Введение к работе
Актуальность темы исследования. Аденовирусы представляют
собой обширное семейство вирусов (Adenoviridae), патогенных для человека, млекопитающих и птиц. Аденовирусы человека циркулируют повсеместно, по своей распространенности они занимают третье место после гриппа и респираторно-синцитиальной инфекции. Их удельный вес в структуре ОРВИ составляет около 9% (Колобухина Л.В. и др., 2001; Соминина А.А. и др., 2007; Echavarria М, 2008).
В отличие от эпидемий гриппа, имеющих выраженную сезонность, аденовирусные инфекции регистрируются на протяжении всего года с наибольшим поражением детских групп населения (Echavarria М., 2008; Kuypers J., 2006; Levent F., 2009). Аденовирусы, как и вирусы гриппа, способны вызывать тяжелые поражения не только верхних, но и нижних отделов дыхательного тракта в виде пневмоний, бронхитов и бронхиолитов (Борисов Л.Б., 2001; Leung A.Y., 2005; Raboni S.M., 2003; Spenser К-А., 2007), а также других систем и органов (Ozbay Hosnut F., 2008; Walls Т., 2003). Известно, что аденовирусы являются причиной эпидемических вспышек фарингоконъюнктивальной лихорадки среди детей и новобранцев и возбудителями нозокомиальных заболеваний, в том числе, в офтальмологических отделениях. Аденовирусы вызывают также лимфоаденопатии, острые и хронические тонзиллиты, отиты, фарингиты, протекающие с явлениями интоксикации и гипертермии, поражения печени и миокарда (Казанцев А.П. и др., 1986; Raboni S.M., 2003; Ozbay Hosnut F., 2008). Отдельные серотипы аденовирусов (12, 18, 31, 40, 41) вызывают обширные вспышки гастроэнтеритов (Pang X.L., 2000; Saderi Н., 2002), а серотипы 12, 18 и 31 обладают повышенными онкогенными потенциями (Борисов Л.Б., 2001; Дяченко Н.С. и др., 1988). Появляется все больше данных о тяжелом генерализованном течении аденовирусных инфекций у пациентов с иммуносупрессией, которым -осуществляется трансплантация органов или костного мозга (van Kraaij M.G.J., 2005; KangG., 2002; Miura-Ochiai R., 2007), а также у онкологических больных при проведении химиотерапии (Gavin P.G., 2002; Walls Т., 2003). Подчеркивается также
важность распознавания аденовирусных инфекций у доноров органов в предоперационном периоде во избежание тяжелых осложнений, способных приводить к летальным исходам у реципиентов (Zheng X., 2008). Отмечен рост заболеваемости аденовирусной этиологии среди детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами в результате аварии на Чернобыльской АЭС (Соминина А.А. и др., 2007; Цыбалова Л.М. и др., 1997).
Эффективность надзора за аденовирусной инфекцией и ее терапии зависит от раннего диагностирования инфекции с ее дифференциацией от других вирусных заболеваний со сходными симптомами (Andreoletti L., 2000; Kang G., 2002), что определяет важность применения строго специфичных и высоко чувствительных методов дифференциальной лабораторной диагностики (Cicek С, 2007; Gavin P.G., 2003; Henrickson K.J., 2007). Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материалах от больных (Kinchington P.R., 2005; Kuypers J., 2006; Marinheiro J.C., 2009).
Для ранней дифференциальной диагностики ОРВИ, определяющей саму возможность своевременного проведения этиотропной противовирусной терапии, необходимо создание простых, быстрых и недорогих тестов, к числу которых относятся усовершенствованные варианты иммуноферментного (Егоров A.M. и др., 1991; PuppeW., 2004; Spencer К-А., 2007) и иммунофлуоресцентного анализа (Соминина А.А. и др., 2006; Cicek С, 2006; Kuypers J., 2006; Landry MX., 2000). Целесообразность их использования обоснована не только медицинскими показаниями, но и существенной экономической выгодой, достигаемой, главным образом, за счет отмены антибиотиков при острых респираторных инфекциях вирусной природы и сокращения сроков госпитализации как результат применения специфической противовирусной терапии (Percivalle Е., 2003; Takimoto S., 1991). Одним из ведущих направлений в области совершенствования
диагностических иммунотестов является введение в их состав моноклональных антител к возбудителям ОРВИ, обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов (Соминина А.А. и др., 2007; Rovida F., 2005).
Цель исследования. Целью настоящей работы явилось создание усовершенствованных тест-систем для диагностики аденовирусной инфекции.
Задачи исследования:
- разработка методики получения высокоочищенного гексонного
антигена аденовируса;
разработка технологии производства коньюгатов поликлонального типа с флуоресцеинизотиоцианатом для быстрой диагностики аденовирусной инфекции;
получение и скрининг моноклональных антител к различным сайтам в составе гексона аденовируса, общим для разных семейств аденовирусов;
- разработка технологии получения коньюгатов моноклональных
антител с флуоресцеинизотиоцианатом;
- дизайн новых моноклональных иммуноферментных тест-систем для
ранней диагностики аденовирусной инфекции;
- клинико-лабораторная апробация разработанных препаратов с
оценкой их диагностических параметров в сравнении с другими методами
(электронная микроскопия, ПЦР, выделение аденовирусов в культуре клеток,
серологический анализ).
Научная новизна работы. Научно обоснована целесообразность получения для диагностических целей моноклональных антител направленных к консервативным детерминантам в составе гексонного белка аденовируса.
Впервые в России детально отработана методика получения высокоочищенного (до кристаллического состояния) гексонного белка аденовирусов.
Впервые в России получена панель моноклональных антител к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа. Дана характеристика
биологических и диагностических свойств полученных моноклональных антител в различных иммунологических реакциях.
Экспериментально обосновано, что разработанные моноклональные антитела позволяют диагностировать заболевания, вызываемые аденовирусами, принадлежащими к различным группам (В, С, Е и F) семейства Adenoviridae.
Практическая значимость работы. Разработаны новые тест-системы для ранней диагностики аденовирусной инфекции на основе иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализа. В клинико-лабораторных исследованиях обоснована перспективность их применения в условиях практического здравоохранения как для индивидуальной диагностики в госпитальных условиях, так и для расшифровки природы эпидемических вспышек неясной этиологии, в т.ч. в отдаленных точках страны.
Впервые в России коньюгированы моноклональные антитела к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа с флуоресцеинизотиацианатом и пероксидазой хрена без снижения специфической активности препаратов.
Высокие показатели чувствительности и специфичности разработанной ИФТС «АДЕНОВИР» в сравнении с данными, полученными в ПЦР и при электронной микроскопии, позволяют рекомендовать ее для использования в лабораторной практике при диагностике аденовирусных инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
Полученные моноклональные антитела # 6 (МКА#6)к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа являются перспективными иммунореагентами и могут быть использованы в различных иммунологических тестах детекции аденовирусных антигенов.
Применение МКА # 6 к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа повышает чувствительность и специфичность ранее разработанных диагностических тестов.
Использование ФИТЦ-коньюгатов моноклональных антител позволяет выявлять аденовирусы, принадлежащие к различным группам (В,
С, Е) семейства аденовирусов и облегчает интерпретацию результатов за счет большей яркости специфической флуоресценции.
4. Разработанная иммуноферментная тест-система «Аденовир» характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью и может быть рекомендована для диагностики аденовирусной инфекции, как при респираторных, так и при кишечных формах заболевания.
Внедрение результатов в практику. Разработана научно-технологическая документация (НТД) на препарат «Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий антигексоновый аденовирусный» («ИДФАГ»). Регламент производства № 4429427-001-09 и технические условия № 93 8837-001-4429427-2008 на препарат «ИДФАГ» согласованы с ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Инструкция по применению № 01-11/131-08 от 15.08.2008г. утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ. Препарат «ИДФАГ» зарегистрирован на территории России (Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03940), внедрен в производство на базе ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» и используется в различных организациях практического здравоохранения (ФГУЗ ЦГЭ, глазные клиники, инфекционные стационары), включая сеть базовых лабораторий по мониторингу за гриппом и ОРВИ в составе Референс-центра при НИИ гриппа СЗО РАМН.
Материалы исследования используются в учебном процессе в курсе тематического усовершенствования, профессиональной переподготовки и сертификационном курсе по специальности «Вирусология» на базе ПДО СПб ГОУВ Государственной Медицинской академии им. И.И. Мечникова совместно с НИИ гриппа СЗО РАМН.
Апробация работы. Материалы исследования были доложены на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Республика Беларусь, Минск, 2007), на заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов (Россия, Санкт-Петербург, 2008) и на XXXI Итоговой научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционных
заболеваний у детей» (Россия, Санкт-Петербург, 2009), а также представлены на международной конференции «Options for the control of Influenza VI» (Канада, Торонто, 2007).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 20 работ, из них - 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 120 печатных листах, иллюстрирована 15 таблицами и 19 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 113 источников, из них 14 отечественных и 99 иностранных авторов, 5 приложений.
Личный вклад автора. Автор участвовала в разработке технологии
производства препарата «Иммуноглобулин диагностический
флуоресцирующий антигексоновый аденовирусный», широко внедренного в практику здравоохранения. При участии автора получены и полностью им охарактеризованы моноклональные антитела к гексонному антигену аденовируса. Лично автором изготовлены экспериментальные серии ФИТЦ-коньюгатов моноклинальных антител и изучена их специфическая активность в лабораторных и клинических условиях. Осуществлено конструирование и проведены испытания новой иммуноферментной тест-системы «АДЕНОВИР» моноклонального типа, предназначенной для индикации аденовирусных антигенов в матеиалах от больных. Проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов.
Диссертационное исследование выполнено в соответствии с плановой темой НИР НИИ гриппа СЗО РАМН № 012 «Дизайн, клинико-лабораторная апробация и внедрение новых диагностических тест-систем в практику этиологического надзора за гриппом и ОРЗ на территории России».
