Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время бесплодие в браке является важной проблемой фундаментальной биологии и практической медицины. В мире бесплодием страдают около 16% пар, приблизительно в половине случаев причиной оказывается снижение мужской фертильности. Мужское бесплодие может быть вызвано многими факторами, среди которых инфекции и воспалительные процессы мочеполового тракта занимают одно из первых мест [Тер-Аванесов Г.В., 2004]. Широко распространенными инфекционными агентами в человеческой популяции являются представители семейства Herpesviridae - вирусы простого герпеса (ВИГ) 1-го и 2-го типа, передающиеся половым путем. Присутствие ВИГ в эякулятах показано во многих исследованиях, однако его влияние на мужскую фертильность до конца не выяснено [Kaspersen М., Hollsberg Р., 2013]. Ряд данных [Бочарова Е.Н. и др., 2007; Науменко В.А. и др., 2011] позволяет предположить, что ВИГ может воздействовать на яички человека и повреждать сперматогенную ткань. Однако прямых доказательств этого пока не получено, что в значительной степени связано с недостатком адекватных моделей инфицирования семенников ВИГ in vivo. В результате крайне ограничены данные о путях проникновения вируса в яички, о степени поражения спер-матогенной ткани, об общем ходе течения инфекции и об ее исходе.
В то же время известно, что вирусные инфекции могут вызывать развитие хронического орхита [Dejucq N., Jegou В., 2001]. Орхит является одной из причин тяжелой формы мужского бесплодия, при которой в яичках отсутствуют зрелые гаметы, а значит, традиционные методы восстановления фертильности неэффективны. В настоящее время успехи в лечении таких форм бесплодия связывают с развитием клеточных технологий [Aponte P. et al., 2013]. Один из перспективных новых подходов для восстановления мужской фертильности предполагает трансплантацию в поврежденные яички половых и поддерживающих их развитие соматических клеток Сертоли. Источником аутологичных клеток для трансплантации могут быть клетки, выделенные из поврежденных яичек и размноженные в культуре, или клетки, полученные в результате трансдифференцировки соматических клеток пациента; доказательства принципиальной возможности такого подхода недавно появились в литературе [Zhu Y. et al., 2012; Buganim Y. et al, 2013]. Пока способ восстановления сперматогенеза путем трансплантаций клеток находится на стадии разработки и неизвестно, окажется ли он эффективным при клеточной терапии инфекционной патологии яичек человека. Использование трансплантаций клеток для восстановления сперматогенной функции на экспериментальной модели, имитирующей вирусную инфекцию яичек человека, может дать ответ на этот вопрос.
Цель исследования: Изучить воздействие ВПГ на сперматогенез мыши на модели восходящей инфекции и разработать способ восстановления сперматогенной функции после вирусной инфекции семенников. Задачи работы:
-
Разработать модель восходящего пути инфицирования семенников мыши ВПГ.
-
Изучить динамику ВПГ-инфекции семенников и определить локализацию вирусных маркеров в сперматогенной ткани.
-
Оценить воздействие ВПГ на структуру сперматогенного эпителия и дифференцировку половых клеток.
-
Изучить влияние ВПГ на проявление клеточного иммунитета в инфицированных гонадах.
-
Провести экспериментальный анализ эффективности трансплантации клеток семенников неонатальных мышей для возобновления сперматогенеза на примере химически поврежденных гонад.
-
Использовать метод клеточной трансплантации для восстановления сперматогенной функции мышей после заражения семенников ВПГ и оценить его эффективность.
Научная новизна
Разработана модель ВПГ-инфекции семенников половозрелой мыши, имитирующая восходящий путь инфицирования. С помощью этой модели впервые выявлена способность ВПГ инфицировать половые и соматические клетки семенников половозрелых животных in vivo и установлено, что герпесвирусная инфекция приводит к необратимым нарушениям структуры сперматогенной ткани, гибели половых клеток и остановке продукции мужских гамет. Впервые показано, что восходящая ВПГ-инфекция вызывает развитие воспалительного процесса в семенниках. На модели ВПГ-инфекции семенников мыши впервые разработан способ восстановления сперматогенной ткани с помощью клеточных технологий: показана эффективность использования трансплантаций клеток семенников неонатальных животных для восстановления сперматогенеза. Научно-практическая ценность
Модель ВПГ-инфекции семенников, созданная в ходе выполнения работы, раскрывает возможные пути влияния ВПГ на мужскую фертильность и может быть использована для изучения механизмов развития мужского бесплодия вирусной этиологии. Показана принципиальная возможность использования клеточных технологий для терапии мужского бесплодия вирусной этиологии.
Положения, выносимые на защиту:
-
Создана модель ВПГ-инфекции семенников половозрелой мыши, имитирующая восходящий путь инфицирования мужских гонад.
-
Вирусные ДНК, белки, а также капсиды и вирионы обнаружены как в половых, так и в соматических клетках семенных канальцев. Установлено, что инфекционная активность и маркеры ВПГ появляются в семенниках уже на 3 сут после заражения, инфекционный процесс достигает максимума на 6 сут и снижается к 10 сут после заражения. На поздних стадиях инфекционная активность вируса не выявляется, но ДНК и белки ВПГ присутствуют в некоторых клетках семенников.
-
Показано, что ВПГ негативно влияет на сперматогенную функцию: в ходе инфекции происходит дегенерация сперматогенного эпителия, гибель половых и соматических клеток семенных канальцев, остановка сперматогенеза; деструктивные изменения необратимы.
-
Доказано, что ВПГ-инфекция семенников приводит к развитию орхита: в интерстиции, начиная с ранних сроков инфекции, наблюдаются проявления воспалительного процесса, накапливаются CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты и макрофаги.
-
На модели необратимого химического нарушения сперматогенеза показана эффективность способа восстановления сперматогенной функции путем трансплантации клеток семенников неонатальных мышей.
-
Установлено, что трансплантация клеток неонатальных мышей в семенники взрослых животных, необратимо поврежденные в ходе ВПГ-инфекции, приводит к восстановлению сперматогенной ткани и образованию высоко дифференцированных половых клеток.
Апробация результатов исследования
Основные положения работы были представлены на 5-й междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2012); на 11-м Российском научно-образовательном форуме «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2013); на 23-й ежегодной конференции Общества вирусологов (Киль, 2013) и на 5-м конгрессе Европейского общества вирусологов (Лион, 2013). В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России 26 сентября 2013 г.
Публикации
По материалам исследования опубликовано 7 работ, из них 3 - в журналах, рекомендуемых ВАК России.
Личный вклад автора
Основные результаты получены лично автором. Ультраструктурные исследования проведены автором совместно со ст. науч. сотр. к.м.н. Науменко В.А. и вед. науч. сотр. к.б.н. Гущиной Е. А. (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России). Конфокальная микроскопия и цитофлуориметрический анализ проведены автором совместно с науч. сотр.
к.б.н. Кулибиным А.Ю. (ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН).
Объем и структура диссертации
Материал диссертации изложен на 128 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 25 рисунками, содержит 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 144 источника (11 отечественных и 133 зарубежных).
