Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Рост растений в свете современных представлений о внутриклеточной регуляции 9
1.2. Общие сведения о ферментах 16
1.3. Развитие зародыша семян растений. Современные представления о структуре хроматина и изменениях в ней под действием биологически активных соединений 25
1.4. Действие фитогормонов на хроматин , 34
1.5. Физические методы исследования хроматина 37
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования .
2.1. Использованные препараты 40
2.2. Выдетение препаратов 40
2.3. Приготовление комплексов ДНК с белками 47
2.4. Измерение активностей ферментов . 48
2.5. Измерение включения %-меченных уридина и тимидина в ТХУ-нерастворимый материал хроматина 50
2.6. Включение 3Н-гиббереллина Aj в хроматин 51
2.7. Определение среднего ГЦ-содер7ісания ДНК методом плавления 51
2.8. Круговой дихроизм 52
2.9. Ультрафиолетовая спектроскопия . 53
2.10. Обработка результатов 54
ГЛАВА III. Результаты экспериментов
3.1. Действие биологически активных соединений на рост изолированных зародышей 56
3.2. Изменение активности некоторых ферментов при прорастании и обработке биологически активными соединениями изолированных зародышей пшеницы а . 62
3.3. Действие гиббереллина на синтез нуклеиновых кислот 75
3.4. Действие гиббереллина на субклеточном уровне 80
3.5. Анализ функционального состояния хроматина 84
3.5.1. Изменения Б ДКП нативного и реконструированного хроматина зародышей пшеницы при прорастании 84
3.5.2. Изменения в ДКП и КД хроматина при обработке изолированных зародышей пшеницы биологически активными соединениями . 9Ц
3.5.3. Изменения в компонентах хроматина при прорастании и разных обработках изолированных зародыше и пшеницы 97
3 а к л ю ч е н и е 101
Выводы
Литература 112
- Рост растений в свете современных представлений о внутриклеточной регуляции
- Действие фитогормонов на хроматин
- Выдетение препаратов
- Действие биологически активных соединений на рост изолированных зародышей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Для успешного выполнения "Продовольственной программы" существенное место отводится интенсификации сельского хозяйства. В связи с этим все большее внимание уделяется увеличению объема молекулярно-биологических исследований для выявления механизмов действия природных и искусственно синтезированных стимуляторов роста и развития сельскохозяйственных культур.
Природа явлений, происходящих при набухании семян, а также последовательность событии, приводящих к включению различных звеньев обмена, пока остаются совершенно неясными. Работы, посвященные исследованиям изменения биосинтетических процессов при прорастании, а также под действием фитогормонов и других биологически активных соединений, немногочисленны, противоречивы и зачастую не дают четкого представления о механизмах возникновения этих изменений.
В настоящее время накопилось достаточно экспериментальных данных о действии гиббереллина на различные системы растении, однако практически ничего не известно о природе первичного действия ГБ на субклеточном уровне. Отсутствуют также достоверные сведения о действии фитогормонов на ферментные системы зародышей пшеницы, изменение активности которых отражает изменение его жизнеспособности.
Проводимые на кафедре биофизики в течение ряда лет исследования выявили стимулирующее действие предпосевной обработки красителем зеленым прочным на скорость и энергию прорастания ряда сельскохозяйственных культур. Однако нет сведений относительно механизма и уровней его действия, что делает чрезвычайно актуальным проведение исследований предполагаемых механизмов действия стимулятора на генетический аппарат клетки.
Остаются невыясненными также многие вопросы, посвященные структуре и функциям растительного хроматина при изменении функционального статуса клетки при нормальном развитии и под действием биологически активных соединений. Практически отсутствуют исследования хроматина растений физическими методами.
Известно, что первостепенная роль в регуляции матричной активности хроматина принадлежит негистоновым белкам хроматина, осуществляющим контроль генной экспрессии. (Ельцина,1979). Несмотря на то, что основная роль в поддержании структуры хроматина принадлежит гистонам, негистоновые белки также вносят определенный вклад в конформацию хроматина. Процесс нормального развития растительного организма сопровождается перестройками в самой ДНК, изменением ее нуклеотидного состава и степени метилирован-ности (Федоров, 1982).
Поэтому, исследование структурных изменений в ДНК и хроматине и выяснение роли отдельных его компонентов как при прорастании растения, так и под действием разных обработок чрезвычайно важен для понимания молекулярно-биологических механизмов действия фитогормонов и других биологически активных соединений.
Цель и задачи исследований. Учитывая важность и необходи -мость выявлении подходов к предполагаемым механизмам действия природных и искусственных стимуляторов роста, в настоящей работе были поставлены следующие задачи:
Исследовать возможность использования изолированных зародышей пшеницы в качестве модельной системы для изучения про -растания и действия различных биологически активных соединений.
Установить изменения в активностях и изоферментах ряда ферментных систем изолированных зародышей пшеницы при прорастании и под действием биологически активных соединений. - О -
Установить особенности совместного действии гиббереллина и других гормонов и биологически активных соединений на изолированные зародыши пшеницы.
Определить возможности применении физических методов для выявления изменений, происходящих в хроматине при изменении его функционального состояния.
Выявить вклад негистоновых белков и ДНК хроматина в структурные и конформационные изменения хроматина зародышей пшеницы при прорастании и под действием биологически активных соединений.
Научная новизна и практическое значение работы. На основании экспериментальных данных показано, что длина проростков изолированных зародышей пшеницы весьма чувствительна к действию биоло -гически активных соединений.
Показано, что при определенных концентрациях и экспозициях обработки существует возможность перекрывания некоторых метабо -лических путей действия гиббереллина и зеленого прочного, а также их действия на разные реакции одного и того же процесса. Обсуждается также возможность действия красителя на генетический аппарат.
Прорастание изолированных зародышей пшеницы сопровождается возобновлением метаболизма, проявляющемся в быстрой активации глюкоза-б фосфатдегидрогеназы, связанной с внедыхательным окислением, малатдегидрогеназы и пероксидазы. Одновременное умень -шение активности алкогольдегидрогеназы свидетельствует об отсутствии зависимости дыхания от анаэробного гликолиза.
Выявлено смещение кривых плавления хроматина в сторону низких температур, а также появление легкоплавких участков, плавящихся щш температуре ниже температуры плавления свободной ДНК. Обнаружено, что эти участки соответствуют плавлению комплексов - 7 -негистоновых белков с ДНК, дестабилизирующих ее структуру в хроматине. Эксперименты по реконструкции хроматина выявили стабилизирующее и дестабилизирующее действие негистоновых белков из сухих и прорастающих зародышей на структуру и конформацию ДБК и ДНК-гистонового комплексов.
Показана дестабилизация гиббереллином структуры ДНК как в нуклеосомной части, так и в участках взаимодействия НГБ с ДНК, вызванная изменениями в самих НГБ. Установлено также различное действие на ДКП хроматина совместных обработок гиббереллином с ауксином и 6-бензиламинопурином.
Показана коррелятивная связь между возрастанием матричной активности хроматина и положительной эллиптичности спектра Щ хроматина при обработке зародышей пшеницы гиббереллином. Возрастание амплитуды положительной эллиптичности спектра КД хроматина из зародышей пшеницы, обработанных зеленым прочным, также косвенно указывает на возрастание матричной активности при этом.
Установлено возрастание активности глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы и включения меченного тимидина в кислотонерастворимую фракцию хроматина, что свидетельствует о том, что одним из источников пентоз для синтеза ДНК в рассматриваемом этапе прорастания изолированных зародышей пшеницы является пентозофосфатный путь.
Показано совпадение диапазона оптимальных концентраций гиб-береллина, стимулирующих удлинение проростков зародышей и включение меченного уридина в хроматин.
Обнаружена радиоактивность в хроматине при обработке зародышей Н^-гиббереллином Aj, позволяющая пояснить получаемую нами зависимость между концентрацией гиббереллина и матричной активностью хроматина.
Результаты исследований открывают широкие перспективы для обнаружения действия биологически активных веществ, стимуляторов роста и развития сельскохозяйственных культур на хроматин.
Полученные данные углубляют существующие представления о предполагаемых механизмах действия фитогормонов на растительный организм и о природе механизмов регуляции функциональной активности хроматина.
На защиту выносятся следующие основные положения.
Изолированные зародыши пшеницы являются хорошей модельной системой для изучения прорастания и действия различных биологически активных соединений.
При прорастании и обработке гиббереллином зародышей наблюдается стимуляция активности всех исследованных ферментов и увеличение числа множественных молекулярных форм пероксидазы.
В зависимости от концентрации и длительности обработки зародышей фитогормонами и зеленым прочным существует возможность перекрывания путей действия этих веществ.
Изменения функциональной активности хроматина в процессе прорастания и при обработке изолированных зародышей пшеницы фитогормонами и зеленым прочным сопровождаются существенными структурными и конформационными изменениями в хроматине.
Существенная роль в изменении профилей плавления и спектров кругового дихроизма хроматина принадлежит негистоновым белкам, претерпевающим изменения при прорастании. Значительный вклад при этом могут вносить также изменения нуклеотидного содержания ДНК. _ 9 -
Рост растений в свете современных представлений о внутриклеточной регуляции
Природные гиббереллины представлены в растениях множеством близкородственных соединений, количество которых переходит за 60 (Кефели и Чайлахян, 1975, Полевой, 1982, Moore., 1979). Их принято обозначать буквой А с указанием номера, который присваивается каждому новому гиббереллину при его открытии (Кефели, 1970).
Гиббереллины представляют собой группу близких по строению тетрациклических карбоновых кислот - производных гипотетического углеводорода энт-гиббереллана, относящихся к классу дитерпенов ( Moore, 1979). Общим тетрациклическим предшественником всех гиббереллинов является каурен ( Cooibauch & мооге ., 1969), даль -нейший метаболизм которого осуществляется через серию последовательных окислительных реакций, протекающих при участии оксидаз смешанных функций ( Cooibauch & Moore ., 1971).
Биологическая активность гиббереллина определяется качественно и количественно его химическим строением, причем требования к некоторым структурным элементам молекулы могут быть совершенно различны и даже прямо противоположны в зависимости от генетических особенностей растения и типа биологической реакции-теста. В большинстве изученных тестов гиббереллины Ag, Agp и Аг, проявляют высокую физиологическую активность. Глубокие качественные различия в чувствительности биотестов могут бышь связаны как с генетическими особенностями растения, так и со спецификой реакции-теста /прорастание семян, стимуляция роста, ферментативная активность и др./
В природе гиббереллины существуют в свободной и связанной форме. Обнаружено, что концентрация свободных этилацетат-раство-римых гиббереллинов в зародышах несколько выше, чем в семядолях ( Обручева и др., 1981). В зародыше после падения уровня гибберел-лина к 72 часам он вновь возрастает. Рост стебля тесно связан с активностью гиббереллинов ( Aung & Bryan ., 1973) . Показано, что наиболее быстрый метаболизма Н3-гиббереллина Aj протекает в молодых тканях кукурузы, однако не найдено прямой связи между высотой стебля и обменом гибберел-лина ( Rappaport t а1., 1974- ). Корреляция между ростом и содержанием гиббереллинов отмеча-на для луковиц гладиолусов ( Halevy et al ., 1974). В процессе глубокого покоя его количество в свободной форме уменьшается до полного исчезновения, а при нарушении покоя оно вновь обнаруживается в свободной форме( Кузина, 1981). Биосинтез гиббереллинов имеет место в разных частях растений. Установлено, что синтез их происходит в молодых листьях, однако,он не наблюдается в апикальной меристеме верхушечной почки. Из более зрелых, но не кончивших полностью рост листьев, гиббереллин также поступает в стебель, хотя и в меньших количествах (Lockhart ., I957,Phyllips ., 1971). Гиббереллин синтезируется и в верхушке корня в зоне 3-4 мм, начиная от кончика корня ( Jones & Phillips., 1966 ), Очень мало сведений о местах биосинтеза гиббереллина в прорастающих семенах. Установлено, что в течение первых двух дней прорастания зерновок ячменя гиббереллиноподобные вещества образуются в щитке( Paleg .,1965),на третий день активность щитка Ослабевает И ГИбберелЛИН ПрОДУЦИруеТСЯ ЗарОДЫШеВОЙ ОСЬЮ.(Radley., 1956, 1956 ). Наиболее очевидный эффект гиббереллина - это стимуляция роста интактных растений(Муромцев и Агнистикова, 1973, Jones., 1973, Lang., 1970, Sache .,І9б5).Гиббереллин в отличие от ауксина гораздо сильнее стимулирует рост целых растений(Гамбург, 1964} чем отрезков различных органов. Так, установлено, что под действием гиббереллина рост надземной части проростка кукурузы усиливается, сырой и сухой вес возрастает(Гаджиева, 1981). Показано, что обработка экзогенным гиббереллином повышает уровень эндогенного гиббереллина у длинностебельного сорта, усиливая при этом рост растенийСРоманова, 1981) однако мало влияет на рост и уровень гиббереллина в стеблях короткостебельных форм (Случевская и др., 1981). Различные эколого-генетические группы пшеницы обладают различной чувствительностью к экзогенным воздействиям гиббереллина Шекурови Шепелева, 1981).Предполагается, что разная реакция у некоторых генотипов на ФГ определяется тем, что у одних сортов гормоны в состоянии активировать связанную с мембраной аденилат-циклазу, которая в свою очередь катализирует реакцию циклизации и образование цАМФ, что приводит к осуществлению физиологического эффекта. У других же генотипов этого не происходит и введением экзогенной цАМФ совместно с гиббереллином достигается ком - ІЗ -пенсация дефицита эндогенной цАМФ (Чекуров, Сергеева, 198I).
В общем случае удлинение стеблей обработанных гиббереллином растений (целых) коррелирует с действием ФГ как на деление, так и на растяжение клеток (Гамбург, 1970, Обручева и др., 1981, Overbeek .,1966, Jones,1973), действие на процесс формообразовании приурочен к более позднему времени. Стимуляцию деления клеток можно рассматривать как снижение торможения деления, которое происходит при действии гиббереллина. Он может действовать на пред-синтетический период интерфазы ( G - период), либо на период синтеза ДНК и гистонов ( S- период), либо на постсинтетический ( G?-период), либо на какую-то из фаз митоза. Если действие гиббереллина приурочено к G1 или s-фазам, то оно связано с ускорением синтеза нуклеиновых кислот, которое будет предшествовать увеличению количества клеток. При этом между обработкой растений гиббереллином и видимым эффектом на деление (увеличение митотического индекса или количества клеток) су ществует определенный промежуток времени, равный продолжительности всех фаз, находящихся между фазой, стимулированной гиббереллином.и митозом (Гамбург, 1964). Если гиббереллин действует на G2 или какую-то из фаз митоза, то его действие на митотическую активность должно обнаруживаться Ескоре после обработки и увеличение количества нуклеиновых кислот должно протекать одновременно с увеличением числа клеток.
Действие фитогормонов на хроматин
Основная часть эукариотической ДНК содержит сильно и умеренно повторяющиеся последовательности. Высокоповторяющиеся ДНК образуют монотонные и повторяющиеся миллионы раз олигонуклеотиды, главным образом локализованные в гетерохроматиновых центромерах, что создает индивидуальные особенности хроматина (Sonnenbichier., 1979). Важным свойством организации ДНК является чередование повторяющихся и уникальных последовательностей (Филимонова и др., 1982).
Несмотря на общность в структурной организации ДНК эукарио-тов, между ДНК растительного и животного происхождении есть ряд отличий. Это - большие размеры, т.е. большая сложность растительного генома, а также высокое содержание повторяющихся последова -тельностей ДНК (Сулимова и др., 1978, Филимонова и др., 1982). В геноме высших растений часть повторяющихся последовательностей собрана в тандемы по типу сателлитных ДНК, а остальные перемежаются с неповторяющейся ДНК и образуют упорядоченные структуры, осуществляющие, видимо, важную функцию в регуляции синтеза РНК (Беридзе, 1982, Tabidze & Berddza, 1979).
Сателлитные ДНК высших растений также отличаются от ДНК жи -вотных: они сложнее по своей молекулярной организации. Предполагается, что более гетерогенная сателлитная ДНК растений выполняет иные функции, чем просто организованные сателлиты ДНК животных (Мирошниченко, 1979). Характерная особенность всех сателлитных ДНК-присутствие 5-метилцитозина. Хотя функциональная роль этой модификации генома не ясна, однако, предполагается, что она может участвовать в регуляции репликации и транскрипции (Ванюшин и др., 1981). Предполагается, что одним из механизмов гормональной регуляции репликации ДНК и клеточной дифференцировки у высших рас -тений может быть индуцируемое фитогормонами изменение репликатив-ного метилирования ДНК (Ванюшин и др., 1981, Дрожденюк и др., 1976, Nagl., 1971,1974,1977, Nagl & Eucher ., 1976).
В функционировании ФГ можно вычленить два аспекта: I/ с по -мощью ФГ растение реагирует на различные внешние воздействия,отвечая на них изменением ростовых процессов; 2/ роль ФГ как посредников, обеспечивающих реализацию генетической программы про -цессов морфогенеза (Процко и Сытник, 1979). Вопрос о механизме действия их в настоящее время подвергается широкому обсуждению, но данные по этому вопросу весьма противоречивы.
Стимулирующий эффект обработки ГБ на синтез РНК известен давно. Он может стимулировать как синтез всех видов РНК, так и отдельных (Еркеев и др., 1981, Biswas & Roy, 1978, Candra & Varner .,1965, Duda P Cherry., 1971, Nakamura et al., 1970, Varner et al., 1965, Wasilewska & Kleczkowsky., 1974, Vielgat et al ., 1973). Так, ГБ активировал синтез РНК в ядрах, изолированных из растений карликового гороха. Причем, если растения выращены на среде с ГБ и отличаются более интенсивным ростом, то ядра из таких растений обладают и большей транскрипционной активностью. Изолированные ядра реагируют на ГБ лишь в том случае, если они выделены из клеток в присутствии ГБ.фугуіз et al.,I968). На этом основании авторами был сделан вывод, что в цитоплазме содержится какой-то фактор, необходимый для действия ГБ на транскрипцию. Установлена и природа этого фактора (белковая), нековалентно связывающего ГБ. По-видимому, ГБ действует на ядерный аппарат в составе комплекса ГБ-рецеп-тор, в результате чего возрастает матричная активность хроматина или активность РНК-полимеразы (Полевой, 1982). Исследования Лихолат и Поспелова /1973/ установили тесную зависимость влияния фитогормонов от возраста клеток. При этом и гиб-береллин и ауксин оказывали различное влияние на изменение матричной активности хроматина. Возрастание матричной активности хроматина выражается в увеличении количества ДНК, доступной для транскрипции ("Jarvis et al, 1968} Действие гиббереллина на транскрипцию тканеспецифично (Rogler & Dahmus.,1974). Обработка гиббереллином увеличивает размеры ядрышка во многих системах, увеличивая таким образом синтез ядрышковой РНК (Джохад- 1981, Chapman ft Jordan., 1971). Обработка проростков кукурузы и карликового гороха раствором ГБ повышает главным образом синтез иРНК, стабильность полирибо -сомной системы. Увеличивается in vivo синтез РНК, что отражается на повышении синтеза белка, повышается активность связанной с хроматином РНК-полимеразы И. Возрастает также уровень фосфорили-рования кислых белков хроматина (Василевска и др., 1981). Увеличивается количество негистоновых белков хроматина проростков обработанных гиббереллином семян пшеницы (Килев и др., 1981, Левина и Лихолат, 1978). Относительное содержание диффузной фракции (генетически активного хроматина) при обработке проростков пшеницы 2, 4Д и кинети -ном (Ахметов и Иванова, 1978) увеличивается. Это сопровождается повышением активности синтеза ДНК, РНК, изменением популяционного состава новообразованных мРНК и ферментов, т.е. имеет место дере-прессия отдельных локусов хроматина. При более продолжительном действии этих соединений или действии в экстремальных дозах наблюдается конденсирование, т.е. инактивация хроматина. В основе изменения структуры и доступности хроматина для по-лимераз под действием ФГ, вероятно, лежат аллостерические эффекты, взаимодействие ФГ с компонентами хроматина, модификация гис-тонов и т.д. (Ахметов и Иванова, 1978). Происходит увеличение количества всех форм РНК-полимеразы и неодинаковое возрастание их активности. Предполагается, что ФГ своим дифференциальным влиянием на свойства отдельных форм транскрибирующего фермента участвуют в контроле селективного функционирования генов, т.е. в образовании разных типов РНК.
Выдетение препаратов
Для приготовления ферментной вытяжки для изменения активности пероксидазы навеска зародышей 20-30 мг растирали в ступке с 3/4 мл фосфатного буфера на холоду (I/I5 М, рН 6,8) и перемешивал на магнитной мешалке в течение 10-15 мин при 0С. Раствор центрифугировали при 3,500-4000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге К-70. Надосадок использовали для измерения активности ПО, электрофореза и определения белка по Лоури (Lowiy et al.,i95l).
Для приготовления ферментной вытяжки для определения активности малат и глюкоза-бфосфат и алкогольдегидрогеназ навеску зародышей весом 200-300 мг растирали в ступке с 3-4 мл экстраги -рующего буфера, содержащего 0,1М Трис-глициновый буфер, рН 8,3; 15 % сахарозу, 0,1 % цистеин, 0,1 % аскорбиновую кислоту. Экстракцию проводили на магнитной мешалке в течение 45 мин при 4С. Экстракт просветляли центрифугированием 20 мин при 30000xg на центрифуге ЦВР-І У4-2, после чего супернатант использовали для измерения активности дегидрогеназ и после диализа белка.
При исследовании действия ингибиторов зародыши пшеницы обрабатывали различными концентрациями актиномицина Д и циклогексими-да. Поскольку актиномицин Д плохо растворялся в среде для обработки, для получения раствора ингибитора нужной концентрации использовался метод, используемый в лаборатории биохимии опухолей Всесоюзного онкологического научного центра. Полученный раствор центрифугировали на малых скоростях, 1500-2000 об/мин 2-3 минуты, определяли оптическую плотность надосадочной жидкости при 440 нм на спектрофотометре СФ-4А, учитывая, что одна оптическая единица соответствует концентрации актиномицина Д 42 мкг/мл.
Для выделения ДНК из зародышей и проростков пшеницы нами был модифицирован метод Сулимовой и Слюсаренко (Сулимова и Слюсарен-ко, 1972). 100 г растительной ткани замораживали в жидком азоте и растирали в ступке до тонкого порошка. К растертому материалу приливали исходный раствор, содержащий 0,15 М NaCi, 0,1 м ЭДТА, 0,015 М цитрат Щ, 0,1 М трис-, 0,1 % Тритон Х-100, рН 8,2-8,4, предварительно прогретый до 60С. Соотношение навески к объему взятого буфера 1:3. Гомогенат в широком химическом стакане помещали Б водяную баню (60С), добавляли при энергичном помешивании порошок SDS или его 20 % водный раствор до конечной концентрации 2,5 f0i смесь прогревали 2-3 мин, затем инкубировали 30-40 мин при 55С. О степени лизиса можно было судить по возрастанию вязкости. Затем к лизату добавляли сухой N аСі до конечной концентрации IM. Лизат тщательно перемешивали 20-30 мин до полногр растворения NaCl и добавляли равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:і), встряхивали на качалке в течение часа (4С). Центрифугировали при 4000 об/мин 30 мин в рефрижераторной центрифуге (0-4С). Водную фазу отсасывали, и ДНК из водной фазы осаждали двойным, объемом холодного этанола таким образом: в этанол осторожно ЕЛИ-вали раствор ДНК и оставляли на 20-30 мин без перемешивания или встряхивания для формирования "медузы", что особенно важно для сильно пигментированных растворов, т.к. при таком способе осаждения ДНК адсорбция пигментов на ней минимальна. Медузу" ДНК аккуратно переносили в сухой стакан, давали стечь избытку спирта и перераство-ряли в минимальном объеме 0,1 х ssc , рН 7,8-8,2. После полного растворения ДНК добавляли РНКазу (предварительно прогретую при 80 в течение 10 мин) до концентрации 50 /мл и инкубировали смесь при 37С I час. Одновременно с РНКазой добавляли диастазу (100 мкг/мл) также предварительно прогретую при 60С мин длд инактивации возможных примесей ДНКаз. Затем к инкубационной смеси добавляли проназу (50 мкг/мл) и выдерживали при тех же условиях 2-3 часа. Затем добавляли ацетат Na до конечной концентрации 4 % и ДНК осаждали равным объемом 96 % холодного этанола. Полученную ДНК вновь растворяли в минимальном объеме 0,1 х ssc , добавляли 1/10 объема смеси 5 % SDS в 45 % этаноле. Добавляли 1/3 объема 4М NaCl и смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 25 минут (Travaglini., 1978). Получали три фракции: верхняя - пленка, надосадок, содержащий ДНК и осадок, содержащий белок. Процедуру депротеинизации повторяли дважды. ДНК Е надосадке осаждали равным объемом 96 % спирта и растворяди в опытном растворе. Раствор ДНК диализовали против того же буфера в течение 24-48 часов при 0-4С. Для освобождения от низкомолекулярных фрагментов ДНК, раствор ДНК пропускали через колонку с Сафарозой 6В ( Watanabe р iso., 1981). Спектральные характеристики выделенной ДНК соответствовали таковым у Marmur Д96І). Хроматин из сухих и прорастающих зародышей пшеницы получали по модифицированному методу Симона и Беккера (Simon & Becker., 1977). К 2-3 г. зародышей добавляли 50 мл буфера, содержащего 0,5% тритон Х-100 в 0,05М Трис-НСі, рН 8,1 І/І5 М в-меркаптоэтанола (ТВТ) и гомогенизировали в гомогенизаторе Т-302 при 13000 об/мин в течение 2-3 минут, после чего перемешивали на качалке при 4С в течение 10 мин. Осколки разрушенных клеток и неразрушенные зародыши осаждали центрифугированием при 4000 об/мин, а супернатант, профильтрованный через двухслойную марлю, использовали дли дальнейшего выделении хроматина. Хроматин агрегировали, добавляли по каплям к супернатанту ЗМ сульфат аммония до конечной концентрации 50 мМ, и осаждали центрифугированием при 12000 об/мин 10 минут. Полученный осадок ресуопендировали в буфере ТВТ, содержащим 50мМ сульфат аммония в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновим пестиком. После двухкратной промывки осадка ресуспендированием в 10 мМ Трис-НСі буфере, содержащем В-меркаптоэтанол и 2 мМ Ms0l2(TBM) и центрифугированием при 4000 об/мин 10 мин получали "грубый хроматин". "Грубый хроматин" очищали центрифугированием в 1,7 М сахарозе в 10 М Трис-НСі, рН 8,1 30 мин при 22000 х є при 0С. Полученный таким образом гелеобразныи осадок промывали от сахарозы 2-3 кратным ресуспендированием в ТВМ при 4000 об/мин 10 мин. Полученный осадок представлял собой чистый хроматин. Все процедуры проводились при 0-4С. Во всех растворах присутствовал 0,1 мМ фенилметилсульфонилфлюорид (ФМСФ) для предотвращения действия протеаз.
Действие биологически активных соединений на рост изолированных зародышей
Состав ферментных систем, участвующих в дыхании - важнейший показатель жизнеспособности семян. Способность семян к прорастанию коррелирует с активностью дегидрогеназных систем, принимаю -щих непосредственное участие в метаболизме прорастающих семян. Так, отмечена прямая зависимость между жизнеспособностью семян и активацией глюкоза-б-фосфатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, а также оксидаз, в частности, перрксидазы (Красноок и др.,1979, Рубин и Ладыгина, 1969). Этими данными обусловлен выбор ферментных систем, отражающих метаболическое состояние зародышей пшеницы, для исследования действия гиббереллина, 6-бензиламинопурина и стимулятора роста - красителя зеленого прочного(38,39,47).
Все типы фитогормонов вызывают в чувствительных к их действию растительных объектах существенные изменения в ферментном спектре, подавляя активность одних ферментов и индуцируя или стимулируя другие. Фитогормоны влияют также на изоферментный спектр ферментов ( Gaspar et al ., 1975). В литературе нет достоверных данных о механизмах действия гиббереллина и 6-бензиламинопурина на упомянутые ферментные системы. В связи с этим нам представлялось интересным исследование их влияния на активность этих фер -ментов.
Результаты наших экспериментов показали, что в процессе прорастания зародышей пшеницы происходит возрастание активности Г6ФД от 0,038 до 0,095 и 0,07 при прорастании от 3 до 16 и 48 часов, соответственно, (табл.2). Обработка актиномицином Д ингибирует активность фермента, указывая тем самым на новый синтез фермент- ного белка Г6ФД. Уровень фермента имеет очень большое значение особенно на первых стадиях прорастания, поскольку для синтеза нуклеиновых кислот необходимы пентозы, полученные в результате работы пентозомонофосфатного шунта (Firenzuooli .,1968). .Ряд литературных данных указывает на новообразование Г6ФД при набуха -нии и прорастании ( Brown & wray .,1968). В первые 16 час прорастания зародышей наблюдается увеличение активности фермента до 2 раз по сравнению с исходной. В интервале от 16 до 24 час активность фермента возрастает в два раза, а после 24 часового она медленно падает.
При обработке зеленым прочным в первые 16 час активность глю-коза-6-фосфат-дегидрогеназы возрастает в 2,5 раза, в последующие 8 час она продолжает возрастать, однако, с меньшей скоростью. В дальнейшем наблюдается падение активности, которая превышает активность фермента контрольных зародышей в 1,7 раз. (табл.2). 16 часовая совместная обработка зародышей зеленым прочным и ак-тиномицином Д приводит к понижению активности фермента на 48 % по сравнению с его активностью из зародышей, обработанных красителем, что на I % выше активности фермента контрольных и на 28 % обработанных ингибитором зародышей. же часовая обработка совместно красителем и АД приводит к понижению активности фермента на 53 % по сравнению с таковой из обработанных красителем зародышей, и почти равным таковой из обработанных АД эмбрионов. Т.е. АД практически полностью снимает действие зеленого прочного на активность Г6ФД, что свидетельствует в пользу действия красителя на уровне транскрипции.
Обработка зародышей гиббереллином приводит к повышению активности фермента на 60-70 %, что подавляется при совместной обра -ботке с АД на 48 % и (16 час), а при 48 часовой обработке совместно с АД активность ГбФД становится равной таковой из АД-обрабо -тайных контрольных зародышей.
Интересно отметить, что при совместной обработке зародышей зеленым прочным и гиббереллином активность фермента увеличивается всего лишь на 40 % и 30 % для 16 и 48 часов обработки, соответственно, что позволяет предполагать некоторую конкуренцию в действии этих агентов на активность фермента.
Несмотря на большое количество исследовании, посвященных метаболизму прорастающих семян, до настоящего времени не установлены ключевые события, включающие прорастание.
Известно, что интенсивность дыхания увеличивается сразу после набухания.Этот процесс зависит от дыхательных субстратов в зародышевой оси. В первые часы прорастания образование АТФ происхо -дит анаэробно. Однако изменение активности алкогольдегидрогена-зы в процессе прорастания выявило первоначальное возрастание ее активности (к 16 часам), а затем резкое падение. Это свидетель -ствует о меньшей зависимости дыхания от анаэробного гликолиза и согласуется с результатами работ ( Кау., 1977) о синтезе ингиби -тора алкогольдегидрогеназы к 24 часам прорастания. Покровы семени препятствуют проникновению кислорода, ограничивая его доступность для зародыша интактного семени до проклеивания корешка (до 17 часов). (Кан, 1982). Следовательно, должна существовать другая возможность образования АТФ, по-видимому, связанная с внедыхательным окислением. Предполагается, что окислительным процессом,участвующим в выведении семян из состояния покоя, может быть окислительный пентозофосфатный путь (ПФП). Он конкурирует за кислород внутри тканей с другим путем дыхания - через Эмбдена-Мейергофа-цикл трикарбоновых кислот-цепь транспорта электронов, завершающихся ци-тохромоксидазой. Хотя завершающая оксидаза ПФП неизвестна, можно предполагать, что ее сродство к кислороду значительно меньше, чем у цитохромоксидазы. Именно работа ПФП существенно важна для выхода семян из покоя. Лимитирующим звеном ПФП является ре окисление НАДФН, которое не затрагивает основной путь дыхания, главным коферментом которого служит НАД. По-видимому любой агент, стимулирующий реокисление НАДФН, может снимать состояние покоя семени.
Весьма вероятно, что ПФП является одним из метаболических путей, подавленных или отсутствующих в семенах, находящихся в органическом покое. Интересно отметить, что у семян, находящихся в состоянии вынужденного покоя, после набухания увеличивается ак -тивность ГбФД, тогда как у семян, находящихся в органическом покое, увеличение активности происходит только под действием гиббе-реллина (Кан, 1982). Часть генома семян, находящихся в органическом покое, могла быть репрессирована в период эмбриогенеза. Было бы интересно выяснить присутствуют ли эти ферменты в сухих семенах.
Однако, роль ПФП в прорастании семян остается неизвестной. Предполагается, что наиболее важное функцией ПФП является образование промежуточных продуктов.
Возможно также, что ПФП участвует в переходе клеток к фазе растяжения. На ранних стадиях прорастания рост клеток зародышевой оси осуществляется за счет растяжения. Первоначальным дыха -тельным субстратом клеток зародыша могут быть свободные аминокислоты и сахара, запасенные в сухом зародыше. При дальнейшем растяжении необходим синтез полисахаридов из моносахаридов, источником которых может быть работа пентоэофосфатного шунта. И лишь в дальнейшем гексозы поставляются из эндосперма (Кан, 1982).
Учитывая все вышесказанное, становится понятным увеличение активности ГбФД при обработке зародышей в частности, гиббереллином. Последний, стимулируя растяжение клеток (Хавкин, Воракина,19б9, Гамбург, 1974) должен был бы привести к более интенсивному образованию мономеров для полисахаридов.
Высказывается предположение также о связи ПФП с дифференциацией закончивших растяжение клеток.
.Работа ПФП сопряжена с нитратредуктазной реакцией, продукты которой, например, нитрит, ингибируют каталазу. В таком случае перекись становится доступной для других реакций, например перо-ксидазной. Поэтому следует ожидать увеличения активности перокси-дазы, что может затронуть структурные особенности, проницаемость и метаболизм ауксинов и фенолов ( Katsumi & Kazawa ., 1974).
