Введение к работе
ВИЧ-инфекция - остается одной из наиболее актуальных проблем, вставших перед человечеством в конце XX века. Количество новых случаев ВИЧ-инфекции, показатель зараженности населения, удельный вес женщин среди ВИЧ-инфицированных, общее число детей с ВИЧ-1, смертей от СПИДа (синдром приобретенного иммунодефицита) продолжает возрастать как в целом мире, так и на территории нашей страны.
Использование высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) способствует снижению прогрессии заболевания и супрессии вирусной репликации. Современная ВААРТ позволяет значительно увеличивать продолжительность и качество жизни ВИЧ-инфицированных пациентов. Однако, широкое использование антиретровирусных препаратов (АРП) приводит к развитию лекарственной устойчивости, что обусловлено высокой частотой появления спонтанных мутаций в геноме ВИЧ-1. Описанные мутации устойчивости вируса к лекарственным препаратам, применяемых в химиотерапии при ВИЧ-инфекции, расположены в области гена рої, которая является одной из самых консервативных в геноме ВИЧ-1 и обеспечивает вирусную репликацию и морфогенез.
Ген рої ВИЧ-1 кодирует три специфических фермента: обратную транскриптазу (ОТ), вирусную протеазу (ВП) и интегразу (ИН). Мутации, возникающие в процессе антиВИЧ-терапии, можно разделить на два типа. Первые сами являются причиной лекарственной устойчивости и считаются первичными, в то время как другие мутации являются вторичными, или компенсаторными. Компенсаторные мутации могут быть ассоциированы с резистентностью только в том случае, если они присутствуют в комбинации с первичными мутациями устойчивости.
В зависимости от принципа действия и мишени современные АРП делятся на несколько классов: ингибиторы ОТ (нуклеозидные - НИОТ, ненуклеозидные - ННИОТ), ингибиторы протеазы (ИП), ингибиторы интегразы
2 (ИИН) и ингибиторы слияния. Первыми успешно апробированными клиническими препаратами против ВИЧ-1 стали ингибиторы ОТ нуклеозидной природы (азидотимидин или AZT, одобренный в 1987 г.). Однако, как показала практика, использование одного класса ингибиторов оказалось неэффективным. По этой причине предпочтение стали отдавать комбинированным схемам терапии, в частности одновременному использованию ингибиторов ОТ и ИП. Комбинированная терапия значительно улучшает качество жизни пациентов за счет поддержания иммунной системы на уровне, препятствующем возникновению оппортунистических инфекций.
Ранее нами был проведен анализ генетического полиморфизма области гена рої, кодирующей ОТ ВИЧ-1 в когорте ВИЧ-инфицированных, имеющих в качестве источника заражения единственного пациента «О», а также проведена оценка уровня лекарственной устойчивости у пациентов, получающих химиотерапию ингибиторами обратной транскриптазы (Пазилин, 2007). В настоящей работе нами проведен анализ генетической изменчивости области гена рої ВИЧ-1, кодирующей ВП и ИН у пациентов, получающих химиотерапию, в том числе и ингибиторами протеазы (ИП). По литературным данным основные сведения об описанных мутациях устойчивости к ИП были получены на основе изучения различных резистентных вариантов ВИЧ-1 субтипа В, редко встречающегося на территории Российской Федерации (РФ). В отношении других субтипов ВЙЧ-1 эти сведения носят отрывочный характер, поэтому нами была уточнена локализация мутаций лекарственной устойчивости в области гена рої, кодирующей ВП у вариантов вируса, циркулирующих на территории России.
В настоящее время на территории РФ предполагается широкое использование в лечении ВИЧ-инфекции ингибиторов ИН (ИИН). В связи с этим мы провели анализ генетического полиморфизма этого участка генома ВИЧ-1 и выявили наличие предсуществующих мутаций устойчивости к ИИН в нелеченых популяциях.
Подавляющее большинство ВИЧ-позитивных в России инфицированы вариантами вируса субтипа А (вспышка 1996 г.) и субтипа G (Ростово-Элистинская вспышка в 1989 г.). Настоящее исследование было проведено на двух группах пациентов. Первую группу составили пациенты внутрибольничной вспышки ВИЧ-инфекции в г. Ростов-на-Дону и г. Элисты (субтип G), вторую исследуемую группу составили пациенты Липецкой области (субтип А).
Исследование генетического полиморфизма, эволюции ВИЧ-1 и молекулярно-эпидемиологический мониторинг распространения ВИЧ-инфекции на территории РФ являются базисными для создания эффективных вакцин, диагностических тестов и новых лекарственных препаратов, способствует развитию новых подходов лечения ВИЧ-инфекции, в частности, использование ИИН.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования было изучение генетического полиморфизма области тени рої, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Определить первичные нуклеотидные последовательности гена рої, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации.
-
Провести анализ генетического полиморфизма области гена рої, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1: оценка уровня генетической изменчивости, характер и распределение мутаций.
-
Провести сравнение степени полимофизма гена интегразы ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации.
-
Провести анализ наличия мутаций устойчивости к ингибиторам протеазы и ингибиторам интегразы в исследуемых популяциях вирусов.
4 Научная новизна и практическая значимость.
1. Проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей,
кодирующих протеазу и интегразу ВИЧ-1, от пациентов юга России (г.
Ростов-на-Дону и г. Элиста) и Липецкой области.
2. Разработана система праймеров, позволяющая амплифицировать
полноразмерные гены, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1.
-
Полученные нуклеотидные последовательности, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1, депонированы в GeneBank.
-
Мутации устойчивости в протеазе ВИЧ-1, обеспечивающие резистентность к ингибиторам протеазы, у вариантов вируса субтипа G не отличаются от мутаций, характерных для вариантов вируса субтипа В. Единственным исключением является замена I54V/L, которая возникает у вариантов вируса субтипа G при использовании нелфинавира (NFV), в отличие от вирусов субтипа В.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Область гена рої, кодирующая протеазу ВИЧ-1, имеет низкий уровень генетической изменчивости (2,9%). Замены, возникающие в протеазе ВИЧ-1, имеют синонимический характер.
-
Мутации, возникающие при терапии ингибиторами протеазы у вариантов вируса субтипа G, не отличаются от соответствующих замен, характерных для субтипа В.
-
Функционально значимые участки интегразы ВИЧ-1 (район «цинковые пальцы»; DDE-мотив; «шарнирная петля»; аминокислоты, формирующие гидрофобную поверхность) являются высоко консервативными.
-
В популяциях ВИЧ-инфицированных пациентов, которые не подвергались действию ингибиторов интегразы, присутствуют мутации, потенциально ассоциированные с резистентностью к этому классу препаратов.
5 Объем и структура диссертации.
