Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Население Республики Башкортостан. Краткое описание этногенеза башкир 17
1.2. Демографические, генетико-биохимические и молекулярно-генетические исследования популяций башкир в ряду народов Волго-Уральского региона 20
1.3. Болезни динамических мутаций 30
1.3.1. Миотоническая дистрофия 34
1.3.2. Хорея Гентингтона
1.4. Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна-Беккера 47
1.5. Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН)
1.5.1. Клиническая характериститка и классификация НМСН 54
1.5.2. Молекулярно-генетические основы НМСН 58
1.6. Болезнь Паркинсона 67
1.6.1. Исследования эпидемиологии, этиологии и патогенеза болезни Паркинсона 67
1.6.2. Молекулярно-генетические исследования болезни Паркинсона...75
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Объект исследования 87
2.2. Методы исследования
2.2.1. Методы анализа брачно-миграционной структуры населения...92
2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования 93
2.2.3. Статистическая обработка результатов исследований 101 Стр.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Исследование факторов популяционнои динамики, влияющих на распространенность наследственных заболеваний в республике Башкортостан 105
З.І.І.Анализ брачно-миграционной структуры 106
3.1.1.1. Анализ этнической брачной ассортативности и ее временной динамики 107
3.1.1.2. Анализ эндогамии и изоляции расстоянием 114
3.1.1.3. Инбридинг 118
3.2. Распространенность и молекулярно-генетические основы моногенных неврологических заболеваний в республике Башкортостан 123
3.2.1. Миотоническая дистрофия 124
3.2.1.1. Анализ распространенности миотонической дистрофии в семи районах Республики Башкортостан 124
3.2.1.2. Исследование экспансии (CTG)n повторов в гене DMPK и анализ гаплотипов на мутантных хромосомах у больных миотонической дистрофией из Республики Башкортостан 126
3.2.1.3. Анализ полиморфизма (CTG)n повторов в гене DMPK в популяциях Волго-Уральского региона 137
3.2.2. Хорея Гентингтона 146
3.2.2.Распространенность хореи Гентингтона в Республике Башкортостан 146
3.2.2.2. Анализ полиморфизма локусов (CAG)n-, (CCG)n- повторов и нейтральной делеции del2642 гена HD (IT15) в популяциях Волго-Уральского региона и у больных хореей Гентингтона из Башкортостана 149
3.2.3. Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна-Беккера (МДД/МДБ) 173
3.2.3.1 Распространенность мышечной дистрофии Дюшенна в Республике Башкортостан 173
3.2.3.2. Анализ частоты и спектра крупных делеций гена DMD
у больных МДД/МДБ из Республики Башкортостан 175
3.2.3.3. Поиск точковых мутаций в гене DMD 182
3.2.3.4. ДНК-диагностика гетерозиготного носительства делеций гена DMD 187
3.2.4. Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН) 191
3.2.4.1. Распространенность НМСН в Республике Башкортостан 191
3.2.4.2. Молекулярно-генетическое исследование НМСН
в Республике Башкортостан 196
3.2.5. Болезнь Паркинсона 210
3.2.5.1.Распространенность болезни Паркинсона
в Республике Башкортостан 210
3.2.5.2.Молекулярно-генетическое исследование болезни Паркинсона 3.2.5.2.1.Анализ генов а-синуклеина (PARK1), паркина {PARK2) и LRRK2 (PARK8) у пациентов с болезнью Паркинсона 213
3.2.5.2.2.Анализ ассоциации болезни Паркинсона с полиморфными вариантами генов - кандидатов ядерного генома 221
3.2.5.2.3.Исследование роли митохондриальной ДНК в развитии болезни Паркинсона 250
Заключение 263
Выводы 284
Список литературы
- Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна-Беккера
- Молекулярно-генетические методы исследования
- Анализ этнической брачной ассортативности и ее временной динамики
- Анализ полиморфизма локусов (CAG)n-, (CCG)n- повторов и нейтральной делеции del2642 гена HD (IT15) в популяциях Волго-Уральского региона и у больных хореей Гентингтона из Башкортостана
Введение к работе
Актуальность проблемы Изучение молекулярно-генетической природы наследственных и наследственно предрасположенных заболеваний является основой для познания их патогенеза, разработки высокоточных методов ДНК-диагностики, методов профилактики и лечения. В структуре моногенных заболеваний (МЗ) значительную часть составляют наследственные болезни нервной системы (НБНС), более для 300 из которых полностью расшифрованы молекулярные дефекты или установлена хромосомная локализация мутантных генов. Большинство НБНС носит тяжелый прогрессирующий характер, часто приводит к ранней инвалидизации, а иногда и смерти больного, но эффективное лечение в настоящее время возможно лишь для некоторых из этих заболеваний. Поэтому разработка наиболее эффективных методов медико-генетического консультирования (МГК), включающих ДНК-диагностику, в том числе пренатальную и пресимптоматическую, направленная на профилактику МЗ, имеет большое социально-экономическое значение.
Многие НБНС являются клинически и генетически гетерогенными, что значительно затрудняет их дифференциальную диагностику и, соответственно, медико-генетическое консультирование. Для большинства МЗ существуют популяционные различия, как по распространенности, так и по спектру и частоте мутаций в генах, детерминирующих их развитие. Поэтому для обеспечения наиболее эффективного МГК необходимо изучение распространенности и молекулярно-генетических основ наследственных заболеваний (НЗ) в отдельных регионах и этнических группах. Причины распространения в регионе тех или иных НЗ могут быть связаны как со структурными особенностями ответственных генов, так и с генетической структурой популяций, формирование которых происходит под воздействием различных факторов микроэволюции, среди которых в настоящее время наиболее значимыми могут являться дрейф генов и миграции. Изучение процессов изоляции и миграции возможно на основе анализа брачно-миграционной структуры популяций [Гинтер Е.К., Зинченко Р.А., 2006].
Актуальность популяционно-генетического исследования моногенной патологии, в частности, НБНС, в Республике Башкортостан (РБ) определялась значительным своеобразием генофонда ее населения, формирование которого имеет длительную и сложную историю. Территория Южного Урала, где располагается РБ, как и всего Волго-Уральского региона, находясь на границе двух частей света - Европы и Азии, - с древнейших времен была ареной постоянных генетических контактов между сибирскими, индоевропейскими, среднеазиатскими и другими этническими образованиями. Сегодня РБ имеет многонациональный состав населения с общей с численностью 4104336 человек. Коренное население республики – башкиры, численность которых, по данным переписи 2002г., составляет 1.2 млн. человек (29.8%); наиболее многочисленными представителями других национальностей являются русские (36.3%) и татары (24.1 %). На основании полученных нами ранее данных по изучению полиморфизма ядерной и митохондриальной ДНК в популяциях Волго-Уральского региона, в том числе в четырех этногеографических группах башкир, было установлено своеобразие генетической структуры народов этого региона, определен вклад европеоидного и монголоидного компонентов в их генофонд и показана их генетическая подразделенность [Хуснутдинова Э.К., Хидиятова И.М., Викторова Т.В. и др., 1991, 1993, 1994, 1998, 1999]. Эти и многие другие исследования по изучению разнообразия генома человека в популяциях, проведенные в рамках международных и национальных программ «Геном человека» в 90-х годах ХХ столетия, послужили основой для разработки нового направления в молекулярной генетике человека – этногеномики, - и определили основные перспективы его развития, среди которых важнейшее место занимает исследование молекулярной структуры наследственной патологии в различных популяциях.
Частыми наследственными заболеваниями условно принято считать такие, распространенность которых составляет > 1: 50000 населения [Гинтер Е.К., Зинченко Р.А., 2006]. К ним относятся такие НБНС, как миотоническая дистрофия, хорея Гентингтона, миодистрофия Дюшенна/Беккера, моторно-сенсорные нейропатии, неравномерная распространенность которых в РБ была показана еще в 80-х годах проф. Магжановым Р.В. и сотрудниками кафедры неврологии БГМУ. С развитием методов молекулярной генетики появилась возможность изучения молекулярных основ этих заболеваний, выявления популяционного разнообразия их генетических форм и генетических механизмов распространения в популяциях.
Особый интерес для современной медицинской генетики представляют популяционные и молекулярно-генетические исследования болезни Паркинсона (БП) - одного из наиболее частых заболеваний нервной системы, чаще всего имеющего многофакторную природу со значительным вкладом генетического компонента. Актуальность этих исследований определяется нерешенностью проблемы генетической основы патогенеза БП, существованием многочисленных моногенных форм заболевания, отсутствием информации о распространенности семейных и спорадических форм заболеваний в различных регионах и этнических группах.
В целом, выявление этно-территориальных особенностей распространенности и генетической природы наследственных и наследственно предрасположенных заболеваний является основой для создания эффективной системы их мониторинга и разработки методов диагностики и профилактики, оптимальных для конкретного региона.
Цель и задачи исследования
Целью работы является изучение молекулярно-генетических основ, популяционно-демографических и генетических механизмов распространения ряда частых наследственных заболеваний нервной системы в Республике Башкортостан и разработка оптимальных для региона подходов их ДНК-диагностики.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Провести анализ брачно-миграционной структуры в шести районах РБ и охарактеризовать основные демографические факторы формирования генетической структуры населения республики.
-
Изучить распространенность и популяционно-генетические факторы распространения в РБ частых НБНС – миотонической дистрофии, хореи Гентингтона, моторно-сенсорных нейропатий, семейных и спорадических форм болезни Паркинсона.
-
В генах DMPK и HD (IT-15), ответственных за развитие болезней «экспансии» - миотонической дистрофии Россолимо-Куршмана-Штейнерта-Баттена и хореи Гентингтона, соответственно, - исследовать полиморфизм числа тринуклеотидных повторов (ТНП) и ряда вариабельных внутригенных локусов у больных из РБ и в популяциях Волго-Уральского региона; определить закономерности экспансии ТНП, ее происхождение и механизмы распространения.
-
Определить характерные для РБ спектры и частоты мутаций в генах НБНС: при мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера – в гене дистрофина (DMD), при моторно-сенсорных нейропатиях – в генах периферического белка миелина (PMP22), структурного белка миелина (MPZ), коннексина 32 (GJB1), EGR2 (early growth response gene-2); провести анализ полиморфизма ряда вариабельных локусов исследованных генов.
-
Провести поиск мутаций в генах -синуклеина (PARK1), паркина (PARK2) и дардарина (LRRK2) у больных с наследственными и спорадическими формами болезни Паркинсона.
-
Провести поиск маркеров генетической предрасположенности к спорадической форме болезни Паркинсона на основе анализа ассоциации заболевания с полиморфными вариантами генов ядерного генома и исследования структурных особенностей митохондриальной ДНК.
-
Разработать оптимальные для РБ подходы ДНК- диагностики исследованных неврологических заболеваний.
Научная новизна и практическая значимость исследования
Впервые проведено комплексное популяционно-молекулярно-генетическое исследование ряда частых наследственных заболеваний нервной системы (миотонической дистрофии, хореи Гентингтона, мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, наследственных моторно-сенсорных нейропатий) и многофакторного, наследственно предрасположенного заболевания - болезни Паркинсона в РБ, население которой характеризуется этнической подразделенностью. Использование такого подхода позволило получить наиболее адекватные оценки распространенности заболеваний, выявить популяционно-демографические факторы формирования генетической структуры популяций, влияющие на распространение наследственной патологии, и провести углубленный анализ молекулярно-генетических основ исследуемых заболеваний.
Впервые проведенный анализ брачно-миграционной структуры населения шести районов РБ выявил преобладание в них моноэтнических браков, положительную этническую брачную ассортативность башкир и татар, и высокий уровень эндогамности, что способствует территориальной и этнической неравномерности распространения наследственной патологии.
Молекулярно-генетическое исследование болезней динамических мутаций – миотонической дистрофии и хореи Гентингтона, - позволило идентифицировать экспансию тринуклеотидных повторов в соответствующих генах практически у всех обследованных пациентов и во многих случаях выявить ее у родственников больных, не имеющих на момент обследования клинических признаков заболеваний. Впервые у больных из РБ определены гаплотипы, сцепленные с мутациями – экспансией тринуклеотидных повторов, - в генах DMPK и HD, что позволило установить единое происхождение миотонической дистрофии на территории РБ, ее распространение в результате эффекта основателя и дрейфа генов, и, как минимум, три источника происхождения хореи Гентингтона. Выявлены генетические факторы нестабильности тринуклеотидных повторов: в гене DMPK нестабильными являются аллели с числом CTG повторов >19; в гене HD установлена роль числа (CCG)n повторов как цис-активного фактора, модифицирующего стабильность (CAG)n повторов. Впервые определены генетические и эпигенетические факторы, модифицирующие возраст манифестации хореи Гентингтона.
У больных миодистрофией Дюшенна/Беккера из РБ впервые определены спектр и частота делеций в гене дистрофина, выявлены две новые мутации - p.Thr134ThrfsX7 и p.Lys2210ArgfsX11.
Впервые для РБ установлены региональные и этнические особенности распространенности наследственных моторно-сенсорных нейропатий, спектра и частоты мутаций в генах периферического белка миелина (PMP22), структурного белка миелина (MPZ), коннексина 32 (GJB1) и EGR2 (early growth response gene-2). Определен вклад типов НМСН 1А и НМСН 1Х в структуру НМСН в исследуемом регионе. Установлена высокая частота НМСН 1Х типа среди башкир, обусловленная мутацией p.Pro87Ala, распространившейся в популяции в результате эффекта основателя. В гене GJB1 выявлена ранее не описанная мутация p.Thr86Ile.
Впервые получены данные по распространенности болезни Паркинсона в РБ, показана этническая и территориальная неравномерность распространения заболевания. Проведено изучение генетических факторов риска развития БП с учетом этнической принадлежности. Впервые в качестве гена-кандидата исследован Alu-инсерционный полиморфизм гена калиевого канала KCNJ6 и обнаружена ассоциация Alu-инсерции с БП во всех исследованных этнических группах. Выявлена ассоциация с БП полиморфного варианта гена катехол-орто-метилтрансферазы, детерминирующего активную форму фермента. Впервые проведено углубленное исследование роли мтДНК в развитии БП, в результате которого обнаружена ассоциация гаплогруппы Н мтДНК с БП у татар, выявлен гаплотип, протективный для развития заболевания. Впервые проведено полное секвенирование мтДНК у 4-х пациентов с БП, у двух из них обнаружены две точковые мутации, которые, предположительно, могут являться факторами развития заболевания у этих больных.
На основе полученных результатов разработаны оптимальные для населения РБ подходы ДНК-диагностики исследованных заболеваний. Выявление этиологической основы заболевания у больных, а также носителей мутантного гена способствует проведению ранних лечебно-профилактических мероприятий, позволяющих отсрочить клиническую манифестацию заболевания или замедлить темпы его прогрессирования. Кроме того, оно является необходимым условием для проведения пренатальной диагностики с целью профилактики повторных случаев заболевания в семьях. Полученные данные легли в основу созданных в РБ национальных автоматизированных регистров по всем исследованным заболеваниям, обеспечивающих их эпидемиологический мониторинг и оптимизацию лечебно-диагностической и диспансерной работы врачей (неврологов, генетиков).
Положения, выносимые на защиту
-
Этническая подразделенность населения, преобладание моноэтнических браков и высокий уровень эндогамности в районах РБ способствуют сохранению имеющегося генетического разнообразия, территориальной и этнической неравномерности распространения наследственной патологии.
-
Распространение миотонической дистрофии Россолимо-Куршмана-Штейнерта-Баттена в РБ связано с эффектом основателя и дрейфом генов. Локальное накопление заболевания среди башкир в отдельных районах Зауралья обусловлено доминантным типом его наследования, моноэтнической структурой населения и высоким уровнем эндогамности этих районов. В локусе (CTG)n гена DMPK нестабильными являются аллели с числом тринуклеотидных повторов >19.
-
Распространенность хореи Гентингтона в Башкортостане сопоставима с таковой в европейских популяциях. Распространение ХГ на территории республики связано, как минимум, с тремя источниками происхождения заболевания, о чем свидетельствуют три различных гаплотипа в гене HD на мутантных хромосомах у больных из РБ. (CCG)n –тракт, сцепленный с (CAG)n повторами в гене HD, является цис - активным фактором, модифицирующим стабильность (CAG)n -повторов. Генетические и эпигенетические факторы, влияющие на возраст манифестации ХГ.
-
Высокий уровень гетерозиготности локусов (CTG)n гена DMPK и (CAG)n гена HD, неоднородный характер распределения частот их аллелей в популяциях Волго-Уральского региона, в том числе на уровне этногеографических групп одного этноса, свидетельствуют о возможности использования данных высокополиморфных ДНК - локусов в качестве генетических маркеров популяций.
-
Спектр и частота делеций и делеционных точек разрыва в гене дистрофина (DMD), две новые точковые мутации у больных мышечной дистрофией Дюшенна/Беккера из РБ.
-
Неравномерное территориально-этническое распространение наследственных моторно-сенсорных нейропатий (НМСН) в РБ. Региональные и этнические особенности спектра и частоты мутаций в генах периферического белка миелина (PMP22), структурного белка миелина (MPZ), коннексина 32 (GJB1) и EGR2 (early growth response gene-2). Вклад типов НМСН 1А и НМСН 1Х в структуру НМСН в РБ. Среди башкир наиболее частой формой НМСН 1 типа является НМСН 1Х, обусловленная мутацией p.Pro87Ala, распространившейся в популяции в результате эффекта основателя. Новая мутация p.Thr86Ile в гене GJB1.
-
Неравномерное территориально-этническое распределение болезни Паркинсона в РБ с эпидемиологическими характеристиками, сопоставимыми с современными показателями в мире. Ассоциация спорадической формы БП с мутациями в генах паркина (PARK2) и дардарина (LRRK2, PARK8), а также с полиморфными вариантами ряда генов-кандидатов ядерного и митохондриального геномов. Генетические факторы риска развития и характера течения спорадической БП в этнически подразделенных группах населения РБ.
-
Разработка оптимальных для региона подходов ДНК-диагностики исследованных заболеваний.
Апробация работы
Материалы исследования докладывались и обсуждались на Российских и международных совещаниях, конференциях и симпозиумах, таких как II (IV) и V съезд Российского общества медицинских генетиков (Курск, 2000; Уфа, 2005); II и III съезд Российского общества генетиков и селекционенров им. Вавилова (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2004); 19-е Международное совещание по болезни Гентингтона (Копенгаген, 2001); 5-й и 7-й Балканский конгресс по генетике человека (София, 2002; Скопье, 2006); конференции Европейского общества генетиков человека (Лиссабон, 1998; Женева, 1999; Амстердам, 2000; Страсбург, 2002; Мюнхен, 2004; Прага, 2005; Амстердам, 2006; Ницца, 2007; Барселона, 2008); Международный конгресс по геному человека (Эдинбург, 2001; Берлин, 2004; Монреаль, 2007); IХ Всероссийском съезде неврологов (Ярославль, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики и лечения наследственных нервно-мышечных заболеваний. Нейроортопедические аспекты» (Москва, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 39 статей в рецензируемых научных журналах, получен 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертации
Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна-Беккера
Исследования мтДНК показали, что митохондриальный геном народов Волго-Уральского региона характеризуется наличием гаплогрупп, специфичных как для европейцев (преобладающее число), так и для азиатских популяций. Наиболее высокая частота азиатских гаплогрупп оказалась характерной для тайнинских (66.9%) и зауральских (46.2%) башкир. Было сделано убедительное предположение, что одним из существенных факторов популяционной динамики зауральских башкир, тайнинских башкир и удмуртов является дрейф генов [Викторова, 2002].
В целом было показано, что новая молекулярно-генетическая информация о Волго-Уральском регионе, занимающем промежуточное положение как в географическом, так и в антропологическом отношении, находится в соответствии с историко-этнографическими данными о происхождении и историческом взаимодействии изученных народов и с данными по биохимическим маркерам генов.
Анализ разнообразия генома на уровне этносов и популяций является не только основой для решения популяционно-генетических задач, но и приобретает первостепенное значение для изучения молекулярной эпидемиологии наследственных болезней. Одним из способов практической реализации этих исследований является идентификация генетических локусов при гетерогенных наследственных заболеваниях, изучение молекулярно-генетической природы мутаций в генах наследственных заболеваний и разработка на основе полученных результатов эффективных мероприятий по профилактике наследственной патологии в конкретном регионе [Баранов с соавт., 2000; Горбунова, Савельева-Васильева, Красильников, 2000; Гинтер, 2002].
Другим, параллельным направлением популяционной и медицинской генетики человека является изучение структурных особенностей генома, предрасполагающих к развитию различных многофакторных заболеваний. ГТопуляционный анализ полиморфизма генов-кандидатов позволяет оценить их вклад в этиопатогенез таких заболеваний и выявлять факторы риска заболеваемости и смертности населения, а также разрабатывать профилактические мероприятия с учетом этнической принадлежности.
В Республике Башкортостан, с учетом этнической принадлежности, проведено молекулярно-генетическое изучение ряда наследственных заболеваний. В результате этих исследований в генах муковисцидоза [Корытина с соавт., 2003], фенилкетонурии [Ахметова с соавт., 2003], болезни Вильсона-Коновалова [Карунас с соавт., 2000], нейросенсорной несиндромальной тугоухости/глухоты [Хидиятова с соавт. 2002, 2005; Dzhemileva et al., 2002] , определены спектр и частота мутаций, выявлены ассоциированные с мутациями аллели и гаплотипы сцепленных с генами полиморфных ДНК-локусов. Для всех этих заболеваний выявлены мутации, не описанные ранее в литературе, и определено их происхождение. По спектру и частоте выявленных мутаций установлены достоверные статистические различия между различными этническими группами. Установлены определенные закономерности гено-фенотипической корреляции. На основании полученных данных для ряда популяций Волго-Уральского региона разработаны и успешно применяются алгоритмы ДНК-диагностики перечисленных моногенных заболеваний.
Для оценки и прогнозирования величины и структуры генетического груза в популяциях важным является не только изучение распространенности в них наследственных заболеваний, но и выявление определяющих ее механизмов, неразрывно связанных с самой генетической структурой популяции и действующими в ней эволюционными факторами. Первое теоретическое доказательство влияния генетической структуры популяций на распространенность в них наследственных болезней было сделано более 60-и лет назад С. Валундом, который впервые ввел понятие «изолят» и рассмотрел генетические последствия изолированности популяции, которые должны приводить к увеличению в ней числа гомозигот и, если эта гомозиготность касается рецессивных генов наследственных болезней, - к увеличению в популяции числа больных с рецессивными заболеваниями. В дальнейшем исследование генетических изолятов позволило во многих случаях выявить прежде неизвестные наследственные болезни, описать их клиническую вариабельность, картировать гены наследственных болезней и решить другие проблемы медицинской генетики. Однако большая часть человечества живет не в изолятах, а составляет существенно менее изолированные популяции. При этом возникает естественный вопрос о том, какую генетическую структуру имеют подобные популяции и влияет ли она на редкие гены наследственных болезней, их распространение, накопление и т.д. [цит. по Гинтеру Е.К., 2002].
Генетическая структура (частота генов и генотипов) и адаптация популяций к определенным условиям среды и к их изменениям, распространение тех или иных моногенных или многофакторных заболеваний в значительной степени зависят и от социальных, демографических процессов. Одной из наиболее важных демографических характеристик, определяющих частоту генов в популяции, является структура браков, характеризующая возрастной и национальный состав, уровень и направление миграций, и определяющая такие важные для популяции параметры, как эндогамность и инбридинг. Анализ брачно-миграционной характеристики позволяет установить границы популяции, то есть, в первом приближении, оценить, что собой представляет элементарная популяция в регионе, где и развертываются микроэволюционные процессы, приводящие к изменению в ней частот генов, а также давление миграций на элементарную популяцию. С точки зрения медицинской генетики установление границ популяции означает, что одновременно устанавливаются границы, в рамках которых скорее всего будет происходить перемещение генов, вызывающих наследственные болезни, так как именно в этих границах заключается
Молекулярно-генетические методы исследования
После проведения ПЦР 10 мкл амплификата смешивали с 3.3 мкл 0.5 М NaOH и 0.3 мкл 0.5М ЭДТА и нагревали в течение 15 минут при 42С. После этого к пробам добавляли 3 мкл формамида, смешанного с 0.5% бромфенолового синего и 0.5%) ксиленцианола, и наносили на 10% полиакриламидный гель (исходное соотношение акриламида/метиленбисакриламида 29:1) с 5% глицерином. В качестве электрофорезного буфера использовали 0.5хТВЕ. Электрофорез в геле, длиной 20 см, толщиной 1 мм проходил при комнатной температуре при напряжении 100В в течение 20-30 часов. Окраску геля проводили в течение 15 минут азотнокислым серебром. Далее гель промывали дистиллированной водой и опускали в раствор, содержащий 40%) формалин и NaOH. После проявления гель промывали дистиллированной водой. Секвенирование
Подготовка матриц для секвенирования включала очистку ПЦР продуктов от избытка праймеров, димеров праймеров и дезоксирибонуклеотидов (dNTP). Очистку осуществляли путем элюции ДНК из агарозных гелей с последующим использованием набора реагентов DIAtom,mDNA Elution по методике, описанной в инструкции.
Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism, модель 310 (Applied Biosystems) с использованием набора для флюоресцентного мечения DYEnamic1MET, согласно протоколу фирмы производителя [Amersham Pharmacia Biotech DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit].
Исследование гена DMPK Молекулярно-генетическое исследование миотонической дистрофии включало анализ числа (CTG)n повторов в гене DMPK у больных МД и здоровых индивидуумов, а также определение гаплотипов у больных по полиморфным рестрикционным локусам Hha\(mtron 5, nt pos 6043) и ЯшЩіпггоп 9, nt posl0693).
Определение нормального числа (CTG)n повторов в гене DMPK первоначально проводили методом ПЦР с Р меченым праймером [Zerylnick et al., 1995]. Результаты амплификации оценивали в секвенирующем полиакриламидном геле с последующим получением радиавтографа (рис.№). Определение размера экспансии триплетных повторов у больных миотонической дистрофией проводили с использованием геномной блот-гибридизации с олигонуклеотидным зондом (CTG)9 по методу Саузерна [Southern, 1975]. С использованием данных методов исследование было проведено на базе Института молекулярной генетики РАН (г.Москва). Позднее нами были оптимизированы условия для определения нормального числа CTG-повторов методом ПЦР и последующего электрофореза в 8% ПААГ (акриламид-29 : метил енбисакрил амид-1.3) при напряжении 300В и длине разгона 25см, с идентификацией в УФ-свете и окрашиванием бромистым этидием.
Блот-гибридизация по Саузерну Предварительно амплифицированные фрагменты ДНК подвергали электрофорезу в 1.2% агарозном геле. Для контроля длины блока (CTG)n-повторов в параллельную дорожку геля наносили маркер длины АУЕсоШ. Непосредственно перед переносом на фильтр Hybond N ДНК в геле гидролизовали 0,2N НС1 в течение 10 мин при комнатной температуре; затем проводили денатурацию в течение 45 мин в растворе, содержащем 1.5М NaCl и 0.5N NaOH; далее - нейтрализацию в растворе 1М TrisHCl, 1,5М NaCl в течение 30 мин. Денатурированную ДНК из геля на фильтр переносили с использованием в качестве буфера для переноса 1М ацетата аммония. Иммобилизованную на фильтре ДНК гибридизовали с олигонуклеотидным зондом (CTG)9, меченным 32Р-у-АТФ в буфере, содержащем 7% SDS, 10% декстран сульфата, 1 мМ ЭДТА, 250 мМ Na2HP04, рН 7.2. Отмывку фильтра от несвязавшегося зонда проводили в растворе, содержащем 6xSSC, 0,2 % SDS в течение 15 минут при комнатной температуре. Для получения радиоавтографа фильтр экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 48-72 часов при - 70С.
Анализ полиморфных вариантов локусов гена DMPK, содержащих сайты рестрикции для эндонуклеаз Hinfl и Hhal проводили методом ПНР, последующей рестрикции амплифицированных фрагментов в соответствующих для данных рестриктаз условиях и идентификации фрагментов рестрикции методом электрофореза в 7% ПААГ.
Исследование гена HD (IT-15) У больных хореей Гентингтона и их родственников без клинических признаков ХГ, а также из популяционных выборок проведен анализ трех полиморфных локусов гена IT-15: (CAG)n- , (CCG)n- повторов и del2642 методом ПЦР и последующего электрофореза в 8% ПААГ (акриламид-29 : метиленбисакриламид-1.3) с идентификацией в УФ-свете и окрашиванием бромистым этидием.
Анализ сцепления (CAG)n и (CCG)n повторов проводился с использованием трех пар праймеров: амплифицировались фрагменты, содержащие отдельно (CAG)n и (CCG)n повторы и весь регион в целом.
Для определения числа повторов было просеквенировано несколько образцов, которые в дальнейшем использовались в качестве маркеров.
Исследование гена DMD У больных мышечной дистрофией Дюшенна-Беккера для выявления крупных делеций в гене DMD были использованы 20 пар праймеров: на промоторную область, 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 53 и 60 экзоны. Основу системы составил набор праймеров, предложенных в работе [Abbs et al, 1991] и дополнительно подобранные праймеры на 46 и 49 экзоны. Амплификация проводилась в двух мПЦР- системах: мПЦРІ - 5 -реакция + 46 и 49 экзоны; мПЦР2 - 3 -реакция. Продукты мультиплексной ПЦР разделялись электрофоретически в 7% ПААГ (соотношение акриламида и метиленбисакриламида - 29:1) и визуализировались в УФ-свете.
Выявление точковых мутаций в этих же 20 экзонах и промоторной области гена проведено методом SSCP- анализа (с использованием тех же пар праймеров) и последующего секвенирования образцов с измененной подвижностью однонитевой ДНК.
Исследование генов РМР22, MPZ, EGR2 и GJB1 (Сх32) У больных с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями проведен скрининг на наличие дупликации/ делеций гена РМР22 методом полиморфизма длины амплифицируемых фрагментов (ПДАФ) с использованием мультиплексной ПЦР двух минисателлитных ДНК-локусов, содержащих пента- и тетрануклеотидные повторы. Анализ проводился с помощью набора реактивов «CMT-dup», выпускаемого ООО «Центр молекулярной генетики» (г. Москва), согласно прилагаемой инструкции. Выявление точковых мутаций во всех кодирующих последовательностях исследуемых генов проведено методом SSCP- анализа и последующего секвенирования образцов с измененной подвижностью однонитевой ДНК.
Анализ полиморфизма микросателлитных локусов DXS8040, DXS8111, DXS983, DXS8107 и DXS8052, сцепленных с геном GJB1, проводили методом полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) с использованием праймеров, разработанных лабораторией ДНК-диагностики МГНЦ РАМН (Государственное учреждение Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук), г. Москва.
Анализ этнической брачной ассортативности и ее временной динамики
Неравновесие по сцеплению между аллелями полиморфных локусов X хромосомы и мутации в гене GJB1 рассчитывали по формуле S = -— -, (1 - Рп) где S - мера неравновесности сцепления, Pd - частота ассоциированного аллеля среди хромосом с мутацией, Рп - частота этого же аллеля среди нормальных хромосом [Bengtsson, 1981; Durst et al., 2001]. Статистическую значимость неравновесия по сцеплению оценивали с помощью точного критерия Фишера.
Достоверность различий по частотам тех или иных аллельных вариантов генов-кандидатов между пациентами с БП и контролем оценивали по критерию %2, 95% доверительный интервал (95%С1) рассчитан в таблице сопряженности 2x2 с поправкой Иетса на непрерывность. Различия при статистическом критерии р 0,05 оценивались как значимые. Статистическую обработку результатов исследования проводили в операционной среде Windows ХР с применением программного обеспечения Microsoft Excel.
Как известно, основными факторами микроэволюции популяций человека, определяющими и распространение в них наследственной патологии, являются миграции, генный дрейф, естественный отбор и мутации. Учитывая низкий темп мутирования (в среднем порядка 10"5 - 10"6 на ген на поколение), при описании генетической структуры популяции любого вида по любому из известных в настоящее время менделирующих генов эффектом вновь возникающих мутаций можно пренебречь [Алтухов, 1989]. Выявление роли остальных факторов наиболее значимо, и оно возможно на основе анализа ряда генетико-демографических параметров структуры популяций человека, таких как численность популяции, территориальная подразделенность (наличие субпопуляций), миграция извне и между субпопуляциями, половозрастная структура, структура браков, репродуктивные параметры, оценка коэффициента инбридинга [Wright, 1951, 1965; Crow, 1958; Cavali-Sforza, Bodmer, 1971; Kimura, Ohta, 1971]. В результате исследований, проведенных ранее Рафиковым Х.С. с соавт. (1980) по изучению структуры популяции башкир была показана преемственность и стабильность генетической структуры популяции. Исследования по ряду полиморфных генетических маркеров, в том числе по гаплотипическому разнообразию Y-хромосомы, показали значительное влияние дрейфа генов на формирование структуры популяций башкир [Викторова, 2002]. С целью определения влияния естественного отбора нами был проведен анализ основных репродуктивных характеристик популяций семи сельских районов РБ (Абзелиловский, Архангельский, Аскинский, Баймакский, Бурзянский, Балтачевский, Салаватский) [Тереховская с соавт., 2007]. Подробные данные по этому исследованию не включены в настоящую диссертационную работу, однако основные результаты необходимо отметить. Так, на основании данных 1850 демографических анкет были подсчитаны генетико-демографические характеристики для башкирского, русского и татарского населения. Эффективная плодовитость составила 3,28, 2,85, 3,00, соответственно. Индекс Кроу и его компоненты составили: для башкир Im=0,05, If=0,25, Itot=0,32, для русских Im=0,03, If=0,33, Itot=0,38, для татар Im=0,04, If=0,26, Itot=0,31. Эти показатели свидетельствуют, во - первых, о расширенном воспроизводстве во всех трех национальных группах, во-вторых - о незначительном влиянии естественного отбора в исследованных популяциях. По данным В.П. Пузырева с соавт. (1999), индекс смертности Im в изученных популяциях человека варьирует в пределах 0,01- 1,78, а индекс тотального отбора Itot - в пределах 0,27- 3,16, в сравнении с которыми все показатели, полученные для трех этнических групп населения РБ, являются низкими. В Республике Башкортостан, как и во многих современных популяциях, наблюдается снижение влияния естественного отбора и увеличение зависимости репродуктивного поведения от социальных факторов.
Таким образом, в нашу дальнейшую задачу входило изучение таких показателей популяционной структуры, как этническая ассортативность, эндогамность, дальность миграций и локальный инбридинг, в значительной степени определяющих миграции генов.
Брачно-миграционная структура, наряду с половозрастной, этнической и генетико-демографической структурой, является основным маркером генетической демографии [Курбатова, Победоносцева, 2006]. Брачно-миграционную структуру можно охарактеризовать рядом числовых параметров, полученных на основании брачных записей [Ельчинова, 2004].
Брачные записи проанализированы в шести районах Республики Башкортостан (Абзелиловском, Бурзянском, Баймакском, Салаватском, Архангельском и Балтачевском), расположенных в различных географических зонах РБ. Общая численность исследованных районов составляет 177691 человек; брачные записи изучены за 4 временных периода: 1) начало 60-х годов XX века, 2) начало 80-х годов XX века, 3) конец 90-х годов XX века, 4) начало XXI века. Проанализировано 16135 брачных записей. Национальный состав браков представлен в таблице 3. Анализ проводился для башкир, татар и русских, наиболее представленных в Башкортостане.
Под этнической брачной ассортативностью понимают предпочтение заключения брака внутри своей национальности. Этническая ассортативность обусловливает изолированность популяций по национальному признаку, влияя таким образом на формирование их генетической структуры. В таблице 4 представлена этническая ассортативность (Н), рассчитанная для башкир, русских и татар шести районов РБ.
Установлено, что этническая ассортативность в исследованных районах РБ меняется в зависимости от представительства определенного этноса в районе. Так, в Бурзянском районе, 95.3% населения которого составляют башкиры, их этническая ассортативность составляет 1.02, что характерно для моноэтнической популяции, а в Балтачевском районе, где численность башкир значительно ниже, ассортативность возрастает до 2.71. В том же Балтачевском районе этническая ассортаивность татар составляет 1.30, а в других районах, где татар меньше, их этническая ассортатвность выше. Для русских характерна та же тенденция - наиболее низкая этническая ассортативность русских в Архангельском районе (2.14), где их более 38%, наиболее высокая - в Баймакском (7.50).
Анализ полиморфизма локусов (CAG)n-, (CCG)n- повторов и нейтральной делеции del2642 гена HD (IT15) в популяциях Волго-Уральского региона и у больных хореей Гентингтона из Башкортостана
Такие высокие показатели гетерозиготности, расово-диагностические свойства данного локуса, а также дифференциация популяций, выявляемая на уровне подразделений одного этноса, позволяют считать область полиморфных (CTG)n повторов нейтральным высокоинформативным генетическим маркером популяций. Высокий уровень гетерозиготности (CTG)n локуса имеет важное значение и для медико-генетического консультирования семей с МД, т.к. среди здоровых членов семей чаще всего выявляются гетерозиготы, что позволяет исключить диагноз.
Согласно существующим предположениям, как уже было сказано в гл. 1, аллели с числом CTG - повторов 5 и 19 являются более нестабильными, предрасполагающими к экспансии, в связи с чем частота заболевания в популяциях с более высокой частотой этих аллелей должна быть выше по сравнению с таковой в популяциях, где данные аллели (особенно с высоким числом триплетов) встречаются реже. Согласно результатам исследования [Imbert et al., 1993], частота перехода аллелей (CTG)i9-3o в аллели (CTG) 3о-5о составляет 2x10"4, а частота случаев экспансии аллелей (CTG)3o-5o, приводящей к образованию МД-хромосом -0.01-0.02. Известно также, что выявленная в некоторых европейских популяциях частота аллелей (CTG)i9-3o? равная 8%, соответствует частоте МД 1:8000, а в отдельных африканских популяциях частота этих аллелей, равная 2%, соответствует только одному случаю МД, обнаруженному в этом регионе [Dada, 1973]. С очень низкой частотой заболевание встречается так же в китайской и тайской популяциях [Ashizava end Epstein, 1991], где аллели (CTG)i9.3o не были выявлены совсем, а в популяции Тибета они были обнаружены с низкой частотой (6% ) [Zerylnick et al., 1995; Tishkoff et al., 1998]. В то же время, в популяции якутов, где наблюдается высокая частота заболевания (21.28 на 100 000 населения), частота нестабильных аллелей (CTG)i9-3o невысока - от 4 до 5,3%, на основании чего авторы делают предположение о малой вероятности неоднократного возникновения мутации в Якутии из «переходных» аллелей и связывают ее распространение с эффектом основателя [Федорова с соавт., 2005]. Позднее это предположение для якутсткой популяции было подтверждено с помощью сравнительного гаплотипического анализа, проведенного у больных МД и в популяции якутов [Спиридонова с соавт., 2007]. Наши данные позволяют проверить эту гипотезу на примере трех субпопуляций зауральских башкир - Абзелиловского, Баймакского и Бурзянского районов, для каждой из которых методами популяционной демографии была показана значительная обособленность (гл.3.1). Как уже было показано, в Абзелиловском и Баймакском районах РБ установлена наибольшая распространенность МД - 30 и 40 на 100000 населения, соответственно, тогда как в Бурзянском районе не выявлено ни одного случая заболевания. Однако по распределению частот аллелей (CTG)n-локуса эти три группы башкир являются однородными, а аллели с высоким числом ( 30) повторов обнаружены как в Абзелиловском, так и в Бурзянском районах. Таким образом, данное исследование не выявило корреляции частоты аллелей с высоким числом CTG повторов в гене DMPK с частотой МД в популяции.
С целью определения частоты мутирования локуса (CTG)n повторов гена DMPK мы провели анализ их наследования в 300 здоровых семьях, из трех человек каждая. Из них в трех семьях (1 %, или 0.5% от числа передачи хромосом) было выявлено изменение числа CTG повторов при передаче как от матери к ребенку (два случая), так и от отца к ребенку (один случай). В одном случае нестабильным оказался аллель CTG22, он перешел в CTG26; в другом случае аллель CTG19 изменился до CTG22, в третьем случае - аллель CTG32 изменился до CTG20- Во всех трех случаях кровное родство родителей и детей было подтверждено анализом ряда высокополиморфных ДНК-маркеров. Таким образом, эти данные подтверждают гипотезу о нестабильности аллелей гена DMPK с числом CTG повторов 19, а частота их мутаций составляет 5x10" , что также в значительной степени соответствует известным данным о скорости мутаций в микросателлитных районах, равной 2xl(T[Sajantilaetal., 1999].
Таким образом, получена новая информация - о характере полиморфизма локуса (CTG)n повторов гена DMPK в популяциях обширного и одного из интересных регионов Евразии - Урало-Поволжья. Показана значительная гетерогенность исследованных популяций по распределению частот аллелей (CTG)n локуса, в том числе на уровне этногеографических групп одного этноса (башкир), а также высокий уровень его гетерозиготности, что позволяет считать данный микросателлитный локус высокоинформативным генетическим маркером популяций. Установлено, что по характеру распределения частот аллелей (CTG)n локуса гена локуса (CTG)n повторов гена DMPK популяции Вол го-Уральского региона занимают промежуточное положение между популяциями Европы и Азии.
С целью изучения характера нестабильности числа CTG повторов гена DMPK проведен анализ наследования аллелей данного локуса в 300 здоровых семьях. Установлено, что нестабильными являются аллели с числом CTG 19, а частота мутирования данного локуса составила 5x10" .
Анализ распределения частот аллелей (CTG)n повторов в субпопуляциях башкир с крайними значениями распространенности МД не подтвердил гипотезы о прямом влиянии частоты аллелей с большим числом повторов ( 19, 30) на распространенность заболевания в популяции.
Таким образом, миотоническая дистрофия распространилась на территории РБ в результате эффекта основателя, а ее накопление среди башкир, имеющее локальный территориальный характер, связан с дрейфом генов, обусловленным положительной брачной ассортативностью башкир и высоким уровнем эндогамии в районах республики.
