Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11.
1.1. Структура генома ВГВ 11.
1.2. Жизненный цикл вируса ГВ 13.
1.3. Экспрессируемые белки ВГВ 17.
1.4. Генетическая вариабельность ВГВ 19.
1.4.1. Генотипы, субгенотипы, серотипы вируса гепатита В 19.
1.4.2. Мутанты ВГВ 23.
1.5. Серологическая диагностика вирусного гепатита В 31.
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37.
ГЛАВА 3. Динамика заболеваемости гепатитом в на территории российской федерации в период с 2000 по 2006 годы 44.
3.1. Оценка динамики заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы 44.
3.2. Динамика заболеваемости гепатитом В в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах в период с 2000 по 2006 годы 52.
ГЛАВА 4. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса гепатита в по presl/pres2/s-teham 58.
4.1. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей 60.
4.1.1. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории г.Москвы 61.
4.1.2. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории Республики Кабардино-Балкария (г.Нальчик) 78.
4.1.3. Генетическая характеристика штаммов вируса гепатита В, выделенных от пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией г.Череповца 80.
4.1.4. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных от пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией на территории Республики Саха (Якутия) 84.
ГЛАВА 5. Сравнительный анализ диагностических возможностей коммерческих тест-систем для детекции hbsag с помощью панели образцов охарактеризованных изолятов вируса гепатита В 92.
Глава 6. Обсуждение полученных результатов 100.
Выводы 113.
Указатель литературы
- Жизненный цикл вируса ГВ
- Генотипы, субгенотипы, серотипы вируса гепатита В
- Динамика заболеваемости гепатитом В в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах в период с 2000 по 2006 годы
- Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории Республики Кабардино-Балкария (г.Нальчик)
Введение к работе
В настоящее время проблема гепатита В (ГВ) сохраняет свою актуальность и является одной из социально-значимых инфекций в Российской Федерации. Несмотря на наличие эффективных средств профилактики гепатита В, таких как активная и пассивная иммунизация, противовирусных препаратов, по данным J.M. Pawlotsky (2005) более 350 млн. людей во всем мире хронически инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ). Одним из ведущих аспектов проблемы ГВ является генетическая вариабельность возбудителя этого заболевания, которая обусловливает, в ряде случаев, недостаточную эффективность вакцинации, серологической диагностики, а также лечения противовирусными препаратами.
Проблема вариабельности ВГВ становится более значимой для медицинской практики, поскольку частота встречаемости генетических вариантов ВГВ растет, особенно в регионах с высокой заболеваемостью. Принятые и реализуемые национальные и международные программы вакцинопрофилактики ГВ, широкое применение химиотерапевтических средств являются активными селективными факторами, способствующими распространению редко встречающихся и ускользающих вариантов вируса.
Одной из составляющих проблемы генетической вариабельности ВГВ является вариабельность pre-Sl/pre-S2/S генов вируса, кодирующих оболочечные белки вируса. Прошло почти 20 лет с тех пор, как появилось первое сообщение о способности мутантных форм вируса по S-гену ускользать от индуцированного вакциной иммунитета [W.F.Carman et al., 1990]. Последующий период характеризовался накоплением данных о вариантах ВГВ, которые вызывали проблемы в серологической диагностике или лечении инфекции, а также их распространенности в популяции [W.F. Carman, 1997; P.F.Coleman et al., 1999; C.He et al., 2001; M.S.Ho et al., 1998; J.Hou et al., 2001; J.H.Ireland et al., 2000; K.M.Lee et al., 2001; B.Moerman et al., 2004; C.J.Oon et al, 1996; C.J.Oon et al., 1999; L.Roznovsky et al., 2000; S. Seddigh-Tonekaboni et al., 2000]. В России данные об обнаружении различных
вариантов ВГВ единичны и недостаточны. В связи с этим представляет интерес изучение распространенности генотипов, субгенотипов и различных вариантов ВГВ среди хронических больных в различных регионах Российской Федерации, характеризующихся различной интенсивностью эпидемического процесса вирусного гепатита В и этническим составом населения.
В настоящее время отсутствуют данные о возможностях иммуноферментных тест-систем (ИФТС), применяемых в Российской Федерации, выявлять HBsAg, принадлежащий различным генотипам и субгенотипам ВГВ, в том числе и известным мутантным формам вируса. Выполнение таких исследований позволит существенно повысить качество серологической диагностики гепатита В.
Изложенное выше послужило основанием для выполнения работы по изучению современных проявлений эпидемического процесса гепатита В на территории Российской Федерации и отдельных федеральных округов, определению структуры генотипов, субгенотипов ВГВ в различных регионах страны, генетической вариабельности pre-Sl/pre-S2/S генов у изолятов ВГВ, выделенных у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией, а также оценки способности современных тест-систем определять HBsAg, принадлежащий различным генотипическим, серотипическим и мутантным формам вируса.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - изучение динамики заболеваемости гепатитом В на территории отдельных федеральных округов РФ, генетического разнообразия циркулирующих изолятов ВГВ, а также оценка диагностических возможностей тест-систем для детекции HBsAg.
Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:
1. Рассчитать многолетние тенденции динамики заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории России, а также
7 Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов за период с 2000 по 2006 годы;
Изучить генетическую вариабельность pre-Sl/pre-S2/S генов вируса гепатита В у лиц с хронической НВ-вирусной инфекцией, а также структуру циркулирующих генотипов на территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов;
Охарактеризовать диагностические возможности коммерческих тест-систем для детекции HBsAg.
Научная новизна.
Выявлена значительная территориальная неравномерность по уровню заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В (суммарные показатели) по трем федеральным округам Российской Федерации. В Дальневосточном округе уровень заболеваемости гепатитом В при использовании метода сигмальных отклонений определен как высокий. Наиболее благополучными являются Центральный и Южный федеральные округа, уровень заболеваемости ГВ в которых квалифицирован как низкий и ниже среднего.
Установлены различия в структуре циркулирующих генотипов ВГВ па исследуемых территориях: в Центральном и Южном округе с наибольшей частотой обнаружен генотип D (87%), тогда как в Дальневосточном округе генотипы А и D составляют по 44% и генотип С - 12%.
Впервые на основании широкомасштабных молекулярно-генетических исследований изолятов ВГВ, циркулирующих на различных территориях Российской Федерации, установлено, что в pre-Sl/pre-S2/S области генома ВГВ, наиболее вариабельными участками оказались область pre-S2/S промотора у изолятов генотипа D (до 31% нуклеотидных замен), 5'- конец pre-S2/S генов у изолятов генотипа С (до 54%) и 3'- конец S-гена у изолятов генотипа А (до 28%). При этом область S-гена, соответствующая главному гидрофильному региону (MHR) была менее вариабельной (до 25% нуклеотидных замен у изолятов генотипа А).
8 Положения, выносимые на защиту.
В результате проведенного эпидемиологического анализа рассчитаны многолетние тенденции заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории Российской Федерации, Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов в период с 2000 по 2006 годы:
а) для совокупного населения установлено:
- выраженное снижение заболеваемости острым гепатитом В и носительства ВГВ (Тснижения=>-5,\%), стабильный уровень заболеваемости хроническим гепатитом В (Т снижения — -1%);
б) для детей до 14 лет установлено:
- выраженное снижение заболеваемости острым, хроническим гепатитом В и носительства ВГВ (Ташжвния — >-5,1%).
Для изученных изолятов ВГВ, циркулирующих на территории трех федеральных округов, показана более высокая генетическая вариабельность областей pre-Sl, pre-S2 генома, по сравнению с участком S-гена, соответствующего главному гидрофильному региону (MHR).
Зафиксированы существенные различия в чувствительности четырех коммерческих тест-систем для детекции HBsAg - при определении HBsAg, принадлежащего генотипам D и А они достигали 44 и 40 раз соответственно.
Различия в диагностических возможностях тест-систем для детекции HBsAg не всегда обусловлены наличием замен в «а»-детерминанте главного гидрофильного региона HBsAg.
Практическая значимость.
Оценка диагностических возможностей четырех тест-систем для детекции HBsAg на примере изученных изолятов ВГВ показала, что тест-системы «Roche Elecsys HBsAg» (основана на хемилюминєсцентном методе детекции) и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» (основана на методе флюоресцентно-поляризационном иммунном анализе) являются более чувствительными тестами в отношении генотипических (генотипы А и D) и мутантных форм (М133Т, P120S) HBsAg. Отечественная тест-система - «ДС-
9 ИФА-HBsAg» продемонстрировала сравнительно более низкие диагностические возможности при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg.
Выявленные различия в диагностических возможностях разных тестов при детекции HBsAg с установленными генотипами, субтипами и мутантными формами обосновывают необходимость создания экспертных панелей, содержащих образцы с наличием HBsAg различных генотипических, субтиповых и мутантных форм принадлежности.
Внедрение полученных результатов.
Материалы диссертационной работы использованы при разработке приказа Министерства здравоохранения Республики Саха (Якутия) №01-8/4-289 от 31.05.2006 г. «Об обследовании беременных на перинатальные инфекции в PC (Я)».
Научные положения, выводы и практические рекомендации, вытекающие из результатов диссертационной работы, используются при чтении лекций и проведении семинарских занятий на кафедре вирусологии Московской Медицинской академии им. И.М.Сеченова.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на: VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2007 год); XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2007 год).
Апробация диссертации состоялась 22 мая 2008 года на заседании Ученого совета отдела вирусологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
10 Структура и объем диссертации.
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы, состоящего из 125 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 14 рисунков.
Жизненный цикл вируса ГВ
Жизненный цикл вируса (рисунок 1.2.1) начинается с его прикрепления к рецептору на гепатоцитах, который остается все еще не известным, по последним данным СМ. Leistner et al. 2008 [81], высказывается мнение, что гепаран сульфат протеогликаны (HSPGs) выступают как низкоаффиные рецепторы на начальных этапах входа вируса в клетку. В то время как, участок между аминокислотами 9 и 48 Pre-Sl белка (нумерация аминокислот приведена для генотипа D) давно уже известен как место вирусной поверхности, участвующей в связывании с мембраной гепатоцита, а также считают, что Pre-Sl (или L) протеин играет ключевую роль в сборке вириона и его высвобождении из клетки [59, 79, 69]. Предполагают, что домен внутри малого S протеина может быть тоже вовлеченным в связывание с гепатоцитом, приводя вирусную частицу в близкий контакт с клеточной мембраной, и тем самым, облегчая специфическое взаимодействие Pre-Sl домена с его рецептором [96]. Вирион входит в клетку, раздевается в цитоплазме, откуда геном перемещается в ядро, где он конвертируется в двух-цепочечную ковалентно связанную циркулярную ДНК (cccDNA) молекулу. Поскольку, cccDNA является матрицей для транскрипции вирусных mRNAs (как геномных, так и субгеномных транскриптов) с помощью клеточной РНК-полимеразы II, её образование свидетельствует об успешности инициации инфекции. Механизм ДНК репарирования, вовлеченный в этот переход (rcDNA-» cccDNA) не известен.
Вирусная РНК транспортируется в цитоплазму, где происходит трансляция вирусных белков. Далее, нуклеокапсиды собираются в цитозоле, и во время этого процесса одна молекула геномной РНК (pgRNA) входит в состав собирающегося вирусного кора. pgRNA — является одним из вирусных транскриптов, более длинный, чем геном 3,5 kb и формирует матрицу для синтеза (-)-цепи ДНК, а также участвует в трансляции сердцевинного и полимеразного протеинов. Процесс инкапсидации запускается при связывании вирусной полимеразы с эпсилон сигналом (є) - вторичная структура РНК на 5Л pgRNA. Последующие события в репликации вирусного генома происходят внутри нуклеокапсида. Упаковывание РНК также зависит от клеточных факторов, в частности от полипептидов отнесенных к молекулярному шаперонному комплексу hsp90. Hsp90 по-видимому, стабилизирует временную конформацию полимеразы, что облегчает ее связывание с эпсилон на pgRNA.
Помимо роли в упаковывании РНК, эпсилон сигнал играет большую роль в инициации ДНК синтеза. Эта реакция является уникальной у гепадновирусов, поскольку, обратная транскриптаза выступает как «протеиновый праймер» для ДНК синтеза. Вследствие терминальной избыточности pgRNA, эпсилон последовательность и фланкирующий регион, содержащий прямой повтор 1 (DR1) удваиваются (рисунок 1.2.2). Выпуклость с структуры служит как матрица для синтеза 3-4 нуклеотидного ДНК праймера, который ковалентно прикрепляется к полимеразе через тирозиновый остаток терминального протеина (функциональный участок вирусной полимеразы) (позиция 96). Этот процесс происходит на 5" конце pgRNA с последующей транслокацией полемеразы-праймерного комплекса к 3\ где он гибридизируется с DR1 участком. Таким образом, комплекс перемещается к 5" концу pgRNA, в результате чего синтезируется (-)-цепь ДНК, а РНК матрица одновременно разрушается за счет RNase-H активности вирусной полимеразы, за исключением концевых 18 рибонуклеотидов. Вторая транслокация происходит, когда рибонуклеотидный праймер гибридизируется с DR2 участком на 5" вновь синтезированной (-)-ДНК цепи. Это позволяет начаться синтезу (+)-ДНК цепи, который происходит вдоль 5Л конца завершенной (-)-ДНК цепи, тем самым, осуществляя циркуляризацию генома. Синтез (-)- и (+)-ДНК цепей происходит внутри нуклеокапсида, через поры которого возможно прохождение нуклеотидов, используемых в элонгации ДНК-цепей. Зрелый нуклеокапсид одевается при прохождении через эндоплазматический ретикулум, и нуклеотидный пул внутри него не может быть пополнен, отсюда причина незавершенности (+)-ДНК цепи [76]. Вирусные частицы, покрытые оболочкой, состоящей из всех трех поверхностных белков, как полагают, из эндоплазматического ретикулума попадают в комплекс Гольджи, где происходит гликозилирование аспарагинового остатка, локализованного в S домене поверхностных белков, которое завершается секрецией зрелых вирионов в кровяное русло [89, 112].
Генотипы, субгенотипы, серотипы вируса гепатита В
Поскольку, ВГВ реплицируется через этап образования РНК прегенома с использованием обратно-транскриптазной активности собственной полимеразы, которая не имеет корректирующей функции, скорость мутаций для ВГВ выше, чем для других ДНК вирусов, но ниже чем у РНК вирусов, и составляет порядка 1,5x10"5 -5x10" оснований на сайт в год [86]. Имеются и другие механизмы изменчивости - возможно «проскальзывание» во время ошибочного объединения пар между матрицей и прогенной ДНК цепью, воздействие клеточных топоизомераз и сплайсинг гена с использованием альтернативных донорных и акцепторных сайтов, появление рекомбинаций между коинфицирующими штаммами [88]. Однако чрезвычайная компактизация генома, предупреждает чрезмерную генетическую вариабельность генома.
Генетическая вариабельность ВГВ генома проявляется в виде различных генотипов, субгенотипов, серотипов как стабильных форм, которые возникли в результате эволюционного развития генома вируса под действием селективного популяционного давления; и дополнительных стабильных изменений в последовательности генома, возникающие вследствие мутаций и их селекции, которые обнаруживаются внутри всех генотипов.
Вскоре после открытия HBsAg, серологическая гетерогенность вируса стала очевидной. Используя субтип-специфические антитела против HBsAg, девять основных серотипов было установлено (adw2, adw4, adr, adrq-, aywl, ayw2, ayw3, ayw4 и ayr) [80, 56, 106, 110]. Серотипы также можно прогнозировать исходя из последовательности участка вирусного генома кодирующего HBsAg, путем идентификации аминокислот в специфических позициях [50] (таблица 1.4.1.1). HBsAg эпитопы, экпрессируемые различными серотипами локализуются в регионе, который включает две внешние петли молекулы (аминокислоты 110-180). Одна из антигенных детерминант, так называемая «а»-детерминанта HBsAg (аминокислотные остатки 124-147 S гена) является общей для всех штаммов дикого типа ВГВ известных на данный момент (рисунок 1.4.1.1). Существуют также две пары взаимоисключающих субдетерминант ("d"miu "у" и "w" или "г"), которые образованы аминокислотными заменами лизина и аргинина в позициях 122(d/y) и 160 (w/r) соответственно в S протеине [99]. Также были описаны гетерогенность w детерминанты и наличие других детерминант, таких как q, х или g [120].
Основываясь на различии нуклеотидной последовательности целых геномов ( 8%), ВГВ-геномы были классифицированы на восемь генотипов, обозначенных как А-Н. Как было показано в различных исследованиях генотипы вируса гепатита В имеют различное географическое распространение [50, 80, 122] (таблица 1.4.1.2).
Генотипы А и D имеют глобальное распространение, генотипы В и С преимущественно в Восточной и Юго-восточной Азии, генотип Е превалирует в Западной Африке, а наиболее гетерогенный генотип F, как и Н распространены в Центральной и Южной Америке.
Генотипы ВГВ различаются по длине генома. Так генотипы В, С, F и Н имеют длину генома в 3215 нуклеотидов. Генотип D имеет 33 нуклеотидную делецию в PreSl участке и только 3182 нуклеотида в длину. Генотипы Е и G имеют 3 нуклеотидную делецию в том же участке полимеразы. А генотип ВГВ/А отличается от других генотипов инсерцией шести нуклеотидов в участке терминального протеина полимеразного гена и частично перекрывающегося кор гена [32].
Генотип G характеризуется наиболее гетерогенной структурой генома в отличие от остальных генотипов ( 11,8%) [77]. ВГВ/G имеет более длинный геном 3248 Ьр в сравнении с другими генотипами. Это связано с инсерцией в ЗбЬр в ко доне 2 кор гена [91]. ВГВ/G также имеет два стоп кадона в позициях 2 и 28 рге-Соге участка, каждый из которых препятствует трансляции предшественника HBeAg.
Помимо генотипов ВГВ, были идентифицированы субгенотипы внутри генотипов А, В, С, D и F, на основании различий полных геномных последовательностей ( 4%) внутри группы, но не более (8%) [80]. Наличие субгенотипов внутри генотипов Е, G и Н еще не доказано.
Кроме того, при совместной инфекции различными генотипами ВГВ могут образовываться рекомбинантные генотипы. Так, рекомбинанты ВГВ между генотипами В и С (В/С) часто встречаются в Юго-Восточной Азии, а рекомбинация между генотипами А и D (A/D) была описана у штаммов в Италии и Южной Африки. Анализ аббсрантного ВГВ генотипа из Вьетнама показал рекомбинацию между генотипами А и С (А/С). А в Тибете сообщили о наличие рекомбинации между генотипами С и D (C/D) [49, 92].
Динамика заболеваемости гепатитом В в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах в период с 2000 по 2006 годы
Проведение сравнительного анализа динамики заболеваемости гепатитом В в трех федеральных округах Российской Федерации обусловлено изучением молекулярно-генетических свойств изолятов ВГВ, выделенных на территории указанных округов. Следует отметить, что на территории выбранных федеральных округов, как и в целом по России, зафиксировано снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В (таблица 3.2.1).
Стабильное превышение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В в сравнении со среднероссийским отмечено в Дальневосточном федеральном округе. В Южном федеральном округе суммарный показатель заболеваемости гепатитом В превысил среднероссийский уровень в 2003, 2004 и 2006 годах. А в Центральном федеральном округе суммарный показатель заболеваемости гепатитом В не превысил среднероссийский уровень за весь период наблюдения (2000-2006 годы).
Большое значение в эпидемиологической практике имеет не только суммарный показатель, но и оценка уровня его распространенности [19, 20, 21]. Данный способ обработки показателей позволяет использовать единую методику с разграничением шкалы ступеней по уровням [15, 18, 20]. Применение данного подхода позволило выявить различия в уровне распространенности суммарного показателя гепатита В на территории трех федеральных округов, несмотря на его снижение. В Дальневосточном округе зафиксирован стабильно высокий уровень распространенности суммарного показателя гепатита В. В Южном округе уровень распространенности суммарного показателя гепатита В по данным за 2006 год превышает стартовое значение 2000 года, тогда как, в Центральном округе наблюдается положительная тенденция, направленная на снижение от ниже среднего до низкого уровня суммарного показателя распространенности гепатита В. Таким образом, на территории Центрального и Южного федеральных округов имеют место преимущественно ниже среднего и средний уровни распространенности суммарного показателя заболеваемости ГВ среди совокупного населения. В Дальневосточном округе превышение суммарного показателя заболеваемости ГВ, в сравнении со среднероссийским, соответствует также его высокому уровню распространенности и свидетельствует о том, что данный округ является эндемичным по гепатиту В. Среди детей до 14 лет, на территории рассматриваемых федеральных округов, как и по России в целом, динамика показателей заболеваемости трех регистрируемых форм гепатита В характеризуется снижением. Многолетняя тенденция (2000-2006 годы) в заболеваемости ОГВ, ХГВ и носительства ВГВ характеризуется выраженным снижением (Т снижения= -5,1%). В то же время уровень распространенности регистрируемых форм гепатита В среди детей до 14 лет на территории рассматриваемых федеральных округов имеет различия (таблица 3.2.2).
На территории Дальневосточного округа уровень распространенности трех регистрируемых форм гепатита В стабильно высокий, за исключением 2006 года - уровень распространенности ОГВ стал ниже среднего. В Центральном округе уровень преимущественно низкий или ниже среднего, а в Южном — преимущественно ниже среднего или средний уровень, с однократно зафиксированным уровнем выше среднего в 2006 году для ОГВ. Суммарный показатель распространенности гепатита В на территории Центрального округа среди детей до 14 лет характеризуется преимущественно низким уровнем его распространенности, а в Южном округе - уровнем ниже среднего. В Дальневосточном округе имеет место стабильно высокий уровень распространенности суммарного показателя ГВ (рисунок 3.2.1). Высокий уровень распространенности регистрируемых форм гепатита В, а также суммарного показателя на территории Дальневосточного округа свидетельствует о том, что данный округ является эндемичным по гепатиту В среди детей до 14 лет (таблица 3.2.3).
Анализ эпидемиологических данных показал, что реализация программы иммунопрофилактики гепатита В способствовала снижению заболеваемости гепатитом В. На территории Центрального и Южного федеральных округов имеет место преимущественно, уровень распространенности ниже среднего суммарного показателя гепатита В, как среди совокупного населения, так и среди детей до 14 лет. Эндемичным по гепатиту В среди совокупного населения, в том числе среди детей до 14 лет, является Дальневосточный федеральный округ.
Таким образом, суммарный показатель заболеваемости регистрируемых форм гепатита В среди совокупного населения на территории Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы характеризуется снижением в 2,2 раза, с 152,4 до 68,7 на 100 тысяч населения, а среди детей до 14 лет уменьшился в 3,4 раза - с 37,5 до 11,0 на 100 тысяч населения за тот же период наблюдения, чему способствовала реализация широкомасштабной программы вакцинации в соответствии с Национальным календарем прививок (2001 год). На территории трех рассматриваемых федеральных округов, как и по России в целом, многолетние тенденции в заболеваемости регистрируемых форм гепатита В среди детей до 14 лет, характеризуются выраженным снижением - Т снижения = -5,1%. Снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В не привело к существенному изменению уровня его распространенности. На территории рассматриваемых федеральных округов не наблюдается существенного снижения уровня распространенности суммарного показателя ТВ, в том числе среди детей до 14 лет, обусловленный, по-видимому, недостаточным охватом своевременной вакцинацией, что является сдерживающим фактором дальнейшего снижения заболеваемости гепатитом В.
Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории Республики Кабардино-Балкария (г.Нальчик)
Другой функциональный участок оболочечных генов, представляющий интерес с позиций влияния на интенсивность экспрессии HBsAg - это Pre-S2/S промоторный участок (2994-3171 и.о.). Он содержит различные регуляторные элементы (NF1, SP1, ССААТ-элемент), участвующие в транскрипции Pre-S2 и S белков. Наибольшее значение имеет ССААТ мотив (3104-3108), мутации в котором ведут к нарушению продукции HBsAg и секреции вирионов [87, 108]. У изучаемых изолятов ВГВ, генотип D имеет наиболее вариабельный Pre-S2/S промоторный участок (31,4% н.о. замен), по сравнению с генотипами А (9,5%) и С (6,7%о). Здесь нужно отметить наличие двух изученных нами изолятов с частично делетированной промоторной областью - изолят 13 (делеция 3000-3038 н.о.) и изолят 5 (делеция 3128-17 и.о.), у которого делеция пролонгирована до 51- конца Pre-S2 гена. А также наличие у изолята 23 двух нуклеотидных мутации в ССААТ элементе - ССССТ. Но, несмотря на изменения в этой области у изученных нами изолятов, все они имели HBsAg в сыворотке крови.
В рамках этой области находится участок Pre-Sl белка (92-113 аа) или если рассматривать Pre-Sl белок в виде трех доменов L, М и S, то этот участок располагается на границе L и М доменов - (92-108/1-5 аа) (нумерация аминокислот приведена для генотипа D) (рисунок 4.1.1.3). Этот участок, как полагают, выполняет матриксную функцию при морфогенезе вирионов с последующей их секрецией из клетки [35, 36]. В этом участке выявлены следующие замены - N103D (4 ІКВ, 31,2, 13, 3, 23, К, 16, 22); М1Т (6) -замена, повреждающая инициирующий кодон для М белка; W3R (26). Как уже упоминалось, у штамма 5 присутствует делеция, захватывающая L-M домены (94-108/1-10 аа), которая почти полностью исключает матриксный участок, что должно приводить к нарушению формирования оболочки вирионов и их секреции. Следует отметить, что в работе M.Melegari et al. (1997) [83] описывается мутантный вирус ВГВ с делецией в L белке (47-107 аа), которая наряду с матриксным участком удаляла и S промотор, в результате синтеза HBsAg и секреции вирионов не происходило. Но в эксперименте при котрансфекции подобного вируса с конструкцией, несущей S ген, секреция вирионов, несущих делецию, восстанавливалась. Это наблюдение противоречит данным V.Bruss (1997) [36], который показал, что матриксный участок в L домене (92-113 аа) является необходимым для секреции вирионов. В нашем случае, изолят 5, несущий делегированный матриксный участок, выделен из сыворотки, положительной на HBsAg. Возможно, наша ситуация напоминает эксперимент M.Melegari et al. (1997) [83], когда к мутантному ВГВ с делецией матриксного участка был добавлен HBsAg, его секреция восстанавливалась. Также возможна комплементация делетированного генома ВГВ геномом дикого типа, присутствующего как минорный компонент в вирусной популяции, в результате вирусный геном с делецией будет использовать оболочечные белки генома дикого типа и успешно секретироваться.
В N-концевом участке S домена располагается цитозольная петля (33-80 аа) (рисунок 4.1.1.4), аминокислотная последовательность которой, как полагают С.Т.М. Mangold et al. (1993) [82], H.Loffler-Mary et al. (2000) [65], необходима в сборке и секреции вирионов и субвирусных частиц.
Замены N40S (20, 29); F41L (3); G44E (2, 13); T45N (22); S45A и Р46Н (17) локализуется в участке (40-46 аа) при делеции которого, происходило нарушение секреции зрелых вирионов [65]. Замена T57I (2) находится на участке, где делеция (57-63 аа) приводила к нарушению сборки и секреции субвирусных частиц, а замены (56-59 аа, с T57L) вызывали нарушение секреции зрелых вирионов, а замена S61T (25, 6) находится на участке, где замены (61-64 аа, с S61A) вызывали нарушение сборки и секреции субвирусных частиц [65]. У изолята 5 в 74 позиции S белка триптофан заменен стоп кодоном (W74Stop), тем самым, прерывая дальнейший синтез HBsAg, но данный изолят выделен из HBsAg-позитивной сыворотки. Преждевременный стоп кодон в S белке в позициях 61, 69, 94 был обнаружен в ряде работ [39, 45, 93], в одних случаях, сыворотки крови, из которых выделены подобные изоляты были позитивны на HBsAg, в других нет. Замена C76Y (изолят 23), одного из четырех цистеинов в цитозольной петле S белка, не влияет на сборку и секрецию субвирусных частиц [82]. Замена аргинина в 79 позиции на позитивно заряженную аминокислоту лизин вызывала в эксперименте по обратной генетике прекращение секреции зрелых вирионов [65], в то время как у нас была обнаружена замена R79H (изолят 20), где гистидин также относится к группе полярных аминокислот, однако мутантный геном вируса детектировался в сыворотке крови.
