Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Создание препаратов рекомбпнантных белков медицинского назначения
І.І. Изучение стабильности штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и разработка способов повышения их продуктивности 119
1.2. Получение рекомбинантных белков, предназначенных для использования в качестве противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и адъюваитов 130
1.2.1. Получение препаратов интерферона-гамма и его антагонистов, разработка технологий их очистки
1.2.2. Получение препаратов факторов некроза опухолей них антагонистов, разработка технологий их очистки
І.З.Полученне рекомбинантных белков - антигенов для создания вакцинных препаратов против вируса иммунодефицита (ВИЧ)
1.3.1. Получение белка-антигена TBI (кандидата в вакцины против ВИЧ-І)
1.3.2.Получение искусственного антигена ВИЧ-1 полиэпитопного белка TCI
Глава 2. Создание молекулярных конструкций вирусоподобных нанобиочастиц для получения на их основе лечебных и профилактических препаратов
2.1. Выбор и исследование полинуклеотидного комплекса для создания молекулярных конструкций вирусоподобных нанобиочастиц
- 2.2. Повышение нммупогеппости коротких пептидов с помощью вирусоподобных нанобиочастиц
2.3. Создание самособирающихся вирусоподобных нанобиочастиц - вакцинных препаратов на основе принципов аффинного взаимодействия компонентов
2.4. Создание вирусоподобных нанобиочастиц - вакцинных препаратов, содержащих белки, ковалентно связанные с матрицей
2.5. Подходы к разработке вирусоподобных нанобиочастиц для доставки генов в клетки с целью создания ДНК-вакцин и терапевтических препаратов
2.6. Конструирование искусственных иммуногенов — вирусоподобных нанобиочастиц - кандидатов в ДНК-белковые вакцины
2.7. Создание комбинированных искусственных иммуногенов - кандидатов в вакцины
Заключение 252
Часть V Выводы 257
Список опубликованных работ по теме диссертации 259
Часть VI Библиографический список 283
- Изучение стабильности штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и разработка способов повышения их продуктивности
- Получение рекомбинантных белков, предназначенных для использования в качестве противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и адъюваитов
- Выбор и исследование полинуклеотидного комплекса для создания молекулярных конструкций вирусоподобных нанобиочастиц
- Повышение нммупогеппости коротких пептидов с помощью вирусоподобных нанобиочастиц
Введение к работе
Актуальность проблемы
Инфекционные болезни остаются в современном мире одной из главных причин смертности, на их долю приходится до 30% регистрируемых летальных исходов на планете, что составляет 14-17 млн. случаев в год. В России ежегодно регистрируется до 35 млн. случаев инфекционных заболеваний, а прямые и косвенные потери от них составляют более 18 млрд. руб. (Онищенко Г.Г., 2002). Увеличение числа иммунодефицитных состояний и возникновение резистентности у патогенов к лекарственным препаратам делают актуальной разработку новых эффективных средств, как для лечения, так и для профилактики инфекционных заболеваний.
В настоящее время в медицинской практике начинают активно использоваться лекарственные препараты, полученные на основе технологии рекомбинантных ДНК. Созданы иммунобиологические препараты генно-инженерных белков: интерферона-а, интерлейкина-ір, интерлейкина-2, колониестимулирующих факторов и ряда других. Системный научный подход в сочетании с разработкой более совершенных технологий позволяют получать более эффективные и безопасные продукты. Сегодня на основе технологий рекомбинантных ДНК производится и разрабатывается ряд лекарственных средств, в том числе - цитокины. Цитокины относятся к сигнальным и эффекторным молекулам иммунной системы и обладают широким спектром биологической активности. Они определяют адекватный уровень иммунореактивности, с их участием осуществляется взаимодействие главных систем организма: иммунной, нервной, эндокринной. Они нашли применение при лечении таких социально значимых заболеваний как гепатиты, злокачественные новообразования, туберкулез. Поэтому разработка технологий получения этих препаратов в достаточных количествах является актуальной задачей. По подсчётам специалистов, ежегодный объём мирового рынка лекарственных средств на основе белков, созданных генно-инженерным путём, увеличивается на 15% и в 2010 году составит более 18 миллиардов долларов. Продукты биологического синтеза очень широко представлены в экономически развитых странах мира — США, Японии, Швейцарии, Германии. Это обеспечивает население защитой от инфекций, повышает уровень здоровья нации и способствует биологической безопасности государств.
Технологии рекомбинантных ДНК активно используются и при создании профилактических препаратов, в частности вакцин. Вакцинация является решающим фактором снижения детской смертности, увеличения продолжительности и улучшения качества жизни всех возрастных групп населения. По данным ВОЗ, вакцины ежегодно спасают жизнь 3 млн. детей. В настоящее время на разных стадиях экспериментальной разработки и клинических испытаний находятся вакцины, направленные на профилактику более 60-ти видов заболеваний. Современная вакцинология стремится к созданию более совершенных вакцин, которые должны быть эффективны, безопасны и не иметь побочных свойств (Медуницин Н.В., 2004).
Повышение требований к безвредности и чистоте препаратов стимулировало не только совершенствование традиционной вакцинологии, но и создание нового поколения искусственных вакцин: субъединичных, рекомбинантных, антиидиотипических, ДНК-вакцин, пероральных вакцин и др. (Семенов Б.Ф., 2009). Необходимость разработки новых вакцин связана также с решением проблемы борьбы с еще не побежденными инфекциями. Среди них особую тревогу вызывают СПИД гепатит, туберкулез. На сегодняшний день они входят в число наиболее социально значимых инфекционных заболеваний. Для получения таких вакцин необходимо, с одной стороны, генерировать новые идеи их создания, а с другой - решать технологические задачи, возникающие на каждом этапе продвижения препарата к потребительской форме.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы является получение иммунобиологических препаратов на основе рекомбинантных белков и ДНК для лечения и профилактики заболеваний человека.
В связи с целью исследования необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать методы повышения эффективности биосинтеза
рекомбинантных цитокинов бактериальными продуцентами (на примере
TNF-oc, TNF-p, G-CSF и GM-CSF).
2. Получить рекомбинантные белки для создания на их основе средств
терапии и профилактики инфекционных и неинфекционных заболеваний,
разработать технологии их выделения и очистки:
препараты рекомбинантного человеческого интерферона-у и его антагонистов;
препараты рекомбинантных цитокинов - факторов некроза опухолей и их антагонистов;
рекомбинантные антигены вируса иммунодефицита человека для создания вакцинных препаратов против ВИЧ/СПИД
3. Создать молекулярные конструкции вирусоподобных нанобиочастиц в
качестве вакцинных препаратов и получить их экспериментальные образцы
на основе:
двуспиральной РНК и пептидов,
двуспиральной РНК и рекомбинантных белков,
рекомбинантных ДНК
рекомбинантных ДНК и рекомбинантных белков.
-
Оценить иммунный ответ при иммунизации лабораторных животных созданными молекулярными конструкциями.
-
Исследовать влияние созданных препаратов цитокинов на иммунный ответ при их добавлении в состав разработанных экспериментальных вакцин.
Научная новизна и практическая значимость работы Впервые разработаны и внедрены методы повышения продуктивности рекомбинантных штаммов с плазмидами, содержащими в качестве генетического маркера ген Ыа, продуцирующих целевые белки-цитокины (патенты РФ № 2122580, № 2158303).
Разработаны технологии получения особо чистых препаратов рекомбинантных белков - цитокинов (патенты РФ № 2048521, № 2132389, № 2326944) и белков-антигенов, для создания на их основе вакцины против ВИЧ/ СПИД. На разработки оформлена научно-техническая документация по производству и контролю качества и проекты фармакопейных статей. Предложены методы очистки антагонистов интерферона и факторов некроза опухолей (патент РФ № 2376375).
Впервые предложены молекулярные конструкции, предназначенные для создания вакцинных композиций на основе искусственных вирусоподобных частиц с полинуклеотидным комплексом (ДНК или дсРНК) в центре и белками - на поверхности (патент РФ № 2217162).
Впервые показано, что полианионная оболочка плазмидной ДНК, состоящая из конъюгата полиглюкин-спермидин, способствует пролонгации циркуляции вводимого генетического материала в организме и проникновению его в клетки (патент РФ № 2190018).
Созданы экспериментальные вакцины против таких инфекций как ВИЧ/СПИД («ТВІ-ВПЧ» и «КомбиВИЧвак») (патент РФ №2317107) и туберкулез («Миковакс») (патент РФ № 2242245).
Впервые показано, что презентация иммунной системе искусственного антигена ВИЧ - белка TBI в составе нанобиочастиц способствует пролонгации иммунного ответа на этот белок и вызывает адъювантный эффект, сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда.
Впервые показано, что молекулярная конструкция позволяет экспонировать на поверхности частиц антигенные детерминанты белков одного вируса и доставлять плазмиды с генами, кодирующими синтез белков-антигенов другого вируса, в антиген-презентирующие клетки. С использованием предложенного подхода созданы конструкции комбинированных искусственных иммуногенов, способные вызвать индукцию специфических антител против ВИЧ-1 и вируса клещевого энцефалита. Исследована интенсивность и продолжительность гуморального и клеточного иммунных ответов на эти иммуногены.
В итоге предложено новое направление в создании вакцинных и терапевтических препаратов на основе рекомбинантных молекул белков и ДНК в виде вирусоподобных нанобиочастиц.
Продемонстрировано, что интерферон-у в составе вакцинного препарата против туберкулеза способствует усилению клеточного иммунного ответа на вакцину.
Доклинические испытания экспериментальных серий вакцин против ВИЧ/ СПИД показали, что они индуцируют специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ. На кандидатные вакцины ТВІ-ВПЧ и КомбиВИЧвак оформлена научно-техническая документация на производство и контроль качества вакцин. Вакцина КомбиВИЧвак прошла предварительную регистрацию в Министерстве здравоохранения и социального развития РФ. В настоящее время получено разрешение от
Комитета медицинских иммунобиологических препаратов (протокол №6 от 24 декабря 2009г.) на проведение 1 фазы клинических испытаний.
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработанный комплекс методов позволяет повысить содержание цитокинов в биомассах штаммов-продуцентов рекомбинантных белков, содержащих в плазмиде ген Ыа.
-
Созданные технологии выделения и очистки позволяют получать высокоочищенные препараты рекомбинантных белков медико-биологического назначения: интерферона-у, факторов некроза опухолей, а так же препараты их антагонистов (рецепторов).
-
Технологии выделения и очистки искусственных рекомбинантных полиэпитопных белков-антигенов вируса иммунодефицита человека (TBI и TCI) позволяют получать высокоочищенные препараты для создания и исследования кандидатных вакцин против ВИЧ/ СПИД.
4. Созданная модель молекулярной конструкции нанобиочастиц
эффективна для конструирования вакцинных композиций на основе
искусственных вирусоподобных частиц содержащих полинуклеотидный
комплекс (ДНК или дсРНК) в центре и белки-антигены - на поверхности.
5. Искусственные вирусоподобные частицы, полученные на основе
самосборки за счет ионных и аффинных взаимодействий компонентов,
содержащие дсРНК, конъюгат (декстран с субстратом фермента и
спермидином) и гибридные белки, состоящие из фермента и антигена,
обладают высокой иммуногенностью, обеспечивают пролонгированное
образование антител.
6. Искусственные вирусоподобные частицы с дсРНК в центре,
содержащие белки, ковалентно связанные с матрицей (конъюгат из декстрана
с спермидином и белками), могут экспонировать на своей поверхности
полный репертуар белков патогена и обладают высокой иммуногенностью.
-
Полианионная оболочка для плазмид, предназначенных для иммунизации, состоящая из конъюгата полиглюкин-спермидин, способствует пролонгации циркуляции ДНК плазмид в организме и проникновению ее в клетки.
-
На основе модели вирусоподобных частиц можно создавать конструкции, экспонирующие на поверхности антигенные детерминанты белков одного вируса и доставляющие плазмиды с генами, кодирующими синтез белков-антигенов другого вируса, в антиген-презентирующие клетки.
Апробация работы
Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: VII Intern. Conf. Comparative and applied virology" (Montreal,Quebec, Canada, 1994); «II Intern, congress of immunoreabilitation» (Antalia, Turkey, 1996); First Jeint Meeting of the'TCS and ISICR" (Geneva, Switzerland, 1996); «Современная вакцинология» (Пермь, 1998); международные конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1999-2002г.); «Молекулярная медицина» (Пущино, 2001); "DNA
vaccines" (Edinburg, UK, 2002); "International Congress of Virology"1996, 2002; «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004); "Вакцинология 2006", Москва; «International symp. on HIV and emerging infectious diseases» (Toulon, Franse, 2008); «Междунар. конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилитации» (Тель-Авив, Израиль, 2009) и на других конференциях.
Работа выполнена во ФГуН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках научных тем организации и по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: «Защита от патогенов», по Федеральной Государственной программе "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего", гранту РФФИ № 00-04-49508 «Теоретическое и экспериментальное моделирование искусственных иммуногенов - кандидатов в вакцины», грантам МНТЦ № 1465,1685, 2464, 2547, 2641, 2914.
По теме диссертации опубликовано 83 научных статьи, в том числе 69 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации, 90 тезисов докладов Получено 11 патентов Российской Федерации на изобретения, три из них удостоены дипломов в номинации «100 лучших изобретений России»..
Структура и объем работы
Диссертация состоит из 7 разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы и Список литературы. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста, содержит 66 рисунков, 28 таблиц. Библиография представлена 429 источниками отечественных и зарубежных авторов.
Личный вклад автора
Участие автора при проведении исследований по диссертации заключается в личном участии практически во всех теоретических и экспериментальных работах по получению иммунобиологических препаратов на основе рекомбинантных молекул. Основные разделы представленного исследования выполнены автором самостоятельно, насколько это возможно при выполнении докторских диссертационных работ.
Изучение стабильности штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и разработка способов повышения их продуктивности
Для иммунизации были использованы мыши линии BALB/c, весом 15-17 граммов, полученные из питомника лабораторных животных ГНЦ ВБ "Вектор". Животные содержались на стандартном рационе. Все манипуляции с животными проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством.
Применяли несколько способов иммунизации:
1) внутримышечное введение рекомбинантных белков в физиологическом растворе в объеме 100 мкл совместно с полным или неполным адъювантом Фрейнда;
2) внутримышечное введение экспериментальных ДНК вакцин в физиологическом растворе в объеме 100 мкл;
3) внутримышечное введение препаратов вирусоподобных частиц в физиологическом растворе в объеме 100 мкл;
Забор крови производили из ретроорбитального синуса. Эвтаназия животных осуществлялась методом цервикальной дислокации.
Для иммуноферментного анализа антиген (рекомбинантные белки: GST-ТВІ, GSTCI; лизат вируса ВИЧ-1) разводили в буфере PBS до концентрации 1 мкг/мл и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета CORNING. Инкубировали в течение ночи при 4С. После удаления АГ лунки промывали три раза буфером 0,1%PBSween 20. Места неспецифического связывания насыщали 3% раствором казеина в буфере PBS, при 37С 2 часа. После этого лунки вновь промывали трижды буфером 0,1%PBSween 20. Вносили по 100 мкл/лунку последовательных разведений сыворотки в буфере PBS с 3% казеином. Инкубировали при покачивании 1 час при 37 С. Промывали трижды буфером 0,1% PBSween 20. Специфически связавшиеся антитела выявляли с помощью меченных пероксидазой антител кролика против IgG мыши в разведении 1/10000. Инкубировали 1 час при 37С. После трехкратной промывки 0,1 % PBSween в лунки добавляли хромоген - ТМБ в цитратно-фосфатном буфере и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали внесением 100 мкл/лунку серной кислоты. Результат регистрировали при длине волны 450 нм.
Для выявления специфических антител к рекомбинантным белкам - gag, gpl20, envl и env2 ВИЧ-1 использовали планшеты «Тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа - Антиген», производства «Вектор-БиАльгам» и тест-систему Унибест-ВИЧ 1,2 AT (ЗАО «Вектор-Бест»), В «Тест-системах,,.» коньюгат против IgG человека был заменен на коньюгат против IgG мыши в разведении 1:100000. Проведение реакции совпадало с вышеописанной процедурой ИФА.
Иммуноблоттинг проводили с использованием нитроцеллюлозных фильтров с сорбированными белками ВИЧ-1 коммерческих тест-систем «New-Lav-Blot 1» (Bio-Rad) и «Блот-ВИЧ 1/2+ О» («ЗАО Боисервис», Россия). При исследовании специфичности мышиных сывороток иммуноблоттинг проводили согласно инструкции по применению к тест-системам, за исключением того что конъюгат против IgG человека был заменен на коньюгат против IgG мыши с пероксидазой хрена («Sigma»),
Реакция бласт-трансформации спленоцитов была проведена совместно с Г.М.Игнатьевым и А.Е. Нестеровым (ГНЦ ВБ "Вектор") по ранее описанной методике [153]. В качестве специфических антигенов использовали очищенный инактивированный ВИЧ-1, в качестве неспецифического антигена - очищенный инактивированный у-излучением вирус энтерита норки. В качестве митогена использовали конканавалин А (пр-во "Sigma", США) в концентрации 5 мкг/мл. Клетки, стимулированные антигенами, инкубировали в течение 78 ч. За 18 ч до окончания срока инкубации вносили 3Н-тимидин в дозе 2 мкКи на лунку. Клеточный ответ оценивали по показателю индекса стимуляции, который характеризует отношение пролиферации спленоцитов, индуцированных специфическими антигенами, к спонтанной пролиферации спленоцитов.
. Определение специфических IFN-у-продуцирующих клеток в реакции ELISPOT Тест проводился с использованием наборов фирмы "BD" (США). При постановке реакции ELISPOT на первом этапе проводили сорбцию анти-IFN у- моноклональных антител с концентрацией 5 мкг/мл на лунку 96-луночного планшета ImmunoSpot М200. После инкубации в течение 12 часов при 4С каждую лунку дважды промывали раствором PBS и блокировали средой RPMI-1640, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку в течение 2 часов. В качестве клеток-эффекторов использовали спленоциты иммунизированных животных в концентрации 10 /мл. Для стимуляции клеток использовали белок ТСІ (1 мкг/мл) и два пептида: Р15 (DRVIEVVQGAYRAIR), Р16 (KQIINMWQEVGKAMYA), для оценки неспецифической продукции использовали белок ЕНЕС (неинфекционный штамм Е.соН). Клетки культивировали в присутствии 5% С02 при 37С в течение 24 часов. IFN-y-секретирующие клетки визуализировали, используя 0,5 мкг/мл биотинилированнных анти- IFN-y-антитела и 0,25 мкг/мл конъюгата Avidin-HRP. Окрашивание производили добавлением субстратов для пероксидазы (4-хлор-1-нафтол, диаминобензидин фосфат). Реакцию останавливали удалением реагентов, лунки промывали 3 раза дистиллированной водой. Подсчет количества IFN-у-продуцирующих клеток осуществляли с помощью микроскопа. Результаты оценивали как количество IFN-у-продуцирующих клеток на 10 спленоцитов. 21.6. Реакция вирусной нейтрализации
Реакцию нейтрализации проводили, используя дозу вируса, равную 100 ТСГО5о- В реакции вируснейтрализации были использованы несколько штаммов ВИЧ-1:
1)ГКВ-4046 (выделен в лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ "Вектор" НИИ молекулярной биологии, депонент 4046);
2) ВИЧ-1-899А (получен в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, г. Москва);
3) ГКВ-4005 (ВИЧ-1Еук) (выделен в лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ "Вектор" НИИ молекулярной биологии, депонент 4005).
Получение рекомбинантных белков, предназначенных для использования в качестве противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и адъюваитов
Интенферон-гамма (IFN-y) является полифункциональным белком, вырабатываемым клетками иммунной системы (иммунный интерферон), обладает иммуностимулирующей, противоопухолевой, и антивирусной активностями. Иммунный интерферон (IFN-y) используется в качестве компонента лекарственных средств, предназначенных для лечения ряда вирусных, онкологических и аутоиммунных заболеваний. За рубежом создан лекарственных препаратов на его основе: «Иммунерон» (США : - :. В России разработки олучения препарата на основе IFN-y проводились в Институте прикладной микробиологии (г.Протвино), в ООО «Фармаклон» (г. Пущино) ВБ «Вуктор». Препараты имеют высокую цену, обусловленную ;:л;ЕШШ Ш;сложностью;: "производств способов получения рекомбинантного IFN-y является актуальной задачей.
В качестве продуцента для наработки биомассы использовали генетически трансформированный штамм Е.coli, накапливающий иммунный интерферон в виде телец включения - штамм Е. coli Affl7/pIFN-Yrp2, в котором экспрессия гена гамма-интерферона контролируется промотором триптофанового оперона .coli. Уровень биосинтеза иммунного интерферона при конститутивном синтезе составляет порядка 10 % от общего белка. . клетки и около 25 % - при индукции триптофіанового промотора [382]. Ферментацию проводили в колбах на среде М9 [80] с добавлением казаминовых кислот (2 г/л) и. тетрациклина (20 мкг/мл), при 37 С и частоте вращения качалки 160 мин-1 до конца логарифмической фазы роста.
При разработке схемы очистки интерферона-гамма мы использовали схему хроматографии на катионообменном сорбенте. Это обусловлено тем, что значение изоэлектрической точки этого белка выше значения 8,5 и на анионообменных сорбентах его сорбция затруднена. Согласно работе [420] изоэлектрическая точка IFN-y соответствует значению 8,6-8,7.
Для получения телец включения, содержащих IFN-y, суспензию клеток в буфере А (20 мМ Трис-НС1. рН 8,3) подвергали обработке ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т до снижения в ней оптической плотности при длине волны 550 нм до 55-65% от исходной. Тельца включения осаждали центрифугированием и дважды промывали буфером А, содержащим 1 мМ ZnCl2 0,1 мМ CuCl2 и 0,5 мМ PMSF. Их дополнительно промывали раствором мочевины - 4 моль/л и проводили экстракцию IFN-y раствором 5M Gnd-Cl в буфере А при перемешивании в течение двух-трех часов при комнатной температуре. Клеточный дебрис и нерастворившиеся белки отделяли центрифугированием. Практически весь белок IFN-y при этом находился в растворе гуанидин хлорида. Для проведения хроматографической очистки Gnd-Cl удаляли диализом раствора белка против буфера А, содержащего мочевину, 8 моль/л и 0,1% Тритон Х-100 и 0,1% ПЭГ 6000.
Для проведения хроматографии использовали колонку с КМ-сефарозой (Amersham Biosciences, Швеция). После нанесения раствора колонку промывали тем же буфером и проводили элюцию белков. Для элюции интерферона с колонки был разработан состав градиента: 25 мМ Трис-НС1, рН 8,3 - 25 мМ ацетат натрия, рН 5,8 с 0,8 М NaCl. Оба раствора содержали мочевину. 8 моль/л. Элюция целевого белка наблюдалась при концентрации NaCl около 0,4 М (анализ фракций проводили при помощи гель-электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях). Как видно на рис. 12 целевой белок смывается с колонки лишь с незначительными примесями клеточных белков в фракциях, соответствующих началу его элюции.
Профиль первой хроматографии IFN-y на КМ-сефарозе. Электрофореграмма аликвот раствора белка из фракций в 13%-ном ПААГ.
Изменение значения рН в ходе элюции способствовало "растягиванию" процесса десорбции белков, тем самым позволяя "раздвинуть" пики выходов целевого белка и примесных и собрать более чистую фракцию препарата.
Фракции, содержащие IFN-y, объединяли, разбавляли в три раза буфером, содержащим мочевину (8 моль/), и для доочистки белка проводили рехроматографию на КМ-сефарозе. Для элюции интерферона с колонки при второй хроматографии использовали состав градиента: 25 мМ ацетат натрия, рН 5,8 - 25 мМ Трис-HCl, рН 8,0 с 1 М NaCl.
Оба раствора содержали мочевину. 8 моль/л. При этом целевой белок элюировался при концентрации NaCl около 0,5 М. Фракции, содержащие ИНФ-у, объединяли и проводили его ренатурацию. Для этого раствор разбавляли в два раза буфером А и перемешивали в течение 3 ч при температуре 4С. Далее раствор белка вновь разбавляли в два раза и инкубировали при перемешивании в течение 5 ч. Затем полученный раствор белка диализовали против буфера (10 мМ трис-ацетат, рН 6,0 и 0,9% NaCl) в течение ночи при температуре 4С. Чистота белка была не менее 98%, удельная активность (5-10) х 10 МЕ/мг, выход 0,9-1,5 мг из 1 г клеток.
При выборе состава лекарственной формы были апробированы различные вещества: моно- и полисахариды, аминокислоты, рибонуклеиновые кислоты, гепарин и пр. Для этого в раствор с препаратом интерферона вносили исследуемое вещество и затем - трипсин (10 мкг/мл). Через промежутки времени отбирали аликвоты раствора, белки переосаждали спиртом и анализировали продукты деградации электрофорезом в 15%-ом ПААГ (рис. 13). Пример исследования степени трипсинолиза от добавок аминокислот (1 мг/мл при концентрации ИНФ-у 1 мг/мл) представлен на рис. 14.
Выбор и исследование полинуклеотидного комплекса для создания молекулярных конструкций вирусоподобных нанобиочастиц
Вирусные частицы состоят из полинуклеотидного комплекса (молекулы РНК или ДНК), покрытого белками. При создании молекулярной конструкции вакцинных препаратов мы ориентировались на модель строения вирусов. В качестве полинуклеотидного комплекса необходимо было выбрать нуклеиновую кислоту, не содержащую гены патогенности и в то же время, стимулирующую иммунный ответ.
Среди существующих в настоящее время средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний можно выделить специфические (вакцины и иммуноглобулины) и неспецифические средства (селективные противовирусные средства и неселективные средства, к которым можно отнести интерфероны и их индукторы).
В настоящее время все большей популярностью в клинической практике пользуются индукторы интерферона, которые при введении в организм вызывают активацию макрофагов и нейтрофилов, натуральных киллеров, стимулируют образование эндогенных цитокинов, усиливают Т- и В-клеточный иммунный ответ. Показано, что дсРНК при ее применении отдельно или в комплексе с другими противовирусными препаратами усиливают образование активированными макрофагами свободных радикалов азота и кислорода. Двуспиральные РНК взаимодействуют с рецептором TLR-3, находящимся на поверхности клеток, и вызывают интерфероногенез. Фрагменты дсРНК и оцРНК взаимодействуют с рецепторами TLR-7, -8, -9 в цитоплазме клеток. Состав и длина цепи РНК влияют на её биологическую активность.
К таким препаратам относятся разработанные в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора препараты Ридостин и Рифастин. Основой препарата Ридостин является смесь двуспиральной РНК (дсРНК) и высокополимерной одноцепочечной РНК (оцРНК) киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae. ДсРНК Sac. cerevisiae представлена L- и М-формами (L-форма - 4500 пар оснований (п.о.), М-форма - ІбООп.о.). Как показали результаты медико-биологических исследований, препарат обладает широким спектром действия на систему цитокинов, усиливает активность фагоцитов, нормализует показатели Т-клеточного иммунитета, ингибирует размножение внутриклеточных микроорганизмов и вирусов.
В совместных работах с ИХБФМ СО РАН исследована способность двуспиральных РНК ингибировать размножение вируса гриппа. Показано, что введение Ридостина в концентрации от 1 до 160 мкг/мл в аллонтоисную жидкость куриного эмбриона сразу после заражения ингибирует размножение в них вируса гриппа. Титр вируса снижается в 2.5 и в И раз после добавления 10 и 100 мкг/мл дсРНК, соответственно. В случае добавления дсРНК к куриным эмбрионам через 2 часа после заражения вирусом гриппа титр вируса при добавлении 10 мкг/мл и 80 мкг/мл Ридостина снижался в 2,5 и в 3 раза, соответственно.
Двуспиральная РНК Saccharomyces cerevisiae была очищена из общего пула клеточных РНК и получены препараты индивидуальных L-формы и М-формы. Для исследования влияния длины дсРНК Sac. cerevisiae на интерферониндуцирующую активность методом ограниченного гидролиза РНКазой (отбор проб по времени и осаждение этанолом) были получены пулы фрагментов дсРНК (рис. 33)
Было исследовано влияние длины дсРНК на интерферониндуцирующую активность. Показано, что наблюдается линейная зависимость титра интерферона от длины цепи РНК в диапазоне 4500 п.о - 150 п.о. (рис. 34). Препараты дсРНК длиной менее 100-150 пар оснований практически не вызывают биосинтеза интерферона в организме.
В данном случае, вероятно, на фагоцитарную функцию может влиять не только количество составляющих молекулу пар нуклеотидов, но и их состав.
Двуспиральная РНК фага ф-6 другого препарата, Рифастин, также обладает интерферониндуцирующей активностью. ДсРНК фага ф-6 состоит из 3-х сегментов с молекулярной массой 2900, 4100 и 6400 пар оснований и, вероятно, имеет иной нуклеотидный состав, чем дсРНК Sac. cerevisiae. В экспериментах по исследованию интерферониндуцирующей активности (при одинаковых вводимых дозах) титр интерферонов был выше от препарата дсРНК фага ф-6. И если после введения дсРНК Sac. cerevisiae через 48ч титр интерферонов снижался до исходного, то для дсРНК фага (р-6 он превышал исходный показатель в 2-3 раза (8-Ю Ед/мл против 2-4).
В связи с тем, что для препарата Ридостин, в отличие от Рифастина, проведены клинические испытания и он допущен к применению в медицинской практике, при создании вакцинных молекулярных конструкций для «центрального ядра» мы выбрали дсРНК Sac. cerevisiae. Причем обе формы (L- и М, в соотношении 1:1), так как они по разному влияют на интерфероногенез и фагоцитарную активность макрофагов, дополняя друг друга.
Механизм противовирусного действия двуспиральной РНК на молекулярном уровне можно объяснить тем, что при появлении в клетке необычных РНК-структур (двухцепочечной РНК) запускается антивирусный ответ. дсРНК активирует 2 -5 -олигоаденилат синтетазу (ОAS). Этот фермент превращает АТФ в 2 ,5 -linked oligoadenylate (2-5А). 2-5А, в свою очередь, активирует РНКазу L, которая обладает способностью фрагментировать вирусную РНК на мелкие «кусочки», узнаваемые факторами RIG-1 и MDA5. Активированная РНКаза L гидролизует не только вирусную, но и клеточную РНК. Она как бы "амплифицирует" вирусную РНК. При первых признаках появления вирусной инфекции РНКаза L начинает гидролизовать обыкновенную клеточную РНК, превращая ее в субстрат, узнаваемый факторами RIG-1 и MDA5. В результате факторы RIG-1 и MDA5 оказываются избавленными от необходимости узнавать вирусную РНК напрямую, а значит, возрастает эффективность антивирусного ответа.
Таким образом, для стимуляции иммунного ответа при иммунизации достаточно использовать небольшие дозы дсРНК в составе вакцинного препарата.
Повышение нммупогеппости коротких пептидов с помощью вирусоподобных нанобиочастиц
Одним из перспективных направлений иммунопрофилактики является разработка вакцин на основе синтетических пептидов [60,265]. Синтетические вакцины обладают высокой степенью стандартности, обладают слабой реактогенностью, они свободны от многих недостатков, присущих живым и инактивированным вакцинам, таких как: возврат патогенности, остаточная вирулентность, неполная инактивация и т.д. К слабой стороне пептидных вакцин следует отнести сравнительно небольшие молекулярные массы синтезированных полипептидов-иммуногенов. Поэтому при иммунизации используют различные адъюванты, что не всегда желательно, т.к. вызывает побочные эффекты.
В данной работе на примере дизайна иммуногена на основе фрагмента HLDF (фактор дифференцировки [9,375]) - шестичленного пептида (HLDF6 = Thr-GIy-GIu-Asn-His-Arg) предложен способ решения проблемы представления синтетических пептидов клеткам иммунной системы путём создания молекулярной конструкции, которая является иммуногеном по ряду параметров: содержит пептиды, обуславливающие антигенные свойства, стимулятор иммунного ответа и имеет мол. массу, сравнимую с мол. массами вирусов.
HLDF6 имеет незначительную молекулярную массу и проявляет слабо выраженную способность вызывать синтез антител. Поэтому был теоретически рассчитан и практически сконструирован искусственный корпускулярный иммуноген. Конструкция представляет собой вирусоподобную частицу, в центральной части которой содержится дву спиральная РЬЖ из дрожжей Saccharomyces cerevisia М437 Y116 (основной компонент лекарственного препарата "ридостип" [149] разработанного в ГНЦ ВБ «Вектор»), а на поверхности - пептиды HLDF6 в составе конъюгата с полианионом.
Шестичленный полипептид (фрагмент HLDF) был синтезирован в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Получение конъюгата проводили по схеме, описанной в разделе «материалы и методы». Для этого 2 мг полиглюкина и 0,3 мг периодата натрия растворяли в 100 мкл воды, инкубировали 60 мин при температуре 20 С и периодат натрия удаляли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 8,5. Добавляли 0, 5 мг пептида HLDF6 и 0,06 мг спермидина. Инкубировали 5ч при температуре 6 С и для очистки конъюгата проводили гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-10 в физиологическом растворе. Для сборки иммуногена к раствору дсРНК (0,6 мг) (с чистотой не менее 95%, см. материалы и методы) .добавляли полученный конъюгат, инкубировали 60 мин при температуре 6 С и образовавшуюся молекулярную конструкцию отделяли гель-фильтрацией на сефарозе CL-бВ.в изотоническом, растворе.
Вид полученных микрочастиц, рассчитанный теоретически, схематично представлен на рис. 38А. На электрофореграмме в агарозном геле (рис. 38Б) видно, что двуспиральная РНК (L и М формы), покрытая конъюгатом полиглюкин-спермидин-НЬОРб, имеет меньшую подвижность по сравнению с исходной РНК. Снижение электрофоретической подвижности РНК можно объяснить увеличением её молекулярной массы за счет образования прочного комплекса с коньюгатом и частичной нейтрализацией в комплексе отрицательного заряда РНК положительно заряженным спермидином.
Соотношение компонентов в молекулярной конструкции было выбрано таким образом, чтобы на 1 молекулу дсРНК приходилось около 100 молекул конъюгата и соответственно, около 2000 молекул пептида HLDF6.
С целью изучения иммунного ответа на искусственные вирусоподобные частицы, экспонирующие пептид HLDF6, была проведена иммунизация мышей линии BALB/c. Иммуноген вводили подкожно трехкратно с двухнедельными интервалами. Однократная доза иммунизации составляла 100 мкг (по пептиду) в объёме 0,1 мл на животное. В качестве положительного контроля использовали неконъюгированный HLDF6 (100 мкг на иммунизацию, трехкратно, с интервалом в две недели). Через десять дней после последней иммунизации проводили взятие крови и приготовление сывороток для определения титра антител к пептиду HLDF6.
Определение титра антител к HLDF6 проводили иммуноферментным анализом. В качестве антигенов для подложки использовали HLDF6, его конъюгат с полиглюкином, а также полноразмерный белок HLDF, любезно представленный нам доктором И.А.Костанян из ИОХ им. ММ.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. Антигены в конечной концентрации 5 мкг/мл в объеме 100 мкл сорбировали в течение ночи в полистироловых планшетах. Для титрования использовали последовательные трехкратные разведения сывороток, начиная с 1:20. Связавшиеся специфические антитела выявляли с помощью конъюгата антител кролика против IgG мыши с пероксидазой хрена ("Sigma").
Специфические антитела в сыворотках мышей, иммунизированных молекулярной конструкцией, обнаруживались при сорбции на подложке всех использованных антигенов (полипептид HLDF6, его конъюгат с полиглюкином, а также полноразмерный белок HLDF). Положительный сигнал, достоверно превышающий фоновый, выявлялся при разведении сывороток от 1:320 до -1:1280. При использовании для иммунизации неконъюгированного HLDF6 титр в сыворотках не превышал 1:20 - 1:60. После иммунизации линейными пептидами в составе адъюванта Фрейнда регистрировали уровень специфичных IgG 1:640.
Таким образом, в результате проведенных исследований были подобраны концентрации компонентов и условия синтеза конъюгатов для создания конструкций на основе синтетических пептидов и двуспиральной РНК. Обладая значительной молекулярной массой и размерами, сравнимыми с размерами вирусов, иммуногены не требуют использования адъювантов. Показано, что при иммунизации лабораторных животных (мышей), созданные частицы индуцируют выраженный гуморальный иммунный ответ. Предложенный подход универсален и может быть использован при создании широкого спектра иммуногенов и вакцин на основе полипептидов..
