Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Растительные белки 8
1.2 Протеолитические ферменты растений 10
1.3 Роль протеолитических ферментов в растениях 22
1.4 Ингибиторы протеолитических ферментов растений 24
1.5 Классификация ингибиторов протеаз отдельных ботанических семейств и их характеристика 32
1.6 Роль ингибиторов протеолитических ферментов в растений..37
1.7 Характеристика исследуемого объекта 38
1.8 Технология переработки семян подсолнечника 42
Заключение 46
2. Экспериментальная часть 48
2.1 Исходный материал, условия и методы эксперимента 48
2.1.1 Характеристика объектов исследования 48
2.1.2 Лабораторные исследования 50
2.1.3 Стендовые испытания 56
2.1.4 Производственные испытания 56
2.1.5 Общая схема исследования 58
3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1 Характеристика активности протеолитических ферментов и их ингибиторов в белковом комплексе семян подсолнечника 60
3.2 Протеолиз белков и активность ингибиторов протеаз при прорастании семян 65
3.3 Влияние тепловой и влаготепловой обработки на протеиназы и их ингибиторы при технологической подготовке семян подсолнечника к извлечению масла 72
3.4 Электрофоретические спектры белков и их изменения при технологической переработке семян 84
3.5 Изменение аминокислотного состава белков семян при технологической переработке 85
3.6 Влияние тепловой обработки на биологическую ценность и активность ингибитора белков подсолнечных семян 88
3.7 Оценка биологической ценности подсолнечного шрота 93
Выводы 94
Список литературы 96
- Протеолитические ферменты растений
- Характеристика исследуемого объекта
- Лабораторные исследования
- Характеристика активности протеолитических ферментов и их ингибиторов в белковом комплексе семян подсолнечника
Введение к работе
Все основные свойства и функции организма обусловлены свойствами и функциями белков. Свойства белка определяют молекулярную организацию протоплазмы, обмен веществ, реакцию организма на внешние воздействия. Через белки реализуется генетическая функция нуклеиновых кислот и морфогенетических процессов. Уже почти два столетия белки находятся в центре внимания биологов. В последнее время особенно возрос интерес к проблеме растительного белка. Это вызвано тем, что растения осуществляют его первичный синтез из неорганических элементов и являются основным источником белкового питания человека и животных.
Одна из вечных проблем человечества - обеспечение пищей, самой дефицитной частью которой является белковая. До сих пор более половины населения мира испытывают недостаток в белке и проблема увеличения его производства остается самой актуальной. Увеличение ресурсов белка за счет животноводства и рыбного промысла имеет свои пределы, которые уже практически достигнуты. Поэтому главным источником пищевого и кормового белка являются растения.
С проблемой пищевой ценности растительных белков связаны также вопросы безвредности растительного белка для организма человека. В растительном сырье присутствуют различные антипитательные или антиалиментарные вещества. К ним относятся, в частности, ингибиторы протеолитических ферментов, присутствующие в семенах зерновых, бобовых и других растений. Присутствуя в белковых продуктах, белки-ингибиторы протеиназ пищеварительного тракта могут существенно снизить усвояемость растительного белка.
Протеолитические ферменты и их ингибиторы играют важную роль в жизнедеятельности организмов.
Протеиназы и их технические препараты широко применяются в пищевой промышленности, в медицине, используются в виде кормовых добавок в животноводстве. Соевый ингибитор типа Баумана-Бирк является средством, которое эффективно применяется при лечении злокачественных новообразований. В настоящее время широко ведется поиск ингибиторов растительного происхождения, пригодных для использования в медицине.
В то же время высокое содержание ингибиторов в некоторых растениях приводит к значительному снижению пищевой ценности белковых продуктов. Так, в сое содержится пять ингибиторов трипсина в количестве 5 - 10 % от общей суммы белков. Присутствие ингибиторов протеиназ в рационе питания животных и человека приводит в ряде случаев к отрицательным физиологическим явлениям.
Многие ингибиторы обладают высокой устойчивостью к повышению температуры и не разрушаются даже после кипячения. Ряд растительных продуктов употребляется в пищу в сыром виде. В результате ингибиторы протеиназ могут в существенной степени затруднять усвоение белков, несмотря на содержащиеся в растениях активные протеиназы, способные стимулировать процесс гидролиза и усвоения белков пищи.
В связи с этим изучение растительных протеиназ и их ингибиторов в исходном сырье и белковых пищевых продуктах приобретает особое значение, определяя их биологическую ценность и безвредность для живого организма.
Данные о содержании протеиназ и их ингибиторов в растениях касаются в основном представителей ботанических семейств - бобовых, злаковых, пасленовых и тыквенных, реже - сельдерейных и капустных. Исследования последних десятилетий свидетельствуют об участии белков-ингибиторов во многих метаболических процессах растений - в процессах органического протеолиза белков и синтеза ферментов в прорастающих семенах, в создании механизмов защиты растения от повреждения микроорганизмами и насекомыми-вредителями. Эти работы дают основание полагать, что белки-ингибиторы ферментов являются обязательным компонентом белкового
6 комплекса многих растений, во всяком случае тех из них, в которых белки в созревающих семенах откладываются в запас.
К сожалению, сведения о протеиназах и их белковых растительных ингибиторах семян подсолнечника, основной и традиционной масличной культуры юга России, крайне ограничены, получены на семенах подсолнечника старых сортов и выполнены методами, уже не применяемыми в современных биохимических исследованиях.
Отсутствуют также исследования протеаз и их ингибиторов в продуктах технологической переработки семян подсолнечника. Жмыхи и шроты, получаемые после удаления из семян растительного масла, представляют собой высокобелковые продукты и могут служить перспективным источником получения белковых концентратов и изолятов, применяемых в пищевой промышленности в качестве белковых обогатителей и функциональных добавок.
В связи с этим изучение биохимических характеристик протеиназ и их ингибиторов в хранящихся, покоящихся и прорастающих семенах подсолнечника и их изменений при технологической переработке семян представляют теоретический интерес для биохимии растений и химии белка и имеют прикладное значение для масложировой промышленности, перерабатывающей семена подсолнечника, при получении растительного масла и белка.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с НТП Минобразования РФ «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» (№ госрегистрации 01200004219) и в соответствии с тематикой НИР кафедры биохимии и технической микробиологии КубГТУ (№ госрегистраци 2.14.09 и 2.14.005.6).
Целью работы являлось изучение биохимических характеристик протеиназ и их ингибиторов в семенах подсолнечника современных типов и выяснение возможности повышения эффективности использования подсолнечных белков в пищевых и кормовых продуктах путем направленной термической инактивации присутствующих в семенах ингибиторов протеиназ.
Протеолитические ферменты растений
В растениях протеолитические ферменты содержатся как в вегетативных органах - листьях, стеблях, корнях, так и в семенах (64). Они являются веществами, способными расщеплять белковые молекулы до составных частей - аминокислот. Растения могут содержать значительное количество ферментов, преимущественно протеолитических. По данным Мосолова (64) жидкая часть млечного сока фикуса (Ficus carica) содержит 10-17,5 % ферментов, 90 % которых обладают протеолитической активностью.
По классификации В.М. Степанова (101) протеолитечиские ферменты делятся на четыре группы, в зависимости от строения активного центра.
Первая группа - тиоловые протеазы, содержащие в активном центре SH-группы цистеина. Активность этих ферментов повышается в присутствии содержащих сульфгидрильные группы цистеина, глютатиона, меркаптоэтанола и подавляется веществами, специфически блокирующими сульфгидрильные группы в белках, а так же окислителями и солями тяжелых металлов. К специфическим блокаторам сульфгидрильных групп относятся алкиляторы — йодацетат, йодацетатамид, N-этилмалеимид, а так ртутьорганические соединения. Общими свойствами тиоловых протеаз является так же молокосвертывающая активность и способность переваривать кишечных гельминтов, которые устойчивы к действию ферментов других классов (64).
Вторая группа - сериновые протеазы, содержащие в активном центре ОН-группу серина. Эти ферменты не активизируются в присутствии восстанавливающих агентов и солей синильной кислоты. А активность некоторых из них даже понижается в их присутствии. Ферменты этой группы обладают повышенной устойчивостью к действию окислителей и их активность не подавляется сульфгидрильными ядами или блокаторами. Третью группу составляют кислые протеазы. Они содержат в активном центре карбоксильную группу дикарбоновых кислот. Кислые протеазы не угнетаются вышеуказанными ингибиторами и не активируются цистеином. Специфическими ингибиторами для этих ферментов являются диазоацетил ф ДНФ-этилендиамин и пепстатин. Четвертая группа - металлопротеазы. В активном центре этих ферментов содержится двухвалентный ион металла. Такие ферменты ингибируются этилендиаминтетраацетатом, 1,10-фенантнролином и активируются соответствующими ионами металлов ( 64). Позже Г.Д. Руденской (91) был выявлен новый подкласс сериновых щ протеаз: тиолзависимые субтилизинопоодобные протеазы, которые ранее находили преимущественно у бацилл и некоторых грибов; они были найдены в листьях подсолнечника (Helianthus annus) и плодах маклюры (Madura pomifera). В числе первых протеаз растений были изучены тиоловые протеазы, в частности папаин и химопапаин, выделенные из млечного сока плодов папайи ( Carica papaya), а так же бромелаин, полученный из ананаса и фицин из млечного сока фигового дерева ( 64). Из семян некоторых бобовых и злаковых был получен ряд высокоочищенных протеаз, которые обладали одинаковыми с тиоловыми протеазами свойствами. Среди них сульфгтдрильные эндопептидазы из семян фасоли и гречихи, эндопептидазы из семян сорго, а так же ряд других протеаз(7, 34, 44,47, 82, 90,103, 111, 137). В 1983 г О.П. Онивоги ( 75) было сообщено об обнаружении сериновых протеаз в ряде съедобных тропических растений. В 1991 г М. Dryjanski, I. Otlewski, Т. Wilusz (131) была выделена сериновая протеаза из семян тыквы (Cucurbita реро). Г.Н. Руденской с сотрудниками с помощью аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих антибиотик бацитрацин в качестве лиганда, и гель-фильтрации на сефадексе G-150 из плодов маклюры ( Madura pomifera) была выделена гомогенная сериновая протеаза (91). Фермент представлял собой гликопротеин, он имел молекулярную массу 67000 Да, по данным электрофореза с додецилсульфатом натрия и гель-фильтрации на сефадексе G-75 , белковая часть молекулы составляла 50000 Да. Оптимум рН, определенный по гидролизу пептида глицин — аланин — аланин — лейцин - nNa, составлял 8,5. Субстратная специфичность соответствовала таковой кукумизина — наиболее изученного субтилизина из сока дыни. Фермент был устойчив к действию этилендиаминтетраацетата и ингтбитора трипсина из соевых семян. В.Я. Зобенко и М.Т. Проскуряков ( 42) выделили аспартильную протеазу из клубней картофеля ( Solanum tuberosum). Протеаза обладала молокосвертывающей активностью, гидролизовыала гемоглобин, казеин, бычий сывороточный альбумин, а так же собственные белки клубней картофеля. Молекулярная масса выделенного фермента составляла 22300 Да по данным гель-фильтрации на сефадексе G-75 и 22900 Да по данным электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Максимальная активность протеазы проявлялась в области рН 3,0 - 5,0 при оптимуме температуры 40 С. Для собственных белков оптимум активности находился при рН 4,0, а стабильности - при рН 3,5 — 6,0. Изоэлектрическая точка по данным изоэлектрофокусирования находилась при рН 4,2. В покоящихся клубнях протеаза была распределена равномерно в зоне глазков снаружи и внутри сосудистого кольца.
Систематические исследования протеолитических ферментов семян гречихи было проведено М.А. Белозерским (11). Автором установлено, что в составе зерна гречихи имеются все группы протеаз: тиоловые, сериновые, кислые и металлопротеазы. Причем у одного растения может быть несколько протеаз из каждой группы.
Характеристика исследуемого объекта
Подсолнечник Helianthus L., принадлежащий к семейству Астровые (Asteraceae) - обширный и полиморфный американский род. Он имеет разъединенный ареал. Большая часть видов (около 50 ) сосредоточена в Северной Америке - от Канады через США до Мексики включительно. Другая группа, состоящая из 17 видов, обитает в Южной Америке, в Андах, от южной Колумбии до Боливии. Возможно, что подсолнечник когда-то имел сплошной ареал, и его среднеамериканские представители вымерли (38).
Родиной подсолнечника является Северная Америка. На родине это растение называли «солнечным цветком» и считали священным. Индейцы возделывали его задолго до прихода европейцев. Семена они употребляли в пищу, использовали для приготовления муки, а маслом смазывали кожу. В Европу растение завезли в 1510 г. Первоначально подсолнечник выращивался в Мадридском ботаническом саду. Постепенно он распространился в другие страны, где вначале культивировался как декоративное растение. Затем из его семян начали готовить кофе (Германия), крупу (Португалия). В Россию подсолнечник завезли по указу Петра 1 в начале 18 века. Долгое время он оставался огородным, грызовым и декоративным растением. В 1829 г Д.Е. Бокарев — крепостной крестьянин графа Шереметева из села Алексеевка Воронежской губернии - открыл новое свойство «солнечного цветка». При помощи примитивного ручного пресса он извлек из семян подсолнечника золотистое вкусное масло. Таким образом, в России подсолнечник превратился из декоративного растения в масличную культуру. Вскоре посевы подсолнечника как масличной культуры распространились на Украине и в Саратовской губернии. В настоящее время подсолнечник — основная масличная культура в России и некоторых других республиках бывшего СССР.
Россия по праву считается второй родиной подсолнечника. Отсюда он начал свое новое путешествие по миру. В нашей стране прошла эволюция подсолнечника как культурного растения до одностебельных, однокорзиночных, панцирных, устойчивых к заразихе сортов с масличностью выше 50%. Основные районы возделывания — Северный Кавказ, Центральная черноземная область. В Нечерноземье подсолнечник выращивают на силос (43).
Культурный масличный подсолнечник Н. annus L. — однолетнее травянистое растение до 2-5 м высотой, с хорошо развитым стержневым корнем, проникающим в почву на 2-4 м, и сильно разветвленными придаточными корнями, развивающимися из подсемядольного колена. Стебель у культурного подсолнечникапрямостоячии, у селекционных форм неветвящийся с рыхлой сердцевиной, опушенный, высотой 0,7-1,2 м масличных и 2 -3 м у силосных (грызовых) сортов. Листья крупные, густоопушенные, овально-сердцевидные с заостренными концами и пильчатыми краями. Растение образует 15-35 листьев.
Соцветие - корзинка, имеющая вид плоского или выпуклого, реже вогнутого, диска, окруженного оберткой из нескольких рядов зеленых листочков. Диаметр корзинки у масличных сортов 10-20 см, у грызовых — до 40-50 см. Цветки по краям язычковые бесполые (иногда с недоразвитыми пестиками), в остальной части соцветия - трубчатые обоеполые. Окраска лепестков от светло-желтой до темно-оранжевой. Подсолнечник — хороший медонос.
Плод - семянка, окраска плодовой оболочки светлая, светло- и темно-серая, черно-угольная, бурая, полосатая. Состоит из ядра, которое покрыто тонкой семенной оболочкой, и кожуры (лузги), лузжистость составляет 22-46%. Масса 1000 семянок - 40-125 г. В кожуре масличных сортов имеется панцирный слой, защищающий семянки от подсолнечниковой моли.
Экологически подсолнечник - степной вид. Вид культурного подсолнечника обычно считают короткодневным. Дикие предки современных сортов росли в сухих знойных прериях, и поэтому климат степной полосы европейской части России оказался для него благоприятным. Оптимальная температура для роста и развития подсолнечника 25-27С, семена начинают прорастать при 5-10 С, всходы могут переносить заморозки до минус 5-6С. Длина периода вегетации составляет от 100 до 138 дней.
Вид Н. annus в настоящее время делят на подсолнечник культурньій(Н.сиІШз) и подсолнечник дикорастущий (Н. ruderalis). Возделываемые на масло и корм формы относят к подвиду подсолнечника посевного (sativum) в отличие от подсолнечника декоративного (ornamentalis). По морфологическим признакам и строению семянок подсолнечник делят на три группы: масличный, грызовой и межеумок. Наибольшее распространение в посевах имеет подсолнечник масличной группы. Лучшие в мире высокомасличные сорта созданы академиком B.C. Пустовойтом (г. Краснодар, ВНИИМК)((38,81).
В семенах подсолнечника содержится до 50% и более жирного масла. Его относят к полувысыхающим (йодное число 119-134). Для высокомасличных сортов характерно высокое содержание линолевой кислоты. По данным В.Г. Щербакова (112), в семенах всех сортов подсолнечника с длинным вегетационным периодом содержится больше линолевой кислоты, а в семенах сортов с коротким вегетационным периодом преобладает олеиновая кислота.
Азотсодержащие соединения занимают среди запасных веществ подсолнечника второе место. В первую очередь это белки ( более 80% всех азотсодержащих веществ) и небелковые азотсодержащие компоненты (59 ).
По растворимости белки семян подсолнечника обычно подразделяются на три группы: водорастворимые ( альбумины), солерастворимые ( глобулины) и щелочерастворимые ( глютелины). Спирторастворимые протеины ( проламины ) в семенах подсолнечника практически отсутствуют. Доминирующими по массе ряд авторов считает глобулины (59).
Пищевая ценность подсолнечных белков составляет 89% ценности белка куриного яйца. По сравнению с аминокислотным составом последнего, белки подсолнечника , особенно шрота, отличаются значительно меньшим содержанием лизина и серосодержащих аминокислот, что снижает их биологическую ценность. Главной лимитирующей аминокислотой является лизин ( 59).
Подсолнечный шрот можно характеризовать как продукт с высоким содержанием белка удовлетворительной биологической ценности. Шрот содержит 83,3% растворимого протеина. Количество усваиваемого лизина соответствует 77% общего содержания этой аминокислоты в шроте. Химический скор лизина по шкале ФАО составляет 56, метионина - 48.
Подсолнечник интересен также как источник лекарственного сырья. В этом плане используют листья и язычковые цветки, а также семена. Как лекарственное растение подсолнечник стали использовать в древней Мексике. В Европе его свойства стали известны после испанской конкисты.
Лабораторные исследования
Хранение семян в лабораторных условиях вели в эксикаторах при относительной влажности воздуха 75-80%, температуре 18 + 3С.
Определение группового состава белков проводили по методике, описанной у А.И. Ермакова, в основе которой лежит разделение белков по Т.Б. Осборну (37).
Перед анализом семена обрушивали вручную, затем измельчали на кофемолке и обезжиривали на холоде путем многократного настаивания с гексаном. Обезжиренный остаток вновь измельчали в тонкую муку, высушивали при 45-50 С. В дальнейшем белки последовательно экстрагировали водой (альбумины), слабыми растворами нейтральных солей (глобулины) и щелочными растворами (глютелины). Содержание спирторастворимых белков (проламинов) не установлено. Для семян подсолнечника они не характерны.
Определение фракционного состава белков проводили следующим образом. 1 г тонкоразмолотой обезжиренной муки помещали в центрифужную пробирку, заливали 10-кратным объемом воды и взбалтывали 30 минут на механической мешалке. Затем экстрагированные белки отделяли центрифугированием в течение 4-5 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость, содержащую водорастворимые белки, сливали в мерную колбу на 100 мл. После этого к осадку в центрифужной пробирке приливали 10 мл воды, смесь тщательно перемешивали в течение 30 минут, вновь центрифугировали, надосадочную жидкость сливали в ту же мерную колбу. Такую экстракцию с последующим центрифугированием проводили три раза. Белковый экстракт в мерной колбе доводили водой до метки, добавляли 2-3 капли толуола и хранили в холодильнике. Осадок в центрифужных пробирках заливали 10 мл 1М NaCl, тщательно перемешивали и взбалтывали в течение 30 минут. Затем центрифугировали 4-5 минут при 3000 об/мин и раствор белков сливали в мерную колбу на 100 мл. Экстракцию белков с последующим центрифугированием проводили 3 раза. После экстракции глобулинов осадок в центрифужной пробирке промывали 1 раз водой, центрифугироввали и полученный раствор сливали в мерную колбу с раствором глобулинов. Затем белковый раствор в мерной колбе доводили до метки lMNaCl. Для выделения щелочерастворимых белков к осадку в центрифужной пробирке добавляли 10 мл 0,2% NaOH, перемешивали, взбалтывали 30 минут и центрифугировали. Раствор глютелинов сливали в мерную колбу на 100 мл. Такую экстракцию с последующим центрифугированием проводили 3 раза. Раствор белков доводили до метки щелочью и хранили в холодильнике. Препараты альбуминов, глобулинов и глютелинов исследовали на активность трипсиновых ингибиторов (ТИА). Распределение ТИА между фракциями альбумины: глобулины: глютелины составляло соответственно 10: 3: 1. В связи с этим дальнейшие исследования трипсиновых ингибиторов вели с ингибиторами, полученными из альбуминовой фракции. Определение общего и белкового азота фракций проводили по методу Кьельдаля. Для этого 20 мл белкового раствора сжигали в кипящей концентрированной серной кислоте в присутствии катализатора. Сжигание проводили в специальных тугоплавких длинногорлых колбах. По окончании сжигания определяли азот, связанный в виде сульфата аммония. Для этого содержимое колбы Кьельдаля переносили в отгонный аппарат. Туда же добавляли концентрированный раствор щелочи для нейтрализации серной кислоты и создании щелочной среды. Выделившийся при нагревании аммиак улавливали 2% раствором борной кислоты. Для расчета содержания белка величину общего азота умножали на коэффициент 6,25. Относительную электрофоретическую подвижность (ОЭП) белковых фракций определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Для этого к 10 мл белкового раствора добавляли 0,5 мл индикатора бромфенолового синего и 2 г сефадекса. Подготовленный таким образом раствор вносили в трубочки на поверхность крупнопористого геля из расчета 0,01-0,02 мл исследуемого раствора в каждую(114). В верхний отсек прибора наливали буферный раствор рН 8,3. Первые порции раствора вносили осторожно, слоями, не допуская перемешивания исследуемого образца с сефадексом. Объем верхней камеры полностью заполняли буферным раствором рН 8,3 и помещали аппарат в холодильную камеру. Нижний и верхний электроды подключали к источнику питания, первые 30 минут силу тока регулировали в каждой трубке на уровне 2мА, а затем на уровне 4мА при напряжении 320-700 В. Через 1,5-2 часа по мере приближения индикатора-метчика к нижнему концу трубочки напряжение отключали, разбирали прибор и извлекали трубочки. Затем извлекали гель из трубочек, вводя иглу шприца с водой между столбиком геля и внутренней стороной трубочки. Столбики геля помещали в ванночки амидочерным красителем на 30-60 минут, затем отмывали в 7%-ном растворе уксусной кислоты. Отмытые столбики геля, залитые раствором уксусной кислоты в стеклянной кювете, просматривали на микрофотометре МФ-4. ОЭП рассчитывали по формуле: ОЭП = а/в, где а — расстояние зоны фракций белков от старта, мм; в — расстояние, проходимое индикатором от старта, мм. Определение активности щелочных протеиназ и трипсинингибирующей активности (ТИА) проводили по методике Кунитца (73). Приготавливали контрольный и опытный образцы. Для приготовления опытного образца к 1 мл казеина, предварительно прогретого до 35С, приливали 1 мл исследуемого образца. Смесь выдерживали в течение 10 минут на водяной бане при температуре 35С, затем приливали 3 мл 0,ЗМ ТХУК. Образовавшийся после настаивания смеси в течение 1-1,5 часов осадок отделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 5 минут.
Характеристика активности протеолитических ферментов и их ингибиторов в белковом комплексе семян подсолнечника
Тепловая обработка, особенно предварительно увлажненного материала, неизбежно сопровождается денатурацией белков. Несмотря на обилие литературы, посвященной технологии производства растительных масел, фундаментальных исследований по термической денатурации растительных белков все еще недостаточно, а об изменении их структуры и конформации известно значительно меньше, чем об изменениях в этих условиях липидного комплекса семян.
Из растительных белков наиболее подробно изучена денатурация белков сои в связи с тем, что они наиболее широко используются в пищевых целях. Сведения о денатурации белков подсолнечника ограничены, фундаментальные разработки последних лет в этой области отсутствуют, также как и сведения об изменении активности протеиназ и их ингибиторов.
Одной из характеристик растительных белков, наиболее сильно изменяющихся при тепловой денатурации, является величина их растворимости в воде, водных растворах солей и щелочей.
Аналогичные исследования, выполненные на семенах сои и других масличных культур, показывают, что изменение основного компонента запасных белков семян -11 S-глобулина обнаруживает закономерность, по-видимому справедливую и для -11 S-глобулина семян других растений, в том числе и семян подсолнечника. Под действием нагревания 11 S-глобулин почти полностью исчезает уже через пять минут и образует растворимые агрегаты, чуть позже возникают и затем исчезают 78-белки, образуя ДБ-белки. При дальнейшем нагревании 48-белки начинают укрупняться, превращаясь в нерастворимый осадок. В основе этих изменений лежат денатурирующие процессы, нарушающие четвертичную структуру запасного белка семян.
Согласно литературным данным, US-глобулины подсолнечных семян являются олигомерными белками. Их четвертичная структура в пространстве представляет собой почти сферическое образование, состоящее из 6 субъединиц, расположенных в виде перевернутой призмы. Составляющие их мономеры образованы полипептидами с основными свойствами и полипептидами с кислыми свойствами с более высокой молекулярной массой. Существование четвертичной структуры олигомерного белка обеспечивается с помощью слабых водородных связей и взаимодействий, ионных связей и дисульфидных мостиков. Можно с большой достоверностью предполагать, что в процессе тепловой денатурации пространственная структура олигомера нарушается, субъединицы высвобождаются из-за разрушения раннее существующих связей. В дальнейшем, в условиях повышенной температуры начинают образовываться новые, нетипичные для природного белка, соединения субъединиц, сначала растворимые, а затем, при дальнейшем укрупнении агрегатов теряющие растворимость и переходящие в осадок. Для глобулинов соевых семян показано образование из моноединиц три-, тетра- и пептамеров из высвобождающихся при денатурации мономеров, свойства которых существенно отличаются от природного олигомерного запасного белка семян.
Денатурирующее действие тепловой обработки существенно зависит от степени увлажненности белка. Технология подготовки подсолнечных семян к обезжириванию предусматривает обязательное (для большинства современных технологий) увлажнение измельченных семян - мятки - до влажности 9 - 10%, которая для семян подсолнечника современных сортов существенно превышает границу критической влажности. Как известно, адсорбция воды белком — это результат взаимодействия молекул воды с гидрофильным участком молекул белка за счет образования водородных связей.
Водоудерживющая способность, как и растворимость, одновременно зависит как от степени взаимодействия воды с белком, так и белка с водой. Поэтому эти характеристики во многом зависят от степени денатурации белка, определяющей конформацию его молекулы. Это приводит к тому, что тепловая обработка оказывает очень сильное влияние на гидрофильные свойства белка, в частности, снижая способность белка к гидратации.
Сочетание тепловой обработки с увлажнением в операции влаготепловой обработки резко усиливает денатурацию белка, тогда как обработка теплом сухого белка сравнительно мало сказывается на его свойствах по отношению к воде - растворимости и влагопоглощению. В то же время обработка белка при влажности выше критической ведет к его денатурации при невысоких температурах Изменение группового состава белков семян подсолнечника при нагревании показано ниже (табл.16).
