Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами 10
1.1. Фосфонаты - фосфорорганические соединения с С-Р связью 10
1.1.1. Природные и синтетические фосфонаты 11
1.1.2. Микроорганизмы - деструкторы фосфонатов 14
1.1.3. Ферменты, разлагающие фосфонаты с активированной С-Р связью 16
1.2. Алкилфосфонаты с прямой неактивированной С-Р связью 22
1.2.1. С-Р лиаза, разлагающая С-Р связь алкилфосфонатов 22
1.2.2. Микроорганизмы - деструкторы алкилфосфонатов 24
1.3. Физиологическая и генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов 26
1.3.1. Физиологическая регляция разложения алкилфосфонатов...26
1.3.2. Генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов со стороны Pho регулона 29
1.3.3. Гены, кодирующие разложение алкилфосфонатов 32
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1.Бактериальные штаммы и плазмиды 38
2.2. Условия культивирования 39
2.3. Методы работы с ДНК 40
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК 40
2.3.2. Получение компетентных клеток 41
2.3.3. Среды и буферы 41
2.4. Субклеточное фракционирование 42
2.5. Аналитические методы 43
2.5.1. Анализ разложения Pn 43
2.5.2. Определение активности щелочной фосфатазы 44
2.5.3. Определение фосфолипидного состава мембран 45
2.5.4. Электрофорез белков 46
2.5.5. Определение концентрации белка 47
2.5.6. Определение ортофосфата 47
2.5.7. Определение общего фосфора 47
2.6. Облучение клеток УФ 48
2.7. Электронная микроскопия тонких срезов 48
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 50
3.1. Разложение метилфосфоната различными штаммами Е. coli 50
3.2. Адаптация клеток Е. coli к Рп 52
3.2.1. Влияние Рп на адаптацию 52
3.2.2. Влияние температуры на адаптацию к Рп 56
3.3. Селекция и характеристика клеток, адаптированных к Рп 57
3.3.1. Гетерогенность популяции и селекция адаптированных клеток 57
3.3.2. Разложение Рп адаптированными клетками 58
3.3.3. Физиологическая, биохимическая и морфологическая характеристики адаптированных клеток 65
3.4. Физиологические и биохимические факторы, влияющие на разложение Рп различными штаммами Е. coli 70
3.4.1. Влияние аэрации на разложение Рп 70
3.4.2. Влияние рН среды на разложение Рп 72
3.4.3. Влияние концентрация Рп на разложение Рп 73
3.4.4. Влияние возраста культуры на разложение Рп 74
3.4.5. Влияние концентрации клеток на разложение Рп 76
3.4.6. Влияние УФ облучения на разложение Рп 78
3.4.7. Влияние проницаемости мембран на разложение Рп 80
3.5. Разложение Рп рекомбинантными штаммами Е. coli 80
3.6. Выявление белков С-Р лиазного комплекса (продуктов phnGHIJKLMNOP генов) и их локализация в клетке 82
Выводы 87
Список литературы 88
- Алкилфосфонаты с прямой неактивированной С-Р связью
- Условия культивирования
- Субклеточное фракционирование
- Адаптация клеток Е. coli к Рп
Введение к работе
Актуальность проблемы. Фосфорорганические соединения, имеющие углерод-фосфорную связь (С-Р) - фосфонаты, широко распространены среди природных соединений во всех царствах живых существ, а так же среди химических веществ антропогенного происхождения - ксенобиотиков, бесконтрольно поступающих в окружающую среду и становящихся ее токсикогенным фактором. Углерод-фосфорная связь, особенно неактивированная С-Р связь алкилфосфонатов, очень устойчива к химическому гидролизу, термальному разрушению и фотолизу и расщепляется только прокариотическими микроорганизмами за счет функционирования фермента С-Р лиазы. Однако в отличие от ферментов, разлагающих фосфонаты с активированной С-Р связью (такие как фосфоноацетат и аминоэтил фосфонат), которые выделены и хорошо охарактеризованы, С-Р лиаза функционирует только в интактных клетках. Обнаружить ее в бесклеточных экстрактах пока достоверно не удалось, фермент до сих пор не выделен и не изучен, а механизм разложения алкилфосфонатов по С-Р лиазному пути не известен. Понимание механизма биодеградации алкилфосфонатов является, таким образом, актуальной задачей современной биохимии и биотехнологии. Не смотря на то, что способность бактерий использовать алкилфосфонаты в качестве единственного источника фосфора известна сравнительно давно (Zeleznick et al., 1963; Harkness, 1966; Cook et al, 1978; Wackett et al, 1987; Lee et al, 1992), особенно большой интерес к их деградации бактериями возник лишь в последние годы, в связи с экологическими проблемами, особенно, в связи с всемирной программой уничтожения химического оружия, в состав которого входят соединения с С-Р связью.
В настоящее время достаточно интенсивно проводится скрининг микроорганизмов, способных к деградации Pn (Hidaka et al, 1990; Kamigiri et al, 1992; Nakashita et a/.,2000). Большое внимание уделяется генетической характеристике системы. Гак, у Е. coli проведено картирование и молекулярное клонирование phn(psiD) генов, ответственных за С-Р лиазную активность, а также их мутационный анализ (Wanner and Boline, 1990; Metcalf and Wanner, 1993). Показано, что за использование фосфонатов клетками Е. coli отвечает кластер из 14 генов - одна из наиболее крупных транскрипционных единиц Е. coli, а экспрессия некоторых из них контролируется Pho-регулоном (Wackett et al., 1987). Между тем, понять механизм разложения алкилфосфонаюв по С-Р лиазному пути и иденитифицировать С-Р лиазную активность in vitro невозможно без знания физиологической и биохимической регуляции этого процесса в клетках бактерий. Однако систематических исследований в этом направлении практически не проводилось.
Цель настоящего исследования - выявить физиологические и биохимические особенности разложения алкилфосфонатов бактериями на примере грамотрицагельной бактерии Escherichia coli. У этой бактерии впервые была выявлена способность разлагать алкилфосфонаты и хорошо изучена іенетическая система, контролирующая этот процесс. В качестве
РОС НАЦДОИАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПетврвург^
модельного субстрата использовали метилфосфонат (Рп), как типичный алкилфосфонат.
В задачи исследования входили:
-
сравнительный анализ разложения Рп различными штаммами Е. coli;
-
изучение особенностей адаптации клеток Е. coli к Рп;
-
селекция и характеристика клеток, адаптированных к Рп;
4) поиск физиологических и биохимических факторов, влияющих на
разложение Рп различными штаммами Е. coli;
5) изучение разложения Рп рекомбинантными штаммами Е. coli,
содержащими клонированные гены С-Р лиазного комплекса, кодирующие
этот процесс;
6) выявление белков С-Р лиазного комплекса и изучение их локализации.
Научная новизна работы. В данной работе впервые показано, что
длительный латентный период при выращивании клеток на среде, содержащей Рп в качестве единственного источника фосфора, связан с адаптацией клеток к Рп, которая подробно изучена. Показано, что адаптация происходит эффективнее при 30 С, чем при 37 С, но не зависит от его концентрации и сопровождается изменением физиологических и морфологических характеристик клеточной популяции. Впервые проведена селекция адаптированных клеток, что на порядок повышает скорость разложения Рп и рост клеток на этом субстрате. Выявлены новые факторы, влияющие на разложение Рп клетками Е. coli: возраст культуры, температура культивирования, аэрация, рН среды и УФ-лучи. Определены оптимальные условия для разложения Рп: низкое парциальное давление кислорода, 30С, рН=8 и логарифмическая стадия роста культуры.
Путем анализа белкового состава рекомбинантных штаммов с клонированными в плазмидах генами С-Р лиазного комплекса впервые выявлены белки этого комплекса и их распределение между субклеточными фракциями. Впервые установлено, что повышенный синтез белков С-Р лиазного комплекса в условиях индукции кодирующих генов не приводит к увеличению активности С-Р лиазы и разложения Рп, что свидетельствует о существовании факторов неизвестной природы, лимитирующих этот процесс и не связанных с количеством белков С-Р лиазного комплекса.
Поиск этих факторов позволит не только повысить его эффективность, но и понять его механизм.
Научно-практическое значение работы. Полученные в работе новые данные расширяют представление о физиологической и биохимической регуляции процесса разложения алкилфософнатов клетками бактерий, что послужит основой для оптимизации биосинтеза С-Р лиазы и ее дальнейшего исследования in vitro с целью понимания механизма разложения алкилфосфонатов. Результаты могут быть полезны при разработке биотехнологии для биоремедиации почв.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103
Алкилфосфонаты с прямой неактивированной С-Р связью
Все перечисленные выше ферменты разлагают активированную С-Р связь фосфонатов. За расщепление неактивированной, а следовательно, наиболее стабильной связи С-Р отвечает фермент С-Р лиаза. Этот фермент разлагает алкилфосфонаты с образованием ортофосфата и соответствующих алканов, и встречается у бактерий, которые используют эти соединения в качестве единственного источника фосфора.
Однако С-Р лиаза проявляет свою активность только в клетках и никогда достоверно не была обнаружена в бесклеточных экстрактах (Murata et ah, 1988; Nakashita et ah, 1992) (определение такой активности in vitro, как оказалось, было некорректным (Murata et ah, 1989)). Это существенно ограничивает возможность изучения механизма действия этого фермента. Было предложено, однако, несколько гипотетических механизмов расщепления связи С-Р по С-Р лиазному пути (Cordeiro et ah, 1986; McMullan et ah, 1991). Первая рабочая гипотеза предполагала окисление клетками Е. coli, растущими в аэробных условиях, алкилфосфоновых кислот по первому углеродному атому, непосредственно связанному с фосфором, за счет внедрения атомарного или молекулярного кислорода в это положение (McMullan et ah, 1991). Образующиеся при этом а-гидроперокси-, а-гидрокси-, а-кето- или фосфомоноэфиры могли бы легко потребляться клетками. Однако исследования деградации алкилфосфонатов клетками этой бактерии с помощью изотопно-меченного материала не выявили интермедиатов, соответствующих предполагаемому механизму. Действительно, главным феноменом деградации метилфосфоновой кислоты клетками Е. coli является преимущественное образование в качестве конечного продукта реакции метана в соотношении 1:1 к образующемуся из алкилфосфонатов внутриклеточному фосфору. Этан, пропан, бутан, пентан и гексан образуется этими клетками при использовании соответствующих производных фосфоновой кислоты. Пристальное исследование продуктов деградации указанных алкилфосфонатов выявило также присутствие соответственно этена, пропена, бутена и т.д. Результаты анализа продуктов деградации алкилфосфонатов не укладываются, таким образом, в первоначально предложенный механизм и предполагают возможность другого механизма - редокс-зависимого свободно-радикального дефосфорилирования, вероятно, включающего также участие в реакции переходных металлов (Cordeiro et ah, 1986). Согласно этому механизму процесс инициируется образованием фосфонильного радикала, последующая фрагментация которого приводит к образованию метафосфата и алкильного радикала, который в свою очередь, акцептируя атом водорода, превращается в алкан. Образование алкильного радикала является специфической особенностью деградации алкилфосфонатов. Обнаружение среди продуктов деградации не только алканов, но и алкенов свидетельствует в пользу свободно-радикального механизма деградации. Каков конечный фосфорный продукт, до сих пор остается неясным. Предполагается, что образующаяся мономерная метафосфорная кислота, быстро реагируя с водой, образует ортофосфат. Однако есть и альтернативное предположение, согласно которому в катализе разложения связи С-Р принимают участие АТФ или другие нуклеотиды (Frost et ah, 1987). Учитывая, что среди продуктов деградации алкилфосфонатов имеется а-1-этилфосфонорибоза, не исключено, что именно нуклеотиды являются акцепторами фосфорильной группы алкилфосфонатов. Свободно-радикальный механизм деградации алкилфосфонатов косвенно подтверждается в ряде экспериментов (Frost et ah, 1987; Shames et ah, 1987). Химическое моделирование такого процесса было осуществлено с помощью реакции алкилфосфоновых кислот с тетраацетатом свинца и их электрохимического окисления на платиновом аноде (Cordeiro et ah, 1986). Образование алканов и алкенов в результате бактериальной деградации алкилфосфонатов и химической деградации алкилфосфонатов тетраацетатом свинца отражают определенную аналогию между биодеградацией и химической моделью, свидетельствуя в пользу свободно-радикального механизма биодеградации фосфонатов по С-Р лиазному пути.
Условия культивирования
Минеральная среда (Torriani , 1966) содержала (г/л): NaCl 4,68; КС1 1,49; NH4CI 1,07; трис-основание 6; глюкозу 5, MgS04 х 7 Н20 0,205; СаС12, 0,044; Na2S04, 0,099; FeCl3, 5,6 х 10"4; (рН=7,8), с добавлением бактофока (0,07%), тиамина (0,0002%), К2НР04 (1 мМ). Для поддержания плазмид pBW120, pGYl и pGY3 использовали ампициллин (100 мкг/мл). Клетки вносили с начальной ОП=0,05 и культивировали в стеклянных герметически закрытых пробирках объемом 15 мл, содержащих 5 мл среды при опытных температурах (30С, 37С). Рост клеток контролировали спектрофотометрически при 540 нм. При изучении влияния аэрации, пробирки продували дозированными порциями кислорода или азота. Для изучения влияния рН среды использовали буферы: 20 мМ Трис НС1 (рН=7,0-9,0); 20 мМ тригидрат ацетат натрия (NaOAc) (рН=4,0-6,0) (Досон и др., 1991); реакционная смесь содержала 60 мМ КС1, 14 мМ ацетата магния и 10 мМ глюкозы. При селекции адаптированных к Рп клеток, клетки предварительно инкубировали на минеральной среде с Рп в качестве единственного источника фосфора, а затем с одинаковым разведением (10"6) рассевали на чашки с агаризованной минеральной средой с Рп в качестве единственного источника фосфора. Выросшие на чашках крупные колонии отбирались (адаптированные к Рп клетки).
Для обеспечения биосинтеза С-Р лиазы, находящейся под контролем Pho-регулона, клетки выращивали на минеральной среде с Рі до середины логарифмической фазы роста. Затем клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, переносили на минеральную среду без пептона и ортофосфата и содержащую в качестве единственного источника фосфора Рп (0,5 мМ) и инкубировали при 30С на механической качалке. Для индукции С-Р лиазы, находящейся под контролем lacll промотора, клетки выращивали на среде LB до начала логарифмической стадии роста. Затем в среду роста добавляли IPTG (1 мМ), в качестве индуктора синтеза С-Р лиазы и инкубировали при 30С на механической качалке. Индуцированные клетки переносили на минеральную среду без пептона, содержащую в качестве единственного источника фосфора Рп (0,5 мМ) и инкубировали при 30С на механической качалке. Об активности индуцированных клеток судили по образованию в газовой фазе конечного продукта С-Р лиазной реакции -метана. Для остановки биосинтетических процессов использовали мертиолят в конечной концентрации 0,005%.
Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989) с некоторыми модификациями. 100 мл среды 2YT инокулировали колонией Е. соїї, несущей плазмиду, и инкубировали на роторной качалке при 37С (16-20 ч). Клетки осаждали центрифугированием (J2-21, JA-20, 4С, 4000 g, 5 мин). Полученный осадок ресуспендировали в 3,5 мл раствора I. Для лизиса клеток к осадку добавляли 8 мл раствора II, плавно перемешивали до полного просветления и инкубировали при 4С 10 мин. К лизату добавляли 6 мл раствора Ш, встряхивали и охлаждали во льду в течение 15 мин. Лизат центрифугировали (JA-20, 18000 g, 2С, 20 мин). К полученному супернатанту приливали 10,5 мл изопропанола, температуре 5 мин и центрифугировали (JA-20, 15000 g, 10C, 5 мин). Осадок промывали 2 мл 75 %-ного этилового спирта, подсушивали и растворяли в 900 мкл ТЕ-буфера. Раствор переносили в мини-пробирки. Осаждение РНК и хромосомной ДНК проводили путем добавления 50 мкл 1 М СаСЬ (до 50 мМ) и последующим центрифугированием в течение 1 мин (Eppendorf, 14000 об/мин).
Единичную колонию засевали в 5 мл 2YT и выращивали в течение ночи с качанием 12-14 ч при 37С. Ночную культуру разбавляли в 100 раз в 50 мл 2YT и выращивали при интенсивной аэрации в колбе Эрленмейера при 37 С до ОП=0,4. Дальнейшие процедуры проводили при 0С. Культуру охлаждали в течение 10 мин и центрифугировали 10 мин при 3000 g. Клетки ресуспендировали в 30 мл раствора 1 и оставляли во льду на 30 мин. Затем осаждали и осадок мягко ресуспендировали в 3 мл раствора 2. Компетентные клетки фасовали в мини-пробирки и хранили при -70С. Компетентные клетки, полученные данным способом, обеспечивали воспроизводимый уровень трансформации, который составлял 1x10 - 1x10 бактериальных клонов на 1 мкг ДНК в течение 2-3 месяцев хранения.
Субклеточное фракционирование
Получение субклеточных фракций проводили по методу Миуры и Мицусимы (Miura, Mizushima, 1968). Осажденные центрифугированием (MLW К-24, 5000 g) и промытые клетки суспендировали в стабилизирующем буфере и обрабатывали лизоцимом. За ходом лизиса следили по образованию осмотически лабильных клеток (сферопластов) по падению оптической плотности суспензии клеток в воде. (Пробы отбирали по 0,2 мл и добавляли в 2 мл воды или для контроля - в тот же объем стабилизирующего буфера). После падения оптической плотности в воде на 90% или менее (для получения качественной периплазмы) сферопласты осаждали при 16 000 g в течение 30-60 минут. Полученная надосадочная жидкость представляет собой периплазму, а осадок - сферопласты. Последние разрушали с помощью осмотического шока: осадок суспендировали в 0,5мл стабилизирующего буфера, а затем добавляли водный буфер 0,01 М трис-НСІ рН=7,5 с разведением 1/40, гомогенизировали в суспендиаторе, после этого добавляли 0,01 М MgCb. Нелизированные клетки осаждали центрифугированием (MLW К-24, 5000 g) в течение 10 мин. Мембранную фракцию осаждали ультрацентрифугированием при 40000 g в течение 60 мин. Полученный таким способом супернатант представлял собой фракцию клеточного сока, а осадок - мембраны. Для разделения белков цитоплазматической и наружной мембраны использовали метод селективной солюбилизации мембранных белков в Тритоне Х-100 (Schnaitman, 1971). Белки цитоплазматических мембран экстрагировали 2% Тритон Х-100 в присутствие 0,01 М MgCb, дважды. Осадок мембран осаждали центрифугированием при 40000 g в течение 90 мин. Полученный таким способом супернатант представлял собой фракцию цитоплазматических мембран. Белки внешних мембран экстрагировали из осадка 2% Тритон X-100 в присутствие 10 мМ ЕДТА, дважды, центрифугировали при 40000 g в течение 90 мин. Полученный супернатант представлял собой белковую фракцию внешних мембран.
Растворы для сферопластирования: Стабилизирующий буфер: 0,45 М сахароза, 50 мМ трис-HCl, рН=8,0. Лизирующий буфер: 0,01 М трис-НСІ, 0,01 М MgCl2, рН=8,0. Солюбилизирующий буфер: 0,01 М трис-НСІ , 0,01 М MgCl2, 2% (V/V) тритон-ХЮО, 4 мМ ФМСФ, рН=8,0.
Разложение метилфосфоната оценивали по образованию конечного продукта С-Р лиазной реакции - метана. Для этого через определенные промежутки времени из газовой фазы культуральной жидкости отбирали пробы по 0,2 мл и анализировали метан с помощью газового хроматографа GCD (фирма «Pay Unicam») с использованием стеклянной колонки, заполненой порапаком Q (80/100 меш), длиной 2 м. Газовый носитель - азот. Температура инъектора - 120С, колонки - 80С, детектора - 180С. Количество метана рассчитывалось по калибровочной кривой с использованием формулы: 1 М идеального газа = 22,4 х 10"3 м3 (при нормальной температуре и давлении) и выражали в нмоль/мл культуры. Анализ метана проводили в трех-восьми биологических повторах культуры. Контролем на присутствие абиогенного метана служили пробирки со средой, инкубированные без культуры, а контролем на присутствие метана, образуемого не из Рп, - культура, инкубированная на среде без Рп. Показателями разложения Рп служили образование метана и рост культуры при отсутствии таковых в контрольных вариантах. Концентрацию метана (нмоль) в газовой фазе на мл культуры рассчитывали по формуле: где: А - величина пика пробы при усилении 640;
В - величина пика при усилении 640, соответствующая 1мкл/мл метана. Эта величина может варьировать и определялась в каждом опыте; V газ.фазы - объем газовой фазы (мл); V культуры - объем культуры (мл).
При пересчете полученной концентрации метана (нмоль/мл) на единицу плотности культуры (ОП) определяли удельное разложение Рп клетками (метан, нмоль/ОП). Анализ разложения Рп выполнялся к.б.н. Лауринавичусом К.С.
Адаптация клеток Е. coli к Рп
Нам представлялось важным выяснить, достаточно ли для появления адаптивных мутантов и индукции С-Р лиазы только фосфорного голодания, как для других белков Pho-регулона, или для этого необходимо присутствие субстрата (Рп). Если предположить, что одной из причин наличия латентного периода может быть образование в условиях дефицита тех или иных питательных веществ и, особенно, в присутствие альтернативных источников питания, «адаптивных» мутантов (Wackett et al, 1987; Metcalfe/ al, 1990), то необходимость Pn становится очевидной. Кроме того, накопление таких «адаптивных» мутантов требует времени (Radicella et al, 1995).
Чтобы ответить на вопрос является ли присутствие Рп фактором, влияющим на скорость адаптации клеток к Рп, клетки Е. coli инкубировали в течение 72 часов на жидкой среде без источника фосфора (-Рі) в условиях полного фосфорного голодания и на среде, содержащей Рп в качестве единственного источника фосфора. После такой преинкубации клетки, с одинаковой оптической плотностью и разведением (в 10"6 раз), переносили на агаризованную среду, содержащую Рп, и выращивали до получения отдельных колоний в верхнем агаре. Затем проводили подсчет колоний. Предполагалось, что адаптированные клетки будут расти на твердой среде с Рп, в отличие от неадаптированных клеток. Оказалось, что клетки, преинкубированные с Рп дают в 6 раз больше колоний, чем клетки преинкубированные в отсутствие этого источника фосфора (табл. 2). При этом, клетки инкубированные при полном фосфорном голодании, будучи перенесенными на жидкую среду с Рп, не росли и не разлагали Рп, в отличие от клеток, преинкубированных с Рп.
Примечание. Клетки инкубировали на жидкой среде с Рп в течение 6 часов. В таблице представлены средние результаты семи опытов. Стандартное отклонение не превышало 10%.
Таким образом, присутствие Рп ускоряет адаптацию клеток к этому субстрату, по-видимому, за счет селективного давления на клеточную популяцию, ускоряя образование адаптивных мутаций. Можно предположить, что концентрация Рп может быть фактором, влияющим на скорость адаптации клеток к Рп. Например, при увеличении концентрации субстрата можно ожидать большего селективного давления на клеточную популяцию в условиях отсутствия других источников фосфора и таким образом, увеличения доли адаптированных клеток в общей клеточной популяции и, как следствие, большего разложения Рп популяцией. Чтобы проверить такое предположение, клетки Е. coli Е15 выращивали в течение 72 часов в присутствие различных концентраций Рп в качестве единственного источника фосфора, и наблюдали динамику роста клеток и разложения ими Рп. Несмотря на то, что при увеличении концентрации Рп его слабое разложение начинается уже в первые 24 часа инкубации (рис.2), в целом существенного влияния концентрация Рп на адаптацию клеток не оказывает.
Большинство бактерий, выявленных как деструкторы алкилфосфонатов, являются представителями грамотрицательных бактерий (Schowanek and Verstraete, 1990; Кононова и Несмеянова, 2002). Многие из них являются почвенными бактериями, растущими при 30С. Не исключено что эта температура является наиболее оптимальной для адаптации к этому субстрату в почве и для разложения Рп. Сравнение динамики разложения Рп клетками Е. coli Е15 и их роста при разных температурах культивирования (30 С и 37 С) показало (рис. 3), что при температуре 30 С, характерной для большинства почвенных бактерий - деструкторов Рп (Parker et at, 1999), клетки росли более интенсивно и разлагали этот субстрат уже через 24 часа инкубации. Удельное разложение Рп при 30С в 2 раза выше, чем при 37С.
