Введение к работе
Актуальность проблемы.
Белок-белковые взаимодействия (ББВ) лежат в основе многих жизненно важных процессов. Образование белковых комплексов важно для формирования активных центров олигомерных ферментов, регуляции систем клеточного метаболизма, передачи сигнала в клетку, формирования клеточных контактов, транспорта электронов, взаимодействия антигена с антителом, синтеза и фолдинга белка, построения внутриклеточных структур и многого другого. К настоящему времени обнаружено и изучено большое количество ББВ с разнообразными функциональными и структурными особенностями и энергетическими принципами.
Комплексы белков приобретают новые свойства по сравнению с мономерами. Исследования особенностей существующих ББВ и поиск новых белков, образующих комплексы, вероятно, помогут глубже проникнуть в природу белковых комплексов. Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия церулоплазмина (ЦП) -медьсодержащего белка плазмы крови, и лактоферрина (ЛФ) - трансферрина молока.
ЛФ - один из белков острой фазы воспаления, поступающий в русло крови из вторичных гранул нейтрофилов. Он участвует в обмене железа, обладает антибактериальными, иммуномодулирующими, противоопухолевыми свойствами. Этот белок широко представлен в клеточно-тканевьж образованиях организма млекопитающих: он выявлен в большинстве барьерных эпителиев пищеварительного, респираторного и мочеполового трактов и их секретах, а также в экзокринных железах и их секретах. Широкий спектр функций ЛФ во многом определяется его способностью специфически связывать ионы железа и некоторых других металлов переходной группы. Многофункциональность ЛФ можно объяснить его способностью взаимодействовать с другими веществами. ЛФ человека взаимодействует с некоторыми секреторными белками — казеином, сс-лактальбумином, секреторным иммуноглобулином А, лизоцимом, с альбумином сыворотки крови, с внутриклеточным белком - кальмодулином и с бактериальными белками [Heckman, 1971; Watanaba et al, 1984; Sawatski, 1987; De Lfflo et al, 1992]. ЛФ коровьего молока обладает сродством к некоторым другим белкам молочной сыворотки [Lampreave et al, 1990], а также к специфическим последовательностям ДНК [Не and Furmanski, 1995]. Аргининовый кластер, расположенный в N-концевой части молекулы ЛФ,
участвует в связывании ДНК, бактериальных липополисахаридов (ЛПС) и гепарина [Van Berkeley/., 1997].
Церулоплазмин (ЦП), медьсодержащий белок плазмы крови, проявляя ферроксидазную активность, принимает участие в метаболизме железа, что обеспечивает встраивание Fe+3 в апо-трансферрины. Другие функции ЦП связаны с участием в транспорте меди и окислительными процессами, в которых он выступает как антиоксидант. Работами последних лет показано, что ЦП также приобретает новые функции, взаимодействуя с рядом других белков. Например, конкурируя с факторами свертывания крови (ФСК) FV и FVIII за связывание с протеином С, ЦП может участвовать в регуляции коагуляции [Walker and Fay, 1990]. Взаимодействие ЦП с миелопероксидазой (МПО) может иметь значение для регуляции ее опасных прооксидантных свойств [Segelmark et al, 1997; Park et al, 2000]. Взаимодействие ЦП с ферритином необходимо для полноценного встраивания Fe3+ в ферритин [Reily and Aust, 1997; Juan and Aust, 1998]. Изучая взаимодействие ЦП с другими белками, можно получить представление о его новых функциональных свойствах.
В свете сказанного представляется актуальным исследование особенностей взаимодействия ЦП и ЛФ и возможности образования комплекса ЦП/ЛФ. Такой комплекс мог бы служить примером ББВ двух многофункциональных металлопротеинов. Изучение ассоциации-диссоциации ЦП и ЛФ, а также структурных особенностей комплекса позволит выявить условия его формирования и возможную роль in vivo. Совместное присутствие этих белков в пограничных к инфекции тканях говорит о том, что их комплекс может играть роль в формировании неспецифической резистентности организма. Железосодержащий ЛФ и медьсодержащий ЦП являются ключевыми звеньями метаболизма двух важных для организма микроэлементов. Изучение их взаимодействия, приводящего к формированию комплекса ЦП/ЛФ, позволит пролить свет на неизвестные стороны регуляции обмена металлов в норме и при ряде патологических состояний.
Цель и задачи исследования.
Целью представленной работы явилось выяснение условий, приводящих к образованию комплекса ЦП/ЛФ, и определение некоторых его физико-химических характеристик. Для ее достижения были поставлены следующие задачи: 1) Показать возможность образования комплекса ЦП/ЛФ in vitro и in vivo.
Определить стехиометрическое соотношение молекул белков в составе комплекса.
Изучить условия диссоциации комплекса ЦП/ЛФ и определить константу диссоциации при физиологических значениях рН и концентрации NaCl.
Оценить избирательность взаимодействия ЛФ и ЦП.
Изучить условия, при которых происходит переход ионов меди из ЦП в ЛФ
Исследовать возможность влияния ЛФ на ферментативную (ферроксидазную) активность ЦП.
Новизна работы.
В работе впервые показано прямое взаимодействие ЦП и ЛФ, определены основные характеристики этого взаимодействия и свойства специфического комплекса ЦП/ЛФ, что позволяет высказать гипотезу о его физиологической роли.
Практическая значимость работы. В данной работе охарактеризован комплекс между двумя избирательно реагирующими друг с другом металлопротеинами, участвующими в реакциях острой фазы воспаления. Исследование ББВ на примере столь физиологически значимых металлопротеинов, как ЦП и ЛФ, может пролить свет на роль этого феномена в сложных обменных процессах (в первую очередь связанных с метаболизмом металлов) в норме и при патологии. Глубокое изучение воспалительных реакций, способов их регуляции и побочных процессов, вызываемьж очаговым воспалением, позволит найти новые подходы к терапевтической коррекции многих заболеваний, сопровождающихся воспалительным процессом инфекционной и неинфекционной природы.
Основные положения, выносимые на защиту:
Доказано существование комплекса ЦП/ЛФ in vitro и in vivo, произведена оценка избирательности взаимодействия ЦП и ЛФ.
Определена стехиометрия комплекса ЦП/ЛФ, а также условия его диссоциации и константа диссоциации при физиологических значениях рН и концентрации NaCl.
Выявлены условия, способствующие переходу ионов меди из ЦП в ЛФ.
4. Показано, что ферроксидазная активность ЦП возрастает в присутствии ЛФ.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на ежегодных научно-технических конференциях «Неделя науки СПбГТУ», Санкт-Петербург, 1998-2000 гг.; научной конференции, посвященной 110-летию Института Экспериментальной медицины,
Санкт-Петербург, 2000 г.; на IV и VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2001 и 2003 гг.; на 12-ой Европейской конференции студентов, Берлин, 2001 г.; на 7-ом Международном симпозиуме «Ионы металлов в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 2002 г.; на III съезде Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 2002; и на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2004.
Основное содержание диссертации опубликовано в Т научных статьях и тезисах 7" докладов.
Структура диссертации.
Диссертация изложена на 104 страницах и содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов» и «Выводы». Работа содержит 23 рисунка и 1 таблицу. Список литературы содержит 142 работы на русском и английском языках.
Для исследования были выделены апо-ЛФ (из грудного молока первого месяца лактации) и ЦП (из плазмы крови человека). Часть полученного апо-ЛФ была насыщена ионами железа и меди. ЛФ коровы, свиньи и овцы, а также катепсин G и эластаза из нейтрофилов человека были любезно предоставлены сотрудниками Отдела общей патологии НИИЭМ.
За исключением особо оговоренных случаев в работе применяли 10 мМ фосфатный буфер (Na2HP04, NaH2P04), рН=7,4 с добавлением 0,15 М NaCl, который далее обозначается как PBS (phosphate-buffered saline).
Экстракт нейтрофильных лейкоцитов получали из кровяной клеточной массы, вначале осаждая центрифугированием лейкоцитарную фракцию, затем лизируя лейкоциты и выделяя из них секреторные гранулы. После повторной процедуры замораживания/оттаивания содержимое гранул выходило в раствор и использовалось для выделения ЛФ.
Очищенные белки и их смесь анализировали методами гель-фильтрации на Сефакриле S-300, электрофореза (ЭФ) в ПААГ в неденатурирующих условиях [Davis, 1964] и в присутствии SDS [Laemmli, 1970].
Специфическую оксидазную активность ЦП в ПААГ выявляли путем окрашивания гелей раствором о-дианизидина [Owen, 1980]. Количественную оценку оксидазной активности ЦП получали по методу Рэйвина [Ravin, 1956].
Для исследования комплекса ЦП/ЛФ с помощью иммуноэлектрофореза [Weeke, 1977] и иммуноэлектродиффузии [Grabar et Williams, 1953] были получены моновалентные кроличьи антитела (AT) к ЦП и ЛФ [Zakharova et al, 1983]. Для изучения сродства белков методом аффинной хроматографии ЦП либо Ре2-ЛФ иммобилизовали на BrCN-активированной Сефарозе 4В в колонках небольшого объема (0,5-2 мл). Раствор ЛФ (или ЦП), содержащий 2-5 мг белка в PBS, наносили на колонку и элюировали 0,3 М NaCl в PBS. Моделирование комплекса in vivo проводили на самцах белых крыс. В хвостовую вену крысы вводили 10 мг очищенного ЛФ человека и через 0,5, 1, 2, 3, 4 и 5 часов, отбирали образцы крови для анализа методами ЭФ и иммуноэлектрофореза.
Перенос ионов меди из ЦП в металлосвязывающие сайты апо-ЛФ регистрировали спектрофотометрически. Все растворы предварительно пропускали через Хелекс-100 для удаления непрочно связанных ионов металлов.
Окисление ЦП под действием Н202 проводили в фосфатном буфере с рН 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 и 7,4, содержавшем 0,15 М NaCl. Основные эксперименты проводили, используя 10 мМ Н202 и инкубируя пробы в течение 5 часов. По окончании реакции пробы анализировали методом ЭФ и измеряли в них оксидазную активность ЦП.
Хемилюминесценцию измеряли на автоматическом люминометре. Конечная концентрация люминола в пробах была 10 М. Измерения проводились при 37 С.
Спектры кругового дихроизма (КД) в ближней УФ-области регистрировали при 20 С. Концентрация белков в пробах составляла 5 мкМ.
Ферроксидазную активность ЦП определяли по модифицированной методике [Pousset et al, 2001]. Проба содержала 0,45 мг ЦП и различные количества ЛФ (0; 0,45 и 0,9 мг) в 2,5 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера рН 6,0. Реакцию проводили при 20 С. Содержание Fe3+ в пробах определяли по оптической плотности при 450 нм, измеренной против смеси со спонтанно окисленным железом.
