Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 18
1 Лигнинолитические грибы: деструктивный потенциал и физио- 18
логические особенности
1.1 Структура лигнинолитической ферментной системы и деградативные свойства грибов
1.2 Основные условия проявления грибами деструктивной активности и продукции лигнинолитических ферментов
1.3 Индукция продукции внеклеточных ферментов 27
1.3.1 Индукция ионами металлов 27
1.3.2 Органические вещества как индукторы 29
2 Метаболические пути деградации ПАУ лигнинолитическими грибами
2.1 Свойства ПАУ и проблема биодоступности 32
2.2 Ключевые метаболиты деградации ПАУ и продукция лигнино- литических ферментов
2.2.1 Деградация низкомолекулярных ПАУ 37
2.2.1.1 Деградация нафталина 37
2.2.1.2 Деградация фенантрена 39
2.2.1.3 Деградация и трансформация антрацена и антрахиноновых красителей
2.2.1.4 Деградация флуорена 51
2.2.2 Деградация и трансформация высокомолекулярных ПАУ 52
2.2.2.1 Деградация пирена 52
2.2.2.2 Деградация бенз[a]антрацена 56
2.2.2.3 Деградация и трансформация ПАУ с 5 и более конденсированными кольцами
2.2.3 Продукция лигнинолитических ферментов в процессе деградации ПАУ
3 Биотехнологический потенциал лигнинолитических грибов в з процессах микоремедиации 3.1 Микоремедиация как форма биоремедиации 64
3.2 Технологии и подходы микоремедиации 67
3.3 Примеры микоремедиации устойчивых поллютантов 70
3.4 Условия и факторы эффективной микоремедиации 75
3.4.1 Доза внесенного инокулята 76
3.4.2 Концентрация загрязнителя 76
3.4.3 Сопутствующее загрязнение 76
3.4.4 Оптимальные условия колонизации почвы лигнинолитическими 77
3.4.5 Влияние поверхностно-активных веществ 79
3.4.6 Индукция лигнинолитических ферментов 80
3.5 Продукция лигнинолитических ферментов в процессе микоре- 81 медиации
3.6 Взаимодействие интродуцированных лигнинолитических гри- 84 бов с почвенной микробиотой
3.7 Снижение токсичности и мутагенности почвы в процессе мико- 86 ремедиации
3.8 Возможности и ограничения микоремедиации 88
4 Ключевые ферменты деградации ПАУ лигнинолитическими 91
грибами
4.1 Внеклеточные формы лигнинолитических ферментов 91
4.1.1 Лигнин пероксидазы 92
4.1.1.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 92
4.1.1.2 Основные каталитические свойства 94
4.1.2 Mn-зависимые пероксидазы 100
4.1.2.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 100
4.1.2.2 Основные каталитические свойства 102
4.1.3 Гибридные пероксидазы ПО
4.1.3.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл ПО
4.1.3.2 Основные каталитические свойства 111
4.1.4 Лакказы 116 4.1.4.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 117
4.1.4.2 Основные каталитические свойства 120 4.2 Внутриклеточные и «поверхностные» формы лигнинолитиче- 138
ских ферментов
4.2.1 Пероксидазы 138
4.2.2 Лакказы 138
Экспериментальная часть 143
5 Материалы и методы 144
5.1 Объекты исследований и методы культивирования 144
5.1.1 Хранение лигнинолитических грибов и получение инокулята 144
5.1.2 Погруженное культивирование грибов 144
5.1.3 Твердофазное культивирование грибов 145
5.2 Исследование деградативной активности грибов 145
5.2.1 Деградация ПАУ 145
5.2.2 Синтетические красители, содержащие конденсированные аро- 145 матические кольца
5.2.3 Изучение деградации нефти в процессе микоремедиации почвы 146
5.3 Определение прироста мицелия 148
5.4 Методы экстракции 148
5.5 Хроматографические методы 149
5.5.1 Газожидкостная хроматография 149
5.5.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография 149
5.5.3 Тонкослойная хроматография 150
5.5.4 Адсорбционная хроматография 150
5.6 Спектральные методы 151
5.7 Определение эмульгирующей активности 151
5.8 Очистка и характеристика лигнинолитических ферментов 152
5.8.1 Получение грубых препаратов внеклеточных ферментов 152
5.8.2 Получение грубых препаратов «поверхностных» и внутрикле- 152 точных форм ферментов
5.8.3 Схема очистки лакказ и пероксидазы из погруженной культуры 153 P. ostreatus D1 5.8.4 Очистка лакказ из твердофазных культур P. ostreatus D1 и 154 Agaricus sp. F-8
5.8.5 Гибридная пероксидаза Bjerkandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst. 155
5.8.6 Определение активности ферментов 155
5.8.7 Определение каталитических характеристик ферментов 159
5.8.8 Ферментативное окисление ПАУ 159
5.8.9 Электрофорез 160
5.8.10 Определение молекулярных масс ферментов 160
5.9 Реактивы и материалы 161
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 163
6 Особенности метаболизма ПАУ лигнинолитическими грибами 163
6.1 Деградация ПАУ с тремя конденсированными кольцами 163
6.1.1 Фенантрен 163
6.1.1.1 Скрининг грибов на способность деградировать фенантрен и 163 продуцировать лигнинолитические ферменты
6.1.1.2 Деградация фенантрена при культивировании P. ostreatus D1 на 164 среде Кирка
6.1.1.3 Деградация фенантрена при культивировании P. ostreatus D1 на 172 богатой среде для базидиомицетов
6.1.1.4 Деградация фенантрена подстилочным сапротрофом Agaricus 175 sp. F-8
6.1.2 Антрацен и синтетические красители 177
6.1.2.1 Деградация антрацена грибом белой гнили P. ostreatus D1 177
6.1.2.2 Деградация антрацена подстилочным сапротрофом Agaricus sp. 182 F-8
6.1.2.3 Обесцвечивание синтетических красителей P. ostreatus D1 183
6.1.3 Деградация флуорена P. ostreatus D1 184
6.2 Деградация ПАУ с четырьмя конденсированными кольцами 189
6.2.1 Деградация пирена P. ostreatus D1 189
6.2.2 Деградация хризена P. ostreatus D1 196
6.2.3 Деградация флуорантена P. ostreatus D1 199
6.3 Деградация основных метаболитов ПАУ P. ostreatus D1 202 6.4 Продукция эмульгирующего вещества в процессе деградации 204
ПАУ P. ostreatus D1
7 Внеклеточные формы лигнинолитических ферментов 208
7.1 Лакказы гриба белой гнили P. ostreatus D1 и подстилочного са- 208
протрофа Agaricus sp. F-8
7.1.1 Очистка и характеристика лакказ из погруженной культуры P. 208
ostreatus D1
7.1.1.1 Продукция и очистка лакказ 208
7.1.1.2 Молекулярные свойства лакказы-1 210
7.1.1.3 Каталитические свойства лакказы-1 211
7.1.1.4 Очистка и характеристика минорных лакказ 222
7.1.2 Очистка и характеристика лакказы из твердофазной культуры P. 224
ostreatus D1
7.1.2.1 Подбор условий твердофазного культивирования гриба для получения лакказы
7.1.2.2 Очистка «желтой» лакказы 224
7.1.2.3 Молекулярные свойства «желтой» лакказы 226
7.1.2.4 Каталитические свойства «желтой» лакказы 227
7.1.3 Очистка и характеристика лакказы из твердофазной культуры 240
Agaricus sp. F-8
7.1.3.1 Продукция лакказы и ее очистка 241
7.1.3.2 Молекулярные свойства 244
7.1.3.3 Каталитические свойства 245
7.2 Пероксидазы грибов белой гнили Pleurotus ostreatus D1 и Bjer- 248
kandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.
7.2.1 Характеристика гибридной пероксидазы B. fumosa 137 (Pers.:Fr.) 248 Karst.
7.2.2 Очистка и характеристика пероксидазы P. ostreatus D1 264
7.2.2.1 Молекулярные свойства 265
7.2.2.2 Каталитические свойства 266
7.2.3 Обесцвечивание антрахиноновых красителей пероксидазами P. 272
ostreatus D1 и B. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.
8 Внутриклеточные и «поверхностные» формы лигнинолитичских ферментов гриба P. ostreatus D1
8.1 Влияние ПАУ на баланс внеклеточных, «поверхностных» и 279 внутриклеточных форм ферментов
8.2 Лакказы 283
8.2.1 «Поверхностные» формы лакказ: очистка и характеристика 283
8.2.2 Внутриклеточные лакказы: очистка и характеристика 287 8.2 Внутриклеточная пероксидаза: очистка и характеристика 292
9 Биотехнологический потенциал лигнинолитических грибов P. ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8 для микоремедиации нефтеза грязненной почвы
9.1 Скрининг лигнинолитических грибов по способности к деграда- 295 ции нефти
9.2 Исследование деградации нефти в условиях погруженного куль- 296 тивирования грибов
9.2.1 Деградация нефти при росте грибов на разных средах 296
9.2.2 Влияние рН на деградацию нефти P. ostreatus D1 298
9.2.3 Влияние поверхностно-активных веществ на деградацию нефти 299 P. ostreatus D1
9.2.4 Продукция лигнинолитических ферментов P. ostreatus D1 в присутствии нефти
9.3 Деградация ПАУ и других углеводородов нефти при культиви- 302
ровании лигнинолитических грибов в почве
9.3.1 Деградативная активность грибов белой гнили в почве 302
9.3.2 Деградация нефти в почве грибом P. ostreatus D1 303
9.3.2.1 Влияние интродуцированного мицелия P. ostreatus D1 на почвенную микрофлору
9.3.2.2 Изменение фракционного состава нефти в процессе микоремедиации почвы P. ostreatus D1
9.4 Микоремедиация почвы со старым нефтяным загрязнением подстилочным сапротрофом Agaricus sp. F-8
9.4.1 Рост гриба Agaricus sp. F-8 в загрязненной почве 311
9.4.2 Изменение фракционного состава нефти в процессе микореме- 312
диации почвы Agaricus sp. F-8
9.5 Продукция внеклеточных лигнинолитических ферментов в процессе микоремедиации нефтезагрязненной почвы
9.5.1 Деградативная активность лигнинолитических грибов в почве со старым нефтяным загрязнением
9.5.2 Продукция лакказ в процессе микоремедиации 317
9.5.3 Продукция пероксидаз в процессе микоремедиации 319
9.5.4 Модификация состава ароматических фракций в процессе микоремедиации
9.6 Грибы P. ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8 как перспективные кандидаты для создания эффективной технологии микоремедиации
Заключение 324
Выводы 334
Список сокращений 336
Список литературы
- Основные условия проявления грибами деструктивной активности и продукции лигнинолитических ферментов
- Деградация и трансформация антрацена и антрахиноновых красителей
- Оптимальные условия колонизации почвы лигнинолитическими
- Твердофазное культивирование грибов
Введение к работе
Актуальность исследований и состояние проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) огромный класс органических соединений, химическая структура которых включает два и более конденсированных бензольных кольца. Интерес к механизмам биодеградации и «судьбе» ПАУ в окружающей среде связан с их широким распространением, устойчивостью к деградации, аккумуляцией почвой и осадками, токсическими, мутагенными и канцерогенными свойствами (Juhasz and Naidu, 2000; Kanaly and Harayama, 2000; Mrozik et al., 2003; Peng et al., 2008; Haritash and Kaushik, 2009). Некоторые ПАУ отнесены национальными агентствами по защите окружающей среды к приоритетным поллютантам (http://www.defra.gov.uk/Environment /consult/airqual01/11.htm). ПАУ являются гидрофобными соединениями, сброс и случайное попадание которых в природную среду создает серьезную проблему, особенно в случае, когда биодеградативной активности природной микрофлоры не достаточно для их удаления или нейтрализации (Reddy, 1995; Juhasz and Naidu, 2000; Peng et al., 2008). Использование различных живых организмов лежит в основе высокоэффективных и относительно недорогих технологий детоксикации этих опасных поллютантов – биоремедиации (Mrozik et al., 2003). Для разработки и эффективного использования этих технологий необходимо всестороннее исследование организмов-деструкторов, метаболических путей деградации ПАУ, катализирующих их ферментных систем и условий окружающей среды, необходимых для оптимизации разрушения этих соединений.
Одними из наиболее активных деструкторов ПАУ являются грибы, разрушающие в природе лигниновый компонент древесины (лигнинолитические). К ним относятся деревообитающие (грибы белой гнили; в англ. white rot fungi) и почвообитающие (подстилочные сапротрофы; в англ. litter-decomposing fungi) базидиомицеты и некоторые виды аскомицетов (Buswell and Odier, 1987; Hatakka, 2001; Pointing, 2001; Wong, 2009). Ферментативная система этих грибов, катализирующая деградацию лигнина, является внеклеточной неспецифической и окислительной, что позволяет им, кроме природного субстрата, метаболизировать широкий спектр поллютантов и их смесей, давая значительное преимущество перед бактериями и нелигнинолитическими грибами (Cerniglia, 1992; 1997).
Основными лигнинолитическими ферментами являются лигнин пероксидаза, Mn-пероксидаза, гибридная пероксидаза (в англ. versatile peroxidase) и лакказа (Wong, 2009). До настоящего времени обсуждаются следующие ферментативные механизмы деградации ПАУ лигнинолитическими грибами: (а) лигнин пероксидазы и Mn-пероксидазы катализируют одно-электронное окисление ПАУ с потенциалами ионизации не более 7,55 eV с образованием соответствующих хинонов (Hammel et al., 1986; Vazquez-Duhalt et al., 1994; Field et al., 1996), которые далее могут быть метаболизированы через расщепление ароматического кольца (Hammel et al., 1991); (б) лакказы катализируют одно-электронное окисление ПАУ также с образованием хинонов, и каталитические возможности этих ферментов могут быть расширены в присутствии ряда легко окисляемых веществ, так называемых медиаторов (Johannes et al., 1996; Collins et al., 1996); (в) ПАУ, содержащие до шести ароматических колец, могут быть окислены в процессе перокисления липидов, катализируемого Mn-пероксидазами (Moen and Hammel, 1994; Bogan and Lamar, 1995).
Репрессии синтеза лигнинолитических ферментов не происходит, когда концентрации веществ снижаются до уровня, который неэффективен для их индукции, и, следовательно, они могут деградировать даже низкие концентрации поллютантов. В результате каталитического действия этих ферментов образуются полярные водорастворимые продукты, которые более доступны как для грибного метаболизма, так и для дальнейшей деградации природной почвенной микрофлорой. Лигнинолитические грибы обладают значительным потенциалом для использования в биоремедиационных технологиях (микоремедиации), особенно для соединений, которые трудно разлагаются бактериями.
Несмотря на то, что изучение деградации ПАУ лигнинолитическими грибами проводится довольно давно, до настоящего времени существует целый ряд пробелов в исследованиях, в основном касающихся регуляции метаболизма, доступности этих веществ для грибной клетки, участия и роли разных форм лигнинолитических ферментов. Без восполнения подобных пробелов невозможно глубокое понимание деградативных механизмов и практическое использование этих грибов.
Цель настоящего исследования – выявление основных закономерностей и механизмов регуляции метаболизма ПАУ лигнинолитическими грибами, характеристика и функции ферментов, катализирующих разные этапы деградации.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Исследование влияния условий культивирования на деградацию трех- (фенантрен, антрацен, флуорен) и четырехкольцевых (пирен, хризен, флуорантен) ПАУ и продукцию лигнинолитических ферментов грибами Pleurotus ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8. Идентификация основных метаболитов.
2. Выявление продукции эмульгирующего вещества в процессе деградации ПАУ P. ostreatus D1.
3. Очистка и определение молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав, спектры поглощения) и каталитических (рН-оптимумы, KM, Vmax, kcat для моноароматических субстратов, активность по отношению к ПАУ) свойств внеклеточных лакказ из погруженных и твердофазных культур грибов P. ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8.
4. Сравнительное исследование основных молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав) и каталитических (рН-оптимумы, KM, Vmax, kcat для моноароматических субстратов, активность по отношению к ПАУ) свойств пероксидаз P. ostreatus D1 и Bjerkandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.
5. Выявление активностей основных лигнинолитических ферментов P. ostreatus D1 на поверхности и внутри грибной клетки.
6. Выделение и определение основных молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав) и каталитических (рН-оптимумы, KM, Vmax, kcat для моноароматических субстратов, активность по отношению к ПАУ) свойств «поверхностных» и внутриклеточных форм лакказ и пероксидазы P. ostreatus D1.
7. Изучение деструктивного потенциала лигнинолитических грибов в процессе микоремедиации нефтезагрязненной почвы.
Научная новизна. На примере P. ostreatus D1 получены приоритетные данные об основных закономерностях и механизмах регуляции метаболизма ПАУ лигнинолитическими грибами. Установлена комбинированная роль лакказы и пероксидазы гриба в процессе деградации этих ксенобиотиков. Оба фермента могут катализировать окисление ПАУ, что предполагает их взаимозаменяемость в начальной атаке молекул этих веществ. Показано, что пероксидаза участвует в утилизации образовавшихся метаболитов. Впервые обнаружено образование эмульгирующего вещества в процессе деградации ПАУ P. ostreatus D1, коррелирующее с продукцией пероксидазы и обеспечивающее доступность гидрофобного субстрата для гриба.
Получены новые данные о каталитических свойствах внеклеточных форм лакказ гриба белой гнили P. ostreatus D1 и подстилочного сапротрофа Agaricus sp. F-8, показана их ключевая роль в деградации ПАУ этими грибами. Получены новые данные об ингибиторной и субстратной специфичности гибридной пероксидазы B. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst. Впервые из гриба белой гнили P. ostreatus D1 выделена пероксидаза, обладающая необычными каталитическими свойствами, отличающими ее от типичной гибридной пероксидазы B. fumosa и других известных лигнинолитических пероксидаз. Обнаружена способность исследованных пероксидаз окислять широкий ряд синтетических красителей антрахинонового ряда, что значительно расширяет каталитические возможности этих ферментов.
Впервые выделены и частично охарактеризованы «поверхностные» и внутриклеточные формы лакказ и пероксидазы P. ostreatus D1. Показана возможность участия «поверхностных» форм этих ферментов в начальной атаке молекулы ПАУ. Обнаружено, что каталитически активные внутриклеточные формы лакказ и пероксидазы не только могут быть предшественниками внеклеточных и «поверхностных» форм, но и участвовать в утилизации метаболитов ПАУ, проникающих в клетку.
Установлена способность лигнинолитических грибов метаболизировать широкий спектр углеводородов нефти, как в экспериментальных условиях, так и в условиях реального загрязнения.
На основании анализа данных литературы и сопоставления их с результатами собственных исследований впервые, на примере P. ostreatus D1, сделаны выводы об основных физиологических и энзимологических особенностях деградации ПАУ лигнинолитическими грибами.
Положения, выносимые на защиту:
1. Деградация трех- и четырехкольцевых ПАУ грибом белой гнили P. ostreatus D1 и почвенным сапротрофом Agaricus sp. F-8. происходит по одной схеме с образованием хинонов на первом этапе. Образование и последующая утилизация фталевой кислоты на последних этапах метаболизма ПАУ грибом P. ostreatus D1 предполагает ее включение в основной обмен.
2. Лакказа продуцируется на первых этапах деградации ПАУ P. ostreatus D1, приводящих к образованию хинонов, тогда как пероксидаза – на более поздних, приводящих к утилизации образовавшихся метаболитов. Существует зависимость «глубины» деградации ПАУ от набора лигнинолитических ферментов, продуцируемых грибом: накопление хинонов в условиях продукции лакказы и образование и последующая утилизация хинонов в условиях продукции лакказы и пероксидазы.
3. Продукция эмульгирующего вещества P. ostreatus D1 зависит от растворимости исследованных ПАУ и коррелирует с продукцией пероксидазы этим грибом.
4. Внеклеточные формы лакказ и пероксидазы, выделенные из погруженной культуры P. ostreatus D1, могут окислять ПАУ, что предполагает их взаимозаменяемость в начальной атаке молекулы. Пероксидаза окисляет метаболиты деградации ПАУ, тогда как для лакказы эти соединения не доступны.
5. «Желтые» формы внеклеточных лакказ, выделенные из твердофазных культур грибов P. ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8, способны окислять ПАУ без медиатора в реакционной смеси.
6. Пероксидаза P. ostreatus D1, обладает уникальными каталитическими свойствами, отличающими ее от гибридной пероксидазы B. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst. и других известных грибных лигнинолитических ферментов.
7. Молекулярные и каталитические свойства внеклеточных и «поверхностных» форм лакказ совпадают и отличаются от таковых внутриклеточных форм. Предположительно внутриклеточные формы являются каталитически активными предшественниками «поверхностных» и внеклеточных. «Поверхностные» формы лакказы могут катализировать начальную атаку молекулы ПАУ, когда активности внеклеточных форм еще недостаточно.
8. Твердофазные культуры лигнинолитических грибов, относящиеся к видам Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes, Coriolus sp. и Agaricus sp., способны колонизировать почву с нефтяным загрязнением, продуцировать лигнинолитические ферменты и активно деградировать нефтяное загрязнение. На основании проведенных исследований грибы P. ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8 могут быть предложены для разработки на их основе технологии микоремедиации.
Научно-практическая значимость. Результаты работы вносят вклад в понимание основных механизмов деградации ПАУ лигнинолитическими грибами. Полученные данные о метаболических путях, катализирующих их ферментах, и продуктах деградации ПАУ представляют значительный интерес для специалистов в области микробиологии, биохимии и биотехнологии.
Сведения, касающиеся выделения, очистки и каталитических свойств основных лигнинолитических ферментов важны для объяснения механизмов функционирования этих ферментов, а также для создания на их основе биокатализаторов.
Создана научная основа для разработки эффективной технологии микоремедиации с использованием деревообитающих и почвообитающих лигнинолитических грибов. На основании исследований способности метаболизировать нефть в условиях реального загрязнения, образовывать устойчивый и доминирующий мицелий и продуцировать лигнинолитические ферменты были отобраны гриб белой гнили P. ostreatus D1 и подстилочный сапротроф Agaricus sp. F-8. Комплексы этих грибов с почвенной микрофлорой являются перспективными для дальнейшего создания на их основе технологии микоремедиации нефтезагрязненных почв.
Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе могут быть использованы в организациях биологического и биотехнологического профилей, занимающихся исследованием деградации ксенобиотиков и разработкой технологий биоремедиации, а также при чтении курсов лекций по биохимии и микробиологии в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 1999 по 2013 гг. в лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой. Часть исследований выполнена в рамках договоров о сотрудничестве между Российской и Польской академиями наук в 2002-2013 гг. в Институте катализа и химии поверхности Польской академии наук (г. Краков) и на кафедре биохимии Университета им. Марии Кюри-Склодовской (г. Люблин). Изучение «поверхностных» и внутриклеточных форм лигнинолитических ферментов проводили в Центре исследований окружающей среды (Helmholtz Zentrum fr Umweltforschung UFZ; Лейпциг, Германия). Исследования поддержаны грантами фонда Й. Миановского (Польша, 2004 г.), Немецкой службы академических обменов (DAAD, №A0903583 по программе “Forschungsaufenthalte fr Hochschullehrer und Wissenschaftler” 2009-2010 гг.), Международного научно-технического центра (ISTC №3419.2, 2008 г.), государственным контрактом № 02.512.11.2210 с Роснаукой в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (2008-2009 гг.). Научные положения диссертации и выводы базируются на собственных исследованиях автора.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на 6 российских: Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 26-27 марта 2002 г., 10-12 октября 2006 г., 14-16 октября 2008 г.), «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 15-17 июня 2005 г.), Всероссийская конференция «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 23-27 сентября 2007 г.), Третий съезд микологов России (Москва, 10-12 октября 2012 г.) и 12 международных конференциях: Международная конференция «Биохимия и физиология культивируемых грибов» (Саратов, 6-8 июня 2002 г.), «12th International biodegradation and biodeterioration symposium (Prague, Czech Republic, 14-18 July 2002), «International symposium biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants» (Saratov, Russia, 28-30 July 2003), «International conference on protein stabilization» (Bratislava, Slovakia, 26-29 September 2004), «Грибы в природных и антропогенных системах» (Санкт-Петербург, 25-29 апреля 2005 г.), Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 14-16 сентября 2005 г.), «International symposium on environmental biotechnology» (Leipzig, Germany, 9-13 July 2006), IV Международная научная конференция «Биотехнология – охране окружающей среды» (Москва, 21-23 ноября 2006 г.), «Oxizymes and 9th International symposium on peroxidases (Leipzig, Germany, 14-16 June 2010), «Enzymes in the environment: Activity, ecology and applications» (Prague, Czech Republic, 14-17 July 2003; Viterbo, Italy, 15-19 July 2007; Bad Nauheim, Germany, 17-21 July 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 62 работы, в том числе 18 статей в российских и международных журналах из списка ВАК, 2 главы в книгах, 7 статей в сборниках, 35 тезисов конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 397 страницах, содержит 28 таблиц и 130 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Список литературы включает 22 российских и 564 зарубежных источников.
Обзор литературы по теме диссертации представлен 4 главами, включающими описание физиологических особенностей и деструктивного потенциала лигнинолитических грибов, краткую характеристику ПАУ как опасных загрязнителей окружающей среды, описание известных метаболических путей деградации ПАУ этими грибами, современные представления о каталитических механизмах и функциях основных лигнинолитических ферментов, а также анализ биотехнологического потенциала лигнинолитических грибов в процессах микоремедиации.
Основные условия проявления грибами деструктивной активности и продукции лигнинолитических ферментов
Позже было обнаружено, что Ph. chrysosporium метаболизирует и минерализует фенантрен не только в лигнинолитических, но и в нелигнинолитических условиях. Активности лигнинолитических пероксидаз также не были выявлены (Dhawale et al., 1992). На основании этого авторы предположили, что лигнин пе-роксидаза и Mn-пероксидаза не участвуют в деградации фенантрена Ph. chryso-sporium (Dhawale et al., 1992).
В то же время Hammel с соавторами (1992) показали, что Ph. chrysosporium окисляла фенантрен и фенантрен-9,10-хинон по C-9 и C-10 положениям с образованием продукта расщепления ароматического кольца, 2,2 -дифеновой кислоты, образование которой было большим в лигнинолитических, по сравнению с нелиг-нинолитическими условиями. Авторы предположили, что деградация фенантрена P. chrysosporium проходит по следующей схеме (Рисунок 4): (Hammel et al., 1992) и катализируется как лигнинолитическими, так и нелигнинолитическими ферментами. Так как внеклеточная лигнин пероксидаза Ph. chrysosporium не окисляла фенантрен in vitro, то посчитали маловероятным, что она катализирует первый этап метаболизма этого ПАУ in vivo (Hammel et al., 1992).
В более поздних исследованиях выявлена значимая роль и цитохром P-450, и Mn-пероксидазы в метаболизме фенантрена Ph. chrysosporium. Было показано, что микросомальная цитохром P-450 окисляла фенантрен, и реакция зависела от наличия NADPH. Одним из основных метаболитов фенантрена в лигнинолитиче-ской культуре и в микросомальных фракциях был фенантренrans-9,10-дигидродиол. Ингибитор P-450 – рiperonyl butoxide не оказывал влияния на активность Mn-пероксидазы, но при этом значительно ингибировал деградацию фе 42 нантрена и образование фенантренrans-9,10-дигидродиола в интактной культуре и в микросомальных фракциях. Кроме того, фенантрен эффективно деградировал-ся внеклеточной фракцией, содержащей высокую активность Mn-пероксидазы. На основании этого было предположено участие обоих ферментов и наличие двух путей (Рисунок 5) метаболизма фенантрена у Ph. chrysosporium (Ning et al., 2010). Способность деградировать ПАУ в последствие была изучена и у других видов Phanerochaete. Так, например, разные штаммы Ph. laevis (Bogan and Lamar, 1996) и Ph. sordida (Lee et al., 2010) метаболизировали от 55 до 66% этого веще ства. Ph. laevis относится к группе грибов, продуцирующих Mn-пероксидазу и лакказу, в отсутствие лигнин пероксидазы. Bogan и Lamar (1996) предположили, что способность Ph. laevis, в чьей лигнинолитической системе доминирует Mn пероксидаза, вызывать трансформацию фенантрена in vivo может быть сопряжена с перокислением липидов, катализируемым этим ферментом (Глава 4.2). В дан ном случае действия внеклеточных ферментов Ph. laevis достаточно не только для начального окисления фенантрена, но и для расщепления ароматического кольца образующихся метаболитов. Обнаружено, что продукты деградации фе нантрена Ph. laevis отличаются от таковых для Ph. chrysosporium. Ph. chrysosporium трансформирует ПАУ с накоплением веществ, которые могут быть конечными продуктами деградации, а Ph. laevis метаболизирует фенантрен лишь с незначительным накоплением хиноновых интермедиатов (Bogan and Lamar, 1996).
Более перспективным для практического использования является целый ряд других грибов белой гнили и подстилочных сапротрофов из-за их способности минерализовать большинство ПАУ до СО2 и Н2О (Sack et al., 1997a). Так, например, минерализация фенантрена обнаружена у P. ostreatus (Bezalel et al., 1996в), T. versicolor, Kuehneromyces mutabilis (Sack et al., 1997б), С. versicolor, I. lacteus (Song, 1997) и многих других.
P. ostreatus отличается от Ph. chrysosporium тем, что его лигнин-деградирующая активность коррелирует с продукцией лакказы, которая, как предполагают, может На основании структуры образованных метаболитов эти же авторы Bezalel et al., 1997) предположили, что первый этап трансформации фенантрена катализирует цитохром Р-450, которая включает атом кислорода в ксенобиотик, образуя фенантрен-9,10-оксид. Образовавшийся эпоксид нестабилен и подвергается дальнейшим реакциям с образованием фенантрен-9,10rans-дигидродиола. Продукт расщепления ароматического кольца – 2,2 -дифеновая кислота образуется из фенантрена через фенантренrans-9,10-дигидродиол или фенантрен-9,10-хинон. Роль лигнинолитической системы в механизме расщепления ароматического кольца P. ostreatus не ясна. 2,2 -дифеновая кислота может быть продуктом реакции и Mn-пероксидазы, и лакказы этого гриба. Однако показано, что выделение СО2 при деградации фенантрена P. ostreatus 188, который является слабым продуцентом лакказы, ниже, чем высоко-лакказным штаммом этого гриба (Bezalel et al., 1997).
В последние годы появилось много сообщений об исследовании деградации фенантрена широким спектром лигнинолитических грибов. Так, например, T. ver-sicolor, удалял около 46 и 65% этого ПАУ, добавленного в перемешиваемую и статическую культуры (Han et al., 2004). Гриб белой гнили Agrocybe sp. CU-43 ме-таболизировал около 99% из 100 ppm фенантрена (Chupungars et al., 2009), а Anhracophyllum discolor эффективно метаболизировал фенантрен в смеси с другими ПАУ (Acevedo et al., 2011). I. lacteus в зависимости от условий культивирования деградировал до 100% этого ПАУ (Cajthaml et al., 2008). Ganoderma lucidum мета-болизировала фенантрен при стартовой концентрации 2-50 мг/л и рН 4,0. Добавление в среду культивирования индукторов лакказы одновременно увеличивало и продукцию этого фермента и деградацию ПАУ, тогда как наличие в среде ингибиторов лакказы одновременно снижало ее активность и скорость деградации фе-нантрена (Ting et al., 2011). Образование фенантрен-9,10-дигидродиола с последующим его расщеплением до 2,2 -дифеновой кислоты в процессе деградации фенантрена грибом Lentinus tigrinus показано Covino с соавторами (2010).
Hadibarata с соавторами (2011) описали новый путь метаболизма фенантре-на грибом Polyporus sp. S133, включающий образование фенантрен-cis-9,10-дигидродиола (в отличие от соответствующей trans-формы обнаруживаемой у большинства лигнинолитических грибов) и последующее его ortho-расщепление с образованием 2,2 -дифеновой и салициловой кислот и пирокатехина. В данном случае авторы предполагают, что основные этапы катализируют лигнинолитиче-ские ферменты и внутриклеточные 1,2- и 2,3-диоксигеназы.
Представленные данные показывают, что начальные этапы окисления фе-нантрена лигнинолитическими грибами аналогичны, что выражается в наличии одних и тех же интермедиатов, таких как фенантренrans-9,10-дигидродиол и фе-нантрен-9,10-оксид. Однако конечные метаболиты могут быть различными, как это хорошо видно на примере Ph. chrysosporium и P. ostreatus. По-видимому, в метаболизме фенантрена у этих грибов могут быть задействованы различные ферментные системы. В частности следует отметить, что в процессе расщепления ароматического кольца фенантрена и образовании 2,2 -дифеновой кислоты Р. ostreatus предположительно участвует лакказа (Bezalel et al, 1996а; 1997). P. ostreatus известен как один из наиболее мощных продуцентов этого фермента. Вместе с тем, гриб Ph. chrysosporium лакказу не продуцирует или ее продукция незначительна. Образование коньюгата - 9-фенантрен-у#-0-глюкопиранозида в нелигнинолитических условиях делает метаболический путь деградации фенантрена этим грибом подобным путям деградации ПАУ почвенными грибами, в ходе которых также образуются глюкозидные и глюкуронидные коньюгаты (Cerniglia and Yang, 1984). В лигнинолитических условиях, когда Ph. chrysosporium продуцирует пероксидазы, как начальные этапы, так и этапы, приводящие к расщеплению ароматического кольца, может катализировать Мп-пероксидаза (Ning et al, 2010).
Деградация и трансформация антрацена и антрахиноновых красителей
Деградация флуорена – трехкольцевого ПАУ, содержащего кроме ароматических еще пятиуглеродный цикл, обнаружена у Ph. chrysosporium (George and Neufeld 1989; Bogan et al., 1996б), B. adusta и P. ostreatus (Bezalel et al., 1996в; Schtzendbel et al., 1999), Agrocybe sp. CU-43 (Chupungars et al., 2009) и ряда других лигнинолитических грибов.
Так, например, P. ostreatus при росте на богатой среде для базидиомицетов метаболизировал до 96% флуорена с образованием окисленных продуктов и 0,19% минерализовал до СО2 (Bezalel et al., 1996в). Доминирующие метаболиты были идентифицированы как 9-флуоренол и 9-флуоренон (Рисунок 10), за их образование могут отвечать цитохром Р-450 монооксигеназа и/или лакказа (Bezalel et al., 1996б,в). OH
9-Гидроксифлуорен и 9-флуоренон были также идентифицированы как доминирующие метаболиты деградация флуорена Ph. chrysosporium. По-видимому, основную роль в деградации флуорена этим грибом может играть Mn-пероксидаза (Bogan et al., 1996б). 9-Флуоренол и 9-флуоренон были идентифицированы как основные метаболиты деградации флуорена Agrocybe sp. CU-43, оба вещества не являются конечными продуктами (Chupungars et al., 2009).
9-Флуоренон, в свою очередь, также может быть субстратом для грибов белой гнили. Так, например, George и Neufeld (1989) показали, что при длительном культивировании Ph. chrysosporium происходит снижение концентрации этого вещества, кроме того гриб метаболизировал до 52% исходно добавленного синтетического 9-флуоренона (George and Neufeld, 1989). 9-Флуоренон образовывался и далее утилизировался грибом B. adusta (Schtzendbel et al., 1999).
Деградация пирена Лигнинолитические грибы способны не только к деградации, но и к минерализации четырехкольцевого ПАУ – пирена. Процент минерализации в значительной степени определяется видом гриба и составляет для I. lacteus – от 15,6 до 40% (по данным разных авторов), T. versicolor – 12,7%, Ph. chrysosporium– 7,0%, P. ostreatus – 2,5%, K. mutabilis– 5,1%, A. aegerita – 1,5% (Sack and Fritsche, 1997; Bezalel et al., 1996в; Sack et al., 1997б; Song, 1999; Novotny et al., 2000).
I. lacteus, T. versicolor, Ph. chrysosporium и P. ostreatus от 33 до 46% исходно добавленного вещества метаболизировали с образованием водорастворимых продуктов (Song, 1999). Присутствие гидроксилированных продуктов деградации пи-рена обнаружено и в культурах грибов A. aegerita, K. mutabilis (Sack and Fritsche, 1997), I. lacteus (Song, 1997), G. lucidum (Ting et al., 2011), Ph. chrysosporium, Ph. sordida (Lee et al., 2010), Agrocybe sp. CU-43 (Chupungars et al., 2009) и многих других. Доминирующий продукт был идентифицирован как пиренrans-4,5-дигидродиол (Evans et al., 1981; Field et al., 1992). Этот метаболит является общим для деградации пирена у многих грибов (Sack and Fritsche, 1997).
Путь образования пиренrans-4,5-дигидродиола, по-видимому, аналогичен пути образования фенантренrans-9,10-дигидродиола (Рисунок 11). Некоторые авторы предполагают, что за формирование дигидродиолов у P. ostreatus также могут отвечать цитохром Р-450 и эпоксид гидролаза (Bezalel et al., 1996а).
Активности Mn-пероксидазы в этих условиях обнаружено не было, а активность лакказы в этих же условиях достигала максимума одновременно с максимумом минерализации этого ПАУ (Bezalel et al., 1996в).
Позднее более подробно путь метаболизма пирена был описан Hadibarata с соавторами (2013в). Гриб Armillaria sp. в условиях погруженного культивирования метаболизировал до 63% пирена с образованием 1-гидроксипирена, фе-нантровой, 1-гидрокси-2-нафтоевой, фталевой и протокатеховой кислот. Протока-теховая кислота была конечным продуктом деградации пирена этим грибом (Рисунок 12). По мнению авторов, ключевую роль в этом процессе играют внеклеточная лакказа и внутриклеточная 1,2-диоксигеназа (Hadibarata et al., 2013в).
Способность метаболизировать пирен была обнаружена и у почвообитаю-щих базидиомицетов. Основные метаболиты деградации пирена грибами Crinipel-lis stipitaria JK375 и C. stipitaria JK364 были идентифицированы 1-гидроксипирен, 1,6-дигидропирен, 1,8-дигидроксипирен, 1,6-пиренхинон и 1,8-пиренхинон. ЛІ
Предполагаемая схема метаболизма пирена грибом C. stipitaria JK375 представлена на рисунке 13 (Lange et al., 1994). Окисление C-1 положения приводит к образованию 1-гидроксипирена, который коньюгирует с сульфатом в 1-пиренсульфат. При окислении по 4,5-положению пирена, образуется trans-4,5-дигидродиол. Реакции коньюгации фенольных производных ПАУ в основном рассматривают как важные для детоксикации ксенобиотиков. 1-Пиренсульфат, доминирующий метаболит, образуемый C. stipitaria JK 364, был обнаружен только в мицелии и не секретировался в среду культивирования (Lange et al., 1994).
(Hadibarata et al., 2013в) В отличие от штамма JK364, С. stipitaria JK375 метаболизирует пирен в 1-гидроксипирен и 1,6- и 1,8-дигидроксипирены, также как и в 1,6- и 1,8-пиренхиноны. Была обнаружена продукция внеклеточной лакказы, которая может также отвечать за образование пиренхинонов. Это показывает, что трансформация и деградация ПАУ базидиомицетами может быть не только видоспецифич ными, но и штаммоспецифичными (Lange et al, 1994).
Рисунок 13 – Предполагаемая схема метаболизма пирена грибами Crinipellis stipitaria JK375 и JK364 (Lange et al., 1994) В более поздних исследованиях способность метаболизировать пирен была выявлена у ряда подстилочных сапротрофов, включая S. rugosoannulata и S. coro 56 nilla (Steffen et al., 2002б). Стимулирующий эффект Mn2+ не только на продукцию Mn-пероксидазы, но и деградацию, и минерализацию этого ПАУ показан для гриба S. coronilla. Авторы полагают, что наличие Mn-пероксидазы может быть необходимым для минерализации ПАУ этим грибом (Steffen et al., 2002).
Еще один четырехкольцевой ПАУ – бенз[a]антрацен также метаболизиро-вался с образованием хиноновых производных, что типично для деградации этих веществ лигнинолитическими грибами (Vyas et al., 1994). Только незначительные количества хиноновых продуктов накапливались в культурах Ph. laevis (Bogan and Lamar, 1996) и Lentinus tigrinus (Vyas et al., 1994), эти метаболиты быстро утилизировались.
Подробно путь метаболизма бенз[a]антрацена был описан Cajthaml с соавторами (2006) на примере гриба I. lacteus. На первом этапе до 70% бенз[a]антрацена трансформировалось в бенз[a]антрацен-7,12-хинон. Дальнейшая деградация этого продукта происходила по двум путям, один из которых был подобен пути деградации антрацена этим же грибом (Рисунок 14).
Бенз[a]антрацен-7,12-хинон метаболизировался с образованием 1,2-нафталиндикарбоновой и фталевой кислот, которые, в свою очередь, превращались в 2-гидроксиметилбензойную кислоту или монометиловый и диметиловые эфиры фталевой кислоты. Другой продукт деградации бенз[a]антрацен-7,12-хинона был идентифицирован как 1-тетралон. Его деградация через 1,4-нафталиндион, 1,4-нафталиндиол и 1,2,3,4-тетрагидро-1-гидроксинафталин снова приводила к фталевой кислоте. Ни один из выявленных интермедиатов не являлся конечным у данного гриба (Cajthaml et al., 2006).
Подобный путь метаболизма бенз[a]антрацена, с образованием соответствующего хинона и фталевой кислоты, позже был описан у аскомицета Fusarium solani. Высокий титр лакказы, при полном отсутствии активностей лигнинолити-ческих пероксидаз, позволил авторам предположить, что именно этот фермент является ключевым в деградации ПАУ (Wu et al., 2010).
Оптимальные условия колонизации почвы лигнинолитическими
Анализ экстрактов культуральной жидкости проводили в системе следующего состава: бензол 9:этанол 1 (Song, 1999). Использовали пластины с силикаге-лем Silufol UV-254 ("Kavalier", Чехия). Rf продуктов реакции определяли как отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному растворителем (Гааль и др., 1992).
Для выделения продуктов деградации ПАУ была использована препаративная ТСХ в этой же системе. Пятна, соответствующие метаболитам, вырезали, вещества элюировали (хлороформом, этилацетатом или ацетонитрилом) и анализировали хроматографическими методами как описано выше или спектрофотомет-рически (Подглава 5.6).
Адсорбционная хроматография Адсорбционная хроматография с гравиметрическим окончанием была ис пользована нами для определения общего содержания нефти в образцах почвы в экспериментах по микоремедиации. Образцы почвы высушивали при 60С до воздушно-сухого состояния, растирали в ступке и аликвоту 1 г наносили на ко лонку с Al2O3 (объем колонки 10 мл), предварительно уравновешенную 10 мл хлороформа. Нефть элюировали хлороформом до полного обесцвечивания элюата. Элюат высушивали до полного испарения растворителя и определяли ко личество нефти весовым методом.
Изменение фракционного состава нефти также определяли методом адсорбционной хроматографии с последующим поляриметрическим и гравиметрическим анализом. Образцы почвы высушивали при 60С до воздушно-сухого состояния, растирали в ступке и аликвоту 5 г наносили на колонку с Al2O3 (объем колонки 56 мл), предварительно уравновешенную 60 мл гексана. Фракцию парафинов элюировали 40 мл гексана и идентифицировали по показателю преломления Nd=1,41-1,43. Нафтены (Nd=1,45-1,49) элюировали 60 мл гексана, фракцию моно-и бициклической ароматики (Nd=1,49-1,53) - 100 мл смеси 15% бензола в гексане, ПАУ (Nd 1,59) - 100 мл бензола, спирто-бензольные смолы - 80 мл смеси (1:1)
Процесс обесцвечивания синтетических красителей в процессе культивирования грибов и в ферментативных реакциях контролировали по изменению спектров поглощения в диапазоне 220-800 нм и убыли поглощения при следующих длинах волн, определенных экспериментально (нм): ализариновый красный – 505, акридиновый оранжевый – 470, нейтральный красный – 525, бутилродамин C – 560, родамин 6G – 500, сафранин T – 515, эозин – 520.
Спектры поглощения электрофоретически гомогенных ферментов фиксировали в 50 мМ Na-фосфатном буфере рН 6,0, при концентрации белка не менее 0,8 мг/мл, в диапазоне 200-800 нм. Величины Rz пероксидаз, свидетельствующие о чистоте препарата, определяли как соотношение величин поглощений при 403 и 280 нм (The protein protocols, 2002).
Концентрацию белка определяли по методу Bradford (1976).
Определение эмульгирующей активности Для выявления способности грибов к продукции биоПАВ в процессе деградации ПАУ и их производных, эмульгирующую активность культуральной жидкости тестировали методом Купера (Cooper, 1996). Культуральную жидкость смешивали с керосином в соотношении 2:3, встряхивали в течение 20 мин в мерной пробирке и оставляли на 48 часов при комнатной температуре для разделения. Эмульгирующую активность (Е48) вычисляли как соотношение объема эмульсии к общему объему жидкости и выражали в процентах. 152 5.8 Очистка и характеристика лигнинолитических ферментов 5.8.1 Получение грубых препаратов внеклеточных ферментов
Для получения грубого ферментного препарата из погруженной культуры, P. ostreatus D1 выращивали на богатой среде для базидиомицетов в течение 7-10 сут. для получения лакказ и 14-24 сут. для получения пероксидазы. Мицелий удаляли фильтрованием через 4 слоя марли, культуральную жидкость замораживали для удаления внеклеточных полисахаридов. Ферментный препарат был стабилен при хранении при -20С.
Для получения грубого ферментного препарата из твердофазных культур грибы P. ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8 выращивали на лузге подсолнечника 9-14 суток. Ферментированную лузгу (5 г) промывали трижды, по 20 мл дистиллированной воды. Водные экстракты объединяли, фильтровали через 4 слоя марли центрифугировали 40 мин при 5000 об/мин и замораживали для удаления внеклеточных полисахаридов. Ферментный препарат был стабилен при хранении при -20С.
Для получения грубых ферментных препаратов поверхностных и внутриклеточных форм ферментов P. ostreatus D1 выращивали на богатой среде для ба-зидиомицетов в течение 7-10 сут. для получения лакказ и 14-24 сут. для получения гибридной пероксидазы. Мицелий отделяли фильтрованием через 4 слоя марли и промывали трижды 50 мМ NaK-фосфатным буфером (рН 6,0) для удаления фракции внеклеточных ферментов.
Затем мицелий переносили в колбу добавляли 0,1 M фосфат-цитратный буфер рН 7,0 в соотношении 10 мл буфера на 1 г сырой биомассы. Колбы закрывали и встряхивали на шейкере (Shaker 3015, GFL, Burgwedel) при комнатной температуре 30 мин. Мицелий и супернатант разделяли центрифугированием в течение 15 мин при 4C и 5000 об/мин. Процедуру повторяли 4-5 раз до полного исчезновения активности ферментов в супернатанте. Фракции, содержащие «поверхност 153 ные» ферменты, собирали, концентрировали ультрафильтрацией на ячейке Amicon PM-10 (Millipore, США) и использовали в качестве грубого ферментного препарата.
Оставшийся мицелий гомогенизировали в фарфоровой ступке с кварцевым песком, ферменты экстрагировали 0,1 M фосфат-цитратным буфером рН 7,0 (15 мл на 3 г биомассы) в течение 2 ч. Полученный экстракт центрифугировали 20 мин при 5000 об/мин для удаления неразрушенных клеток и их фрагментов. Процедуру повторяли дважды. Супернатант использовали в качестве источника внутриклеточных ферментов.
Твердофазное культивирование грибов
Все ПАУ, выбранные нами для исследований, относятся к группе соединений, включенных Environmental Protection Agency (USA) в список особо опасных для окружающей среды (Majcherzyk et al., 1998). Растворимость этих соединений в водных растворах очень низкая и не превышает 0,003-1,3 мг/л (Cerniglia, 1993). Добавление детергентов и/или органических растворителей увеличивает их растворимость и позволяет достоверно оценить количество ПАУ и выявить продукты реакции. Основываясь на предварительных данных, для экспериментов с лакка-зой-1 мы использовали растворы, содержащие 1% растворителя (ацетонитрил) и 2 мМ детергента АОТ (бис-2-(этилгексил) сульфосукцинат натриевая соль). В этих условиях лакказа-1 сохраняла около 100% активности в течение всего времени эксперимента. Все результаты были подсчитаны по отношению к контрольным вариантам, содержащим фермент, инактивированный кипячением.
Было обнаружено, что лакказа-1 не окисляла все исследованные ПАУ без медиатора в реакционной смеси. Добавление АБТС приводило к их окислению ферментом. Использование ВЭЖХ на колонке Spherisorb PAH показало наличие продуктов реакций окисления со временем удерживания (мин): антрацена - 13,8, фенантрена - 13,5, флуорена - 12,8, пирена - 16,0, для перилена было обнаружено наличие двух продуктов реакции со временем удерживания 7,3 и 8,6 мин. Спектры поглощения экстрактов реакционных смесей также показали наличие дополнительных максимумов, соответствующих продуктам реакции (Рисунок 61).
Наиболее вероятными продуктами лакказного окисления ПАУ являются соответствующие хиноны (Johannes et al., 1996). Сравнение ВЭЖХ времен удерживания выявленных продуктов реакции с таковыми стандартных соединений позволило нам идентифицировать 9,10-антрахинон как продукт окисления антрацена, фенантрен-9,10-хинон – фенантрена и 9-флуоренхинон – флуорена.
Количественные исследования показали, что 1 Ед./мл лакказы-1 окисляла только антрацен 91% за 2 сут. инкубации. Увеличение времени инкубации до 10 сут. приводило к окислению и других исследованных субстратов (%): фенантрена - на 72±4,0, флуорена - на 53,5±6,1, пирена - на 65,5±2,7 и перилена - на 73±3,8.
При увеличении концентрации фермента до 10 Ед./мл все исследованные ПАУ окислялись в течение 2 сут (%): флуорен - на 43,2±2,8, пирен - на 72,3±5,3, перилен - на 46,6±1,4. Одновременное увеличение концентрации фермента и времени инкубации приводило к деградации также и флуорантена на 69,7±7,0% (Рисунок 63).
Вместе с тем, Pickard с соавторами (1999) не обнаружили окисления пирена и флуорантена лакказой Coriolopsis gallica в присутствии АБТС.
ПАУ, использованные в нашей работе, состоят из 3-5 конденсированных ароматических колец. Мы не обнаружили корреляции между количеством ароматических колец и скоростью окисления этих соединений. Среди 3-кольцевых соединений только антрацен легко окислялся лакказой-1 в течение двух суток инкубации. 5-кольцевой перилен окислялся значительно быстрее, чем 4-кольцевые пи-рен и флуорантен. Мы не обнаружили корреляции между потенциалами ионизации (IP) исследованных ПАУ и скоростью их окисления системой лакказа-медиатор. Например, антрацен с большим значением IP (7,43 eV), был лучшим субстратом для лакказы-1, чем перилен с IP=6,97 eV. 3-кольцевой фенантрен с
Можно предположить, что ПАУ, содержащие в центре структуры ароматическое кольцо и другие ароматические кольца, симметрично расположенные по отношению к центральному, могут быть хорошими субстратами для лакказы (72-91% окисления). Наличие дополнительного ароматического кольца, как например у пирена, снижает скорость окисления до 65,5±2,7%. Скорость реакции снижается еще больше, если центральная часть молекулы занята циклической неароматической структурой, вместо ароматической (например, флуорен). Наличие в структуре молекулы не только пяти-углеродного кольца, но и ассиметрично расположенных заместителей делает молекулу ПАУ еще более устойчивой для лакказного окисления. Например, только 10 Ед./мл лакказы окисляли флуорантен при увеличении времени инкубации до 10 сут. Вероятно, каталитическая активность лакказ по отношению к ПАУ определяется не только IP, но и пространственной структурой этих субстратов. Например, ПАУ, содержащие в центре ароматическое кольцо и ароматические кольца, расположенные симметрично по отношению к цен 218
Окисление фенантрена лакказой-1 в разных условиях Долгое время считали, что каталитическая активность системы лакказа-медиатор ограничена потенциалом ионизации (IP) субстрата, который не может превышать 8,0 eV. Так Collins с соавторами (1996) не выявили активности лакка-зы T. versicolor по отношению к фенантрену и объяснили это высоким IP субстрата, а для лакказы Coriolopsis gallica показан лишь невысокий уровень окисления фенантрена в присутствии АБТС (Pickard et al., 1999). Однако Bhmer с соавторами (1998) обнаружили, что окисление фенантрена системой лакказа-1-гидроксибензотриазол возможно в присутствии ненасыщенных липидов. Авторы предположили, что в этом случае происходит сопряжение двух реакций перокис-ления липидов и окисления фенантрена. Они показали, что в качестве медиатора в этом случае может быть только 1-гидроксибензотриазол, в присутствии АБТС или 3-гидроксиантраниловой кислоты реакции не происходило. Далее обнаруженное явление не исследовалось, но авторы предположили, что 1-гидроксибензотриазол образует более реакционно-способные интермедиаты, чем АБТС или 3-гидроксиантранилровая кислота (Bhmer et al., 1998).
Мы исследовали влияние различных детергентов на активность лакказы по отношению к фенантрену. Из рисунка 64 видно, что лакказа-1 Pleurotus окисляла фенантрен в присутствии АБТС. Подобно Bhmer с соавторами (1998) мы обнаружили лишь следовое (10,6±0,1%) окисление фенантрена парой лакказа-АБТС без детергента в реакционной смеси. Внесение детергентов приводило к значительной убыли фенантрена: в присутствии твин-80 - 49,2±3,5% и в присутствии АОТ – 72±2% в течение 10 сут. Наибольшее окисление в присутствии АОТ было неожиданным, это не может объясняться сопряжением с реакцией перокисления липидов, так как АОТ не содержит в своей структуре ненасыщенных углеводородных цепей.
