероссийском Конгрессе ихтиологов (Астрахань, 1997); PICES Workshop on the Okhotsk Sea and Adjacent Areas (Canada, 1996); ISACF Workshop "Biology and Evolution of Char of the Northern Hemisphere" (Kamchatka, 1998); Международной научно-практической конференции «Прибрежное рыболовство - XXI век» (Южно-Сахалинск, 2001).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, 1 работа находится в печати.
Структураи объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение), выводов, списка литературы, приложения 1, приложения 2. Работа изложена на 219 страницах машинописного текста, включает 20 рисунков, три из которых в приложении 1, и 35 таблиц, восемь из которых в приложении 2. Список литературы содержит 208 источников, из них 68 публикаций на русском языке.
Некоторые таксономические и филогенетические проблемы гольцов рода Salvelinus
Гольцы рода Salvelinus уже несколько десятилетий изучаются с морфологических, физиологических, экологических и генетических позиций. Столь значительный интерес к вопросам, связанным с происхождением, эволюционными взаимоотношениями, видовым составом, филогенетическими связями между различными популяциями этой группы рыб, можно объяснить ее уникальными особенностями. Гольцы отличаются большим фенотипическим разнообразием, обилием форм, высокой географической изменчивостью на огромном ареале, экологической пластичностью, которая позволила им освоить большинство пресноводных и морских водоемов. Благодаря перечисленным особенностям эти рыбы являются отличным модельным объектом для исследования закономерностей микроэволюции и формообразования, а также, являясь наиболее типичными представителями северных экосистем, могут служить индикаторами их состояния и важнейшим объектом экологического мониторинга (Савваитова, 1989; Глубоковский, 1995).
Гольцы имеют циркумполярное распространение. Южная граница их нерестового ареала проходит по водоемам Британских о-вов, Аппалачских гор, Калифорнии, о-ва Хонсю, п-ова Корея, Баргузинского хребта, Анабарского плоскогорья, плато Путорана, Сибирских увалов, Полярного Урала, Кольского п-ова, Карелии, Скандинавии; северная граница - по рекам и озерам Исландии, Гренландии, островов канадской Арктики, Аляски, Чукотки, Новосибирских о-вов, Таймыра, Новой Земли, Шпицбергена (Глубоковский, 1995).
В систематическом отношении гольцы принадлежат к отряду лососеобразных (Salmoniformes), семейству лососевых (Salmonidae), роду Salvelinus. В зависимости от мест обитания, миграций и нереста, гольцы характеризуются разнообразными типами образа жизни, образуя экологические группировки (формы): проходную, озерно-речную, полупроходную речную, озерную, ручьевую (Черешнев, 1996). В любой из экологических форм могут быть более специализированные группировки, различающиеся по биотопам, срокам нереста, характеру питания и т.п. Между группировками существует различная степень изоляции, а также морфоэкологической и генетической дифференциации (Савваитова, 1989).
Согласно Бергу (Берг, 1948), на территории бывшего СССР и сопредельных стран обитает 12 видов гольцов: арктический голец S. alpinus, палия S. lepechini, ессейская палия S. tolmachoffi, голец черского S. czerskii, боганидская палия S. boganidae, голец Дрягина S. driagini, якутский голец S. jacuticus, мальма S. malma, нейва S. neiva, кунджа S. leucomaenis, чукотский голец S. andriashevi, таймырский голец S. taimyricus.
Позднее из водоемов Дальнего Востока было описано еще 5 видов: голец Таранца S. taranetzi, белый голец S. albus, длинноголовый голец S. kronocius, малоротая палия S. elgyticus, голец Леванидова S. levanidovi (Кагановский, 1955; Глубоковский, 1977; Викторовский, 1978; Викторовский и др., 1981; Черешнев и др., 1989). Глубоковский (Глубоковский, 1995) предложил придать видовую самостоятельность двум внутривидовым формам мальмы -S. malma schmidti и S. malma morpha curilus. В водоемах Европы, кроме арктического гольца, в качестве самостоятельных видов рассматривают S. salvelinus и S. stagnalis (Глубоковский, 1995). В Северной Америке, кроме мальмы и арктического гольца, ранг самостоятельных видов имеют американская палия S. fontinalis, бычья форель S. confluentus, озерная палия S. namaycush (Глубоковский, 1995).
Бенке (Behnke, 1984, 1989) разделяет гольцов на три подрода. Это монотипические Baione и Cristivomer с типовыми видами S. fontinalis (американская палия) и S. namaycush (озерная палия) соответственно, и Salvelinus. Последний включает кунджу S. leucomaenis, S. confluentus, S. alpinus complex и S. malma complex. В пределах группы арктического гольца S. alpinus complex Бенке обозначил три подгруппы. В первую подгруппу входят три подвида, S. a. alpinus и S. a. salvelinus из Европы и S. a. oquassa из восточной части Северной Америки. Во второй обширной и разнообразной подгруппе, названной S. a. erythrinus - формы и популяции из Сибири (taimyricus, neiva, drjagini и др.), а также арктический голец, населяющий территорию восточнее р. Маккензи в Канаде. Третья подгруппа включает гольца Таранца S. a. taranetzi. Группа S. malma complex выглядит, по мнению Бенке, следующим образом. Северная форма мальмы S. m. malma обитает в Америке - на севере Аляски и далее на восток до р. Маккензи в Канаде, а также в Азии - в северной части Охотского моря, на Камчатке и Чукотке. S. т. krascheninnikovi - южная азиатская форма, обнаруженная южнее устья р. Амур до о. Сахалин и о. Хоккайдо. И, наконец, южная североамериканская форма мальмы S. m. lordi распространена к югу от п-ова Аляска вплоть до штата Вашингтон. Савваитова (Савваитова, 1989), указывая на высокую экологическую и морфологическую изменчивость гольцов и размытость границ между отдельными формами, сводит все разнообразие форм к трем морфотипам, альпиноидному, мальмоидному и высокоарктическому, в рамках Salvelinus alpinus complex. При этом подчеркивается, что морфотипы не зависят от таксономической принадлежности, а отражают своеобразие морфологического облика (адаптационного типа), возникшего на основе параллельной изменчивости в сходных экологических условиях. По мнению этого автора, гольцы каждого морфотипа встречаются повсеместно, но преобладают лишь в определенных участках ареала. «Альпиноидный» или «бореальный озерный» морфотип распространен циркумполярно, но преобладает в Европе, преимущественно, в сравнительно неглубоких озерах. «Мальмоидный» или «бореальный речной» морфотип приурочен к бассейну Тихого океана и населяет, главным образом, реки. «Высокоарктический» морфотип известен из Арктического бассейна и некоторых глубоких горных водоемов юга Сибири.
. Дифференциация популяций мальмы и гольца Таранца по данным рестрикционного анализа участка ATPase6/ND4L мтДНК
В данном разделе анализируется рестрикционный полиморфизм сегмента ATPase6/ND4L мтДНК в двух популяциях гольца Таранца и четырех популяциях проходной мальмы из рек бассейнов Берингова и Охотского морей (табл. 1, рис. 2), а также обсуждаются филогенетические взаимоотношения между этими видами. Суммарная выборка изученных гольцовых рыб составляет 132 экземпляра и включает: S. malma из р. Гетлянген (п = 21), р. Марич (п = 19), р. Утаатап (п = 18), р. Яна (n = 24) и S. taranetzi из р. Утаатап (п = 29), озер бассейна р. Выквынайваам (n = 21). Рестрикционный полиморфизм ATPase6/ND4L мтДНК в популяциях мальмы и гольца Таранца.
Результаты амплификации сегмента ДНК, расположенного между участками, гомологичными праймерам Р01 и Р42, и включающего 3 -концевую часть гена ATPase 6, гены СОЗ, TPHK(Gly), ND3, тРНК (Arg), 5 -концевую часть гена ND4L, у мальмы и гольца Таранца показали наличие продукта ПЦР длиной 2162 пн. Размер амплифицированного у гольцов участка мтДНК был определен в сравнении с кетой, у которой размер продукта ПЦР между праймерами Р01 и Р42 установлен ранее (Oohara et al., 1997).
Для четырех ферментов рестрикции (НаеШ, Mspl, Hhal, Mval) в сегменте ATPase6/ND4L мтДНК у 82 особей мальмы из четырех популяций обнаружено от 9 до 12 сайтов рестрикции. Из них 4 сайта были полиморфными. У 29 изученных особей проходного гольца Таранца обнаружено 11-12 сайтов рестрикции, из которых 4 характеризовались полиморфизмом. У 21 особи жилой (озерной) формы гольца Таранца зарегистрировано 11 мономорфных сайтов рестрикции. Исследованный участок мтДНК у мальмы и проходной формы гольца Таранца характеризуется примерно одинаковой степенью полиморфизма (р) на уровне ДНК, которая составляет в среднем 3,5% у мальмы, 4,3% у гольца Таранца.
В таблице 6, а также на рисунке 5 приводятся результаты рестрикционного анализа митохондриального сегмента ATPase6/ND4L у мальмы и гольца Таранца. При использовании фермента Hhal у мальмы и гольца Таранца выявлен только один рестрикционный вариант Hhal-A, общий для двух видов гольцов. Остальные эндонуклеазы показали существование полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК. По три рестрикционных варианта обнаружены в случае НаеШ- и Mval-анализа (А, С, D и А, В, С, соответственно), два варианта (А, В) - в случае Mspl-анализа мтДНК. Различия между наблюдаемыми спектрами рестрикционных фрагментов мтДНК обусловлены появлением или утратой нуклеотидных сайтов узнавания определенной рестриктазои, а варианты рестрикционного полиморфизма связаны между собой преимущественно посредством одномутационных событий.
Так, происхождение вариантов НаеШ-С и НаеІІІ-D связано с вариантом НаеШ-А посредством мутационных событий, определивших утрату двух сайтов рестрикции в случае варианта НаеШ-С (650 + 210 + 210 — 990 пн) и появление дополнительного сайта в случае варианта НаеІІІ-D (210 пн — 170 + 40 пн). Появление варианта Mspl-B связано с точечной мутацией, определяющей исчезновение сайта рестрикции у варианта Mspl-А с образованием более протяженного участка длиной около 700 пн. Варианты Mval-A и Mval-B образуются из Mval-C. Происхождение варианта Mval-A связано с появлением, как минимум, одного дополнительного сайта рестрикции. Рестрикционный вариант Mval-B имеет более сложное происхождение, так как для его появления необходимы два мутационных события - потеря сайта рестрикции, наблюдаемого у варианта Mval-C, и появление нового рестрикционного сайта, характерного для варианта Mval-B Разнообразие рестрикционных типов мтДНК в популяциях мальмы и гольца Таранца.
В таблице 4 и на рисунке 6 представлены данные о распространении типов сегмента ATPase6/ND4L мтДНК, полученные по результатам исследования четырех популяций мальмы и двух популяций гольца Таранца. Всего обнаружено пять митотипов, один из которых АААА оказался общим для всех проанализированных особей мальмы и проходного гольца Таранца. Изученных особей гольца Таранца отличает появление митотипа DBAB, доминирующего в выборке проходной формы S. taranetzi (частота встречаемости 79.3%) и единственного в выборке жилой (озерной) формы гольца Таранца (частота 100%).
Максимальное количество типов мтДНК зафиксировано в выборке мальмы из р. Яна (бассейн Охотского моря) - АААА, АААС, СВАС (частота 87.0%, 8.7%, 4.3%, соответственно). Два типа исследованного участка мтДНК - АААА и АВАА (с частотами 91.7% и 8.3%, соответственно), обнаружены в выборке мальмы из р. Утаатап (Чукотский п-ов). Выборки S. malma из двух других рек Чукотского полуострова (р. Гетлянген и р. Марич) характеризуются единственным митотипом АААА, который является общим и преобладающим во всех проанализированных выборках мальмы. Митотипы АВАА, АААС и СВАС характерны для популяций мальмы из р. Утаатап (АВАА) и р. Яна (АААС и СВАС) и относятся к редким типам мтДНК, так как обнаружены с низкой частотой.
Сравнительный рестрикционный анализ мтДНК в популяциях озерного гольца
Несмотря на то, что систематическое положение, филогенетические связи, популяционная структура гольцов рода Salvelinus находятся в центре внимания исследователей не одно десятилетие, в некоторых областях своего ареала они остаются практически не изученными. В частности, это относится к озерным гольцам Дальнего Востока России. На северном побережье Охотского моря известны изолированные озерные популяции гольцовых рыб с неясной таксономической принадлежностью. Населяют они различного типа озера, расположенные в верховьях рек. Такой голец из озер бассейна р. Охота был описан Таранцом как самостоятельный вид - нейва S. neiva (Таранец, 1933). По данным Черешнева (1996) этот голец является локальным эндемиком, тогда как озера бассейнов рек Ола и Яма (Охотоморье) предположительно населяет другой вид - S. alpinus (Черешнев, 1996). По мнению Глубоковского (1995) и Черешнева (1996), оба вида принадлежат к арктической филогенетической группе рода Salvelinus. К арктической группе относят также популяции озерных гольцов, обитающие в бассейне Северного Ледовитого океана: боганидскую палию и гольца Дрягина (оз. Лама, п-ов Таймыр), восточно-сибирского гольца, гольца Черского и арктического гольца (Колымо-Индигирский регион) (Глубоковский, 1995; Черешнев, 1996). Большой интерес представляют генетические исследования гольцов древнего озера Эльгыгытгын (бассейн р. Анадырь, Чукотка), т.к. эта группа лососевых рыб является ярким примером неравномерности темпов эволюции морфологических, кариологических, биохимических признаков (Глубоковский и др., 1993). Сообщество гольцовых рыб озера представлено уникальными видами: редкой на Северо-Востоке боганидской палией (впервые описана из оз. Боганидское, Восточная Сибирь) и двумя локальными эндемиками - малоротой и длинноперой палиями (Викторовский и др., 1981; Черешнев, Скопец, 1990, 1993).
В данном разделе приводятся результаты сравнительного анализа изменчивости мтДНК в популяциях озерных гольцов Дальнего Востока и Сибири. Материал по озерным гольцам собран в водоемах северного побережья Охотского моря (озера бассейнов рек Ола - 32 экз., Яма - 21 экз., Охота - 15 экз. нейвы), континентальных районов Магаданской области (озера в верховьях р. Колыма - 28 экз.), Чукотки (22 экз. боганидской палии и 13 экз. малоротой палии, оз. Эльгыгытгын). Для оценки степени генетического сходства использованы собственные данные по изменчивости мтДНК других гольцов: мальмы (n = 12, р. Ола, бассейн Охотского моря), жилой формы гольца Таранца (п = 21, озера бассейна р. Выквынайваам, Чукотский п-ов), боганидской палии, гольца Дрягина, глубоководного гольца «пучеглазки» (по 1 экз., оз. Лама, п-ов Таймыр), даватчана (n = 2, оз. Фролиха, Забайкалье), а также типичного S. alpinus (п = 5, Финляндия) (табл. 1, рис. 2). Суммарная выборка изученных гольцовых рыб составляет 174 экземпляра. Изменчивость мтДНК исследована с помощью анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов участка ATPase6/ND4L, имеющего длину 2162 пн и включающего шесть генов.
Рестрикционный полиморфизм участка ATPase6/ND4L мтДНК в популяциях озерных гольцов, мальмы и гольца Таранца.
Результаты амплификации сегмента мтДНК, расположенного между участками, гомологичными праймерам Р01 и Р42, и включающего 3 -концевую часть гена ATPase 6, гены СОЗ, TPHK(Gly), ND3, тРНК (Arg), 5 -концевую часть гена ND4L, у озерных гольцов, мальмы и гольца Таранца показали наличие продукта ПЦР длиной 2162 пн.
С использованием набора из двенадцати ферментов рестрикции (НаеШ, Mspl, Hhal, Mval, Alul, Mbol, Rsal, Hinfl, Cfrl3I, Bsh 12361, Bgll, Sspl) в сегменте ATPase6/ND4L мтДНК у исследованных гольцов из 14 популяций обнаружено от 26 до 31 сайта рестрикции, из которых 10 были полиморфными. Для рестриктаз НаеШ, Mspl, Mval, Alul, Cfrl3I характерен полиморфизм рестрикционных фрагментов ДНК. В случае Mspl- и Mval-анализа обнаружены по три рестрикционных варианта, в случае НаеШ-, Alul-и Сп-ІЗІ-анализа - два варианта расщепления мтДНК (табл. 12).
Различия в длине рестрикционных фрагментов ДНК определяются появлением или исчезновением нуклеотидных сайтов узнавания для конкретной эндонуклеазы, а варианты рестрикционного полиморфизма связаны друг с другом, главным образом, посредством одномутационных
Изменчивость нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b мтДНК гольцов рода Salvelinus
В продолжение поиска наиболее информативных молекулярно-генетических подходов, позволяющих проводить тонкую дифференциацию типов мтДНК гольцовых рыб и их более точный филогенетический анализ, был привлечен высокоразрешающий метод определения нуклеотидных последовательностей ДНК.
В этом разделе приводятся данные об изменчивости нуклеотидных последовательностей трех участков гена цитохрома b митохондриального генома 52 представителей рода Salvelinus, с уже известными рестрикционными типами мтДНК (за исключением 4 экземпляров гольца Леванидова; табл. 15).
Первый из исследованных участков длиной 307 пн расположен между позициями 14845 пн и 15149 пн мтДНК, второй, размером 405 пн, находится в пределах 15152-15556 пн (рис. 11). Оба они входят в состав третьего участка, имеющего длину 1050 пн, расположенного между позициями 14795 пн и 15844 пн и представляющего практически полную последовательность гена цитохрома b (длина 1100-1200 пн) позиций соответствует последовательности гена цитохрома b млекопитающих (Irwin etal., 1991)
Нуклеотидная последовательность участка 1050 пн гена цитохрома b мтДНК S. alpinus, представленная в виде компьютерной записи результатов сканирования секвенирующего геля, показана на рис. 1 приложения 1. Рис. 2 (приложение 1) демонстрирует полную нуклеотидную последовательность участка 1050 пн гена цитохрома b мтДНК арктического гольца S. alpinus. Вариабельные нуклеотидные позиции участков 307 пн, 405 пн, 1050 пн гена цитохрома b мтДНК гольцов приведены на рис. З а, б, в (приложение 1). Нумерация позиций соответствует последовательности гена цитохрома b млекопитающих, приведенной в работе Ирвина и др. (Irwin et al., 1991).
Сравнительная характеристика исследованных участков гена цитохрома Ъ мтДНК гольцов.
Согласно анализу трех участков гена цитохрома Ь, нуклеотидный состав, распределение вариабельных позиций, типы мутационных изменений были следующими. Изученные сегменты гена цитохрома b мтДНК почти не отличались по составу оснований (табл. 1-3 приложения 2, рис. 12).
Так как многие различия в третьих кодоновых позициях отражают молчащие нуклеотидные замены, различия состава оснований именно в этих позициях должны быть наиболее заметны, что отмечено для гена цитохрома b мтДНК млекопитающих (Irwin et al., 1991), птиц (Kornegay et al., 1993), рыб (Meyer, 1993; Кирильчик, Слободянюк, 1997). Действительно, нуклеотидный состав гена цитохрома b гольцов в третьем положении кодонов значительно смещен и характеризуется низким содержанием гуанина (от 5.1% до 6.0% для разных участков), и высоким содержанием цитозина (37.0-43.7%). Вторые кодоновые позиции гена цитохрома b богаты тимином (37.0-41.2%), первые позиции практически не имеют смещения. Наибольшее значение смещения (0.266-0.332) характерно для третьего положения, а наименьшее (0.035-0.095) - для первого положения кодона. Как предполагают Ирвин с сотрудниками (Irwin et al., 1991), смещенный нуклеотидный состав в большинстве консервативных позиций, в частности, во вторых позициях кодонов, может быть одной из причин возможного ограничения разрешающей способности гена цитохрома b в филогенетическом анализе. Судя по нашим данным, смещение состава оснований во второй позиции кодонов относительно высокое (табл. 1-3, приложение 2). Оно составляет в среднем 0.221 по шкале, где 0 означает отсутствие смещения, а 1.0 отражает полностью смещенную последовательность, имеющую только один тип основания. Значение стандартного отклонения показывает степень межвидовой изменчивости состава нуклеотидов. Как и ожидалось, вторые позиции кодонов продемонстрировали минимальную межвидовую вариабельность (величина среднего стандартного отклонения для разных участков колебалась от 0 до 0.34), третьи позиции - максимальную изменчивость состава нуклеотидов (0.67-1.28) гена цитохрома b митохондриального генома гольцовых рыб.
Судя по полученным данным (табл. 16; рис. 13), во фрагменте 307 пн гена цитохрома b мтДНК гольцов выявлено 29 вариабельных нуклеотидных позиций, из которых 27 позиций оказались филогенетически информативны (наблюдались в двух и более последовательностях). Примыкающий к первому второй участок длиной 405 пн обнаружил 59 полиморфных позиций, из которых были филогенетически значимыми. В самом протяженном сегменте гена цитохрома b длиной 1050 пн, включающем первый и второй участки, зарегистрировано 114 изменчивых сайтов, из которых 81 сайт имеет филогенетическую значимость. Как и ожидалось, во всех исследованных участках подавляющее большинство вариабельных нуклеотидных сайтов локализовалось в третьем положении кодонов (27, 48 и 100 вариабельных позиций в первом, втором и третьем участках, соответственно). Самое низкое число полиморфных сайтов наблюдалось во втором, наиболее функционально значимом, положении кодона: четыре сайта в участке 15152-15556 пн, шесть -в участке 14795-15844 пн, и ни одного - в коротком участке 14845-15149 пн.
Между последовательностями гена цитохрома b мтДНК гольцов выявлено: 30 нуклеотидных различий в сегменте 14845-15149 пн, 63 мутации в участке 15152-15556 пн, 119 замен в сегменте 14795-15844 пн (табл. 16; рис. 13). Исследованный митохондриальный ген характеризуется значительным накоплением мутаций в третьих положениях кодонов (в среднем для трех участков - 88.1%), которые, как правило, являются молчащими. Замены нуклеотидов, возникающие в первых и вторых позициях кодонов, немногочисленны (в среднем 8.2% и 3.8%, соответственно), так как именно они могут повлиять на функционирование цитохрома b и окислительно-восстановительной системы митохондрии в целом.
