Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1.1. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БАЗИДИОМИЦЕТОВ - КСИ-
ЛОТРОФОВ И ПРИСПОСОБЛЕННОСТЬ ИХ ПОПУЛЯЦИЙ
К ОБИТАНИЮ В ЭКОСИСТЕМЕ
Общая характеристика базидиомицетов 17
Роль базидиальных грибов в болезнях леса 24
1.2. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ВЫСШИХ 42
ДЕРЕВОРАЗРУШАЮЩИХ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
1.2.1 .Систематика высших дереворазрушающих грибов 42
Базидиальные грибы как источник питательных веществ 46
Биологически активные вещества дереворазрушающих 61 базидиомицетов
Ферментативная активность 62
Антимикробная и фунгистатическая активность 70
Противоопухолевая активность 77
Токсикогенная и психогенная активность 85
Гиполипидемическая, гипотоническая, гипогликемическая 88 и антиоксидантная активность
1.2.3.6. Биологически активные вещества базидиомицетов как средство ме- 91
дико - биологического воздействия в условиях экологического неблагопо
лучия
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, ОБЪЁМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 99
Культивирование продуцента 102
Методы определения антимикробной активности 104 продуцента
Методы биохимического исследования биомассы продуцента и белково 108
- углеводных комплексов, получаемых биоконверсией лигноцеллюлозных отходов
Методы исследования химического состава отходов целлюлозно - бу- 111 мажной промышленности и белково - углеводных комплексов
Методы выделения и идентификации биологически активных веществ, 113 синтезируемых продуцентом
Метод определения интенсивности автолиза биомассы тест - культур 117
Методы выделения полисахаридов клеточной стенки продуцента и оп- 118 ределения их химического состава
Методические подходы к исследованию влияния полисахаридов на 120 функциональную активность иммунокомпетентных клеток человека
Токсикологические методы токсикологических исследований 121
Методы исследованияи влияния препарата Леван - 2 на рост мико- 124 бактерий in vitro
Моделирование воспалительного процесса и туберкулёзной инфек- 125 ции
Методические подходы к определению возможности использования 127 Левана - 2 для лечения и профилактики желудочно - кишечных заболеваний новорожденных телят
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ 129
ПРОДУЦЕНТА CORIOLUSPUBESCENS (SHUM.: FR.)QUEL
Изучение антибиотической активности гриба С. pubescens 130
Исследование динамики роста продуцента С. pubescens 136
Исследование природы антимикробной активности гриба 139 Coriolus pubescens
Исследование антимикробных веществ, синтезируемых 144 С. pubescens, на интенсивность автолиза клеток бактерий
Сравнительная оценка активности кориопубесцина в отношении 150 микроорганизмов, выделенных от больных хирургического профиля
Сравнительная оценка активности препарата, получаемого на основе 155 гриба С. pubescens, в отношении полирезистентных штаммов бактерий
Сравнительная оценка активности препарата, получаемого на основе 160 гриба С. pubescens, в отношении возбудителей заболеваний семейства Enterobacteriaceae
ГЛАВА 4. ТВЕРДОФАЗНАЯ ФЕРМЕНТАЦИЯ ГРИБА С. PUBESCENS И 164
УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ ДЕРЕВООБРАБАТЫВАЮЩЕЙ, ЦЕЛЛЮ-
ЛОЗНО - БУМАЖНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
ГЛАВА 5. ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ 180
БИОТЕХНОЛОГИИ МЕТОДОМ ЖИДКОФАЗНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ
ГРИБА С. PUBESCENS
ГЛАВА 6. ПОЛИСАХАРИДЫ ГРИБА С. PUBESCENS КАК НЕСПЕЦИ- 193
ФИЧЕСКИЕ СТИМУЛЯТОРЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Выделение полисахаридов клеточных стенок С. pubescens 199
Изучение химического состава полисахаридных фракций 201
Исследование тенденций влияния полисахаридов клеточной стенки 202 С. pubescens на функциональную активность иммунокомпетентных клеток ГЛАВА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ 207 ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ИНГРЕДИЕНТА ЛЕВАН -1
НА БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВАХ
7.1. Использование технологического ингредиента при производстве 207
хлебопекарных дрожжей
7.1.1 .Особенности производства прессованных хлебопекарных дрожжей 208
и методы борьбы с посторонней микрофлорой
Исследование возможности использования технологического 215 ингредиента Леван - 1 при производстве хлебопекарных дрожжей
Изучение влияния технологического ингредиента Левана - 1 218 на процесс ферментации в полупромышленных условиях
Изучение влияния Левана - 1 на показатели качества дрожжей 222 в промышленных условиях
Определение видового состава физиологических групп 234 микроорганизмов - вредителей дрожжевого производства
Исследование влияния технологического ингредиента на 248 различные виды микроорганизмов - представителей посторонней микрофлоры дрожжевого производства
7.2. Использование технологического ингредиента при 249
производстве спирта
ГЛАВА 8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ 252
ВЕЩЕСТВ ПРОДУЦЕНТА С. PUBESCENS В ВЕТЕРИНАРИИ
8.1 .Определение возможности использования антимикробного 252
препарата на основе С. pubescens для лечения и профилактики
желудочно - кишечных заболеваний новорождённых телят
8.2. Токсико - биологические свойства продуцента С. pubescens и анти- 256
микробного препарата, получаемого на его основе
Исследование токсико - биологических свойств гриба 257 Coriolus pubescens
Исследование острой токсичности антибактериального 261 препарата Леван - 2
Определение местно - раздражающего и сенсибилизирующего 266 действия гриба С. pubescens и препарата Леван - 2
Гистологическое исследование внутренних органов животных, 270 подвергавшихся воздействию гриба С. pubescens и препарата Леван - 2
8.3. Исследование лечебной эффективности препарата Леван - 2 при 271
желудочно - кишечных заболеваниях новорождённых телят ГЛАВА 9. МЕДИКО - БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИМИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА, ПОЛУЧАЕМОГО НА ОСНОВЕ С. PUBESCENS
Исследование противовоспалительной активности препарата Леван
Исследование противотуберкулёзной активности антимикробного препарата
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЯ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Высокий уровень техногенной нагрузки в Иркутской области, особенно в городах Ангарске, Братске, Шелехове, Усолье -Сибирском, Зиме, Иркутске, Черемхове, вызвал значительное ухудшение экологической обстановки. Экологически обусловленная часть повышенного риска нарушений здоровья связана с факторами преимущественно следующих видов воздействия: тератогенного, эмбриотоксического, общетоксического, канцерогенного и генетического. Безусловно, в этих условиях кардинальным вопросом является переход на более совершенные технологии, замкнутые циклы, новое оборудование, современную очистку промышленных выбросов. Однако, немаловажное значение имеет также внедрение методов медико - биологического воздействия на население с целью повышения сопротивляемости организма, снижения заболеваемости, улучшения показателей работоспособности. В этих условиях наряду с медико - экологической реабилитацией населения особую актуальность приобретает отработка адекватных схем медикаментозного лечения с использованием эффективных иммунокорректирующих препаратов, повышающих неспецифическую резистентность к инфекциям, интоксикациям, и новых антимикробных средств, которые могут быть получены, в том числе, с использованием методов биотехнологии на основе дереворазрушающих грибов.
В последние десятилетия дереворазрушающие высшие базидиальные грибы стали объектом пристального внимания исследователей. Способность к активному росту в условиях глубинного культивирования в отличие от грибов других экологических групп этого класса, привлекают к ним внимание как к перспективным объектам биотехнологических исследований. Особый интерес представляет изучение возможности их использования в качестве продуцентов биологически активных веществ и разработки на их основе экологически чистых безотходных технологий получения эффективных лекарственных препаратов различного назначения, технологических ингредиентов для пищевой промыш-
ленности, пищевых добавок и стимуляторов роста животных, способов утилизации отходов производства, в том числе, и особо опасных.
С другой стороны, проблема промышленных отходов, в том числе, и лигноцеллюлозных, приобрела на сегодняшний день не только глобальное значение, но и весьма актуальна для Иркутской области, поскольку вторичные растительные отходы сельского хозяйства и промышленности до сих пор не нашли крупномасштабного использования. Если решение проблемы вторичного целлюлозосодержащего сырья сельского хозяйства нашло отражение в проведении ряда региональных программ и внедрении некоторых разработок, то лигно-целлюлозные отходы не используются в должной мере. Особо острыми представляются проблемы утилизации отходов целлюлозно - бумажной промышленности и биотехнологических производств. Так, на предприятиях целлюлозно-бумажной промышленности, использующих для отбеливания целлюлозы молекулярный хлор, образуются полихлорированные дибензо - п-диоксины (ГГХДД) и дибензофураны (ПХДФ) - высокотоксичные, канцерогенные соединения, являющиеся представителями хлорированных циклических ароматических эфиров. В связи с этим весьма актуальной представляется разработка схем безотходного производства антимикробных препаратов и технологических ингредиентов при утилизации биомассы продуцентов, производства полисахаридов и иммуностимулирующих препаратов на их основе, стимуляторов роста животных, и особенно, разработка биологических методов обезвреживания высокотоксичных отходов целлюлозно - бумажной промышленности.
Цель работы. Настоящая работа направлена на изучение возможности решения медико - экологических проблем Иркутской области посредством изучения физиологических и биохимических аспектов воздействия биологически активных веществ продуцента Coriolus pubescens (Shum.:Fr.)Quel. штамм 0663, разработки безопасных биотехнологических способов получения антимикробных, иммуностимулирующих препаратов и технологических ингредиентов на их основе, разработку способов их использования на бродильных производст-
вах пищевой промышленности, в ветеринарии и медицине, способов утилизации и обезвреживания промышленных отходов.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: провести скрининг для выявления штамма высших дереворазрушающих грибов, обладающего высокой антимикробной активностью; выделить и идентифицировать антимикробные вещества, изучить механизм их действия in vitro; оптимизировать методы и режимы культивирования продуцента; разработать способы получения антимикробных препаратов и способы их использования в ветеринарии и медицине; разработать способ получения и использования антимикробного технологического ингредиента, включающего вторичные метаболиты, на бродильных производствах Иркутской области; разработать способы использования биомассы продуцента, получаемой при ферментации, как отхода производства, для выделения других биологически активных веществ, а именно: для получения полисахаридов; разработать метод обезвреживания опасных лиг-но - целлюлозных отходов производства с использованием твердофазной ферментации продуцента.
Научная новизна работы. Эколого - биотехнологическая концепция диссертационной работы основывается на замене в ряде промышленных производств высокотоксичных веществ, что приводит к оздоровлению окружающей среды, а также на получении биологически активных веществ базидомицета Coriolus pubescens (Shum.:Fr.)Quel. штамм 0663, улучшающих качество жизни человека.
В результате выполнения работы научно аргументирована и экспериментально доказана перспективность использования вторичных метаболитов продуцента С. pubescens для получения антимикробных препаратов широкого спектра действия и технологических ингредиентов, а полисахаридов клеточной стенки продуцента - для получения иммуностимулирующих препаратов по разработанной принципиальной технологической схеме, которые используются для решения существующих медико - экологических проблем Иркутской области.
Исследован спектр антимикробного действия продуцента и препаратов, получаемых на его основе. Установлено, что механизм бактерицидного действия антимикробных препаратов определяется механизмом действия вторичных метаболитов, синтезируемых продуцентом. Показано, что бактерицидное действие препаратов, получаемых на основе продуцента С. pubescens, заключается в ин-гибировании синтеза клеточной стенки бактерий - возбудителей заболеваний. Установлено, что химиотерапевтическими агентами, способными подавлять патогенные бактерии in vitro, являются синтезируемые продуцентом терпеноиды.
Проведено сравнительное изучение антибиотикорезистентности клинических штаммов, выделенных от больных детей хирургического профиля к современным препаратам, включая Леван - 1. Изучена активность препаратов Леван-1 и Леван - 2 по отношению к возбудителям желудочно - кишечных заболеваний человека и животных семейства Enterobacteriacea. Показано, что препарат Леван - 2 увеличивает интенсивность автолиза клеток штаммов бактерий гнойно -воспалительных заболеваний в более значительной степени, чем антибиотики цефалоспориновой и пенициллиновой групп.
Установлено, что гриб С. pubescens является малопатогенным для млекопитающих. Согласно гигиенической классификации производственных штаммов микроорганизмов, исследованный штамм относится к третьему классу опасности. Антибактериальный препарат Леван - 2, получаемый на основе продуцента, малотоксичен, ЛД5о составляет 50 000мг/кг и близка к пороговой в остром опыте по общетоксическому и дисбиотическому эффектам действия. Мест-но - раздражающее и аллергенное действие препарата является слабовыражен-ным.
Изучена противоспалительная активность препарата с использованием модели острого воспалительного отёка на лабораторных животных - белых беспородных мышах. Показано, что Леван - 2 обладает максимальной противовоспалительной активностью в дозе 1,5 мл/кг массы тела при внутрибрюшин-ном введении препарата.
При экспериментальном моделировании туберкулёзной инфекции установлено, что препарат Леван - 2 обладает противотуберкулёзной активностью в дозе 2,0 мл/кг массы тела внутримышечно. Монотерапия препаратом приводит к излечению животных и увеличению массы их тела. Полученные данные свидетельствуют о расширении возможности использования препарата в качестве химиотерапевтического средства.
Разработаны научные основы применения антимикробного препарата Леван - 2 для лечения и профилактики желудочно - кишечных заболеваний новорожденных телят.
Разработаны научные основы снижения бактериальной обсеменённости при производстве и повышения качества основных продуктов - хлебопекарных дрожжей и этилового спирта - при использовании антимикробного технологического ингредиента Леван -1.
Разработана схема выделения фракций полисахаридов из клеточных стенок С. pubescem и изучен их состав. Исследование влияния глюкановых фракций полисахаридов, выделяемых из биомассы С. pubescem позволило выявить эффект активации нейтрофилов in vitro, а также выявить тенденцию к увеличению подвижности Т-хелперов при изучении действия глюкановых фракций полисахаридов на электрофоретическую подвижность лимфоцитов.
Установлено, что при твердофазной ферментации отходов деревообрабатывающей промышленности происходит не только утилизация субстрата, но образование биологически активных веществ. Конечные продукты представляют собой смесь выросших грибов и неутилизированного субстрата - белково -углеводные комплексы (БУК), богатые белками, липидами и витаминами, образующимися при деградации природных полимеров, а также микро - и макроэлементами. Получаемые продукты утилизации (БУК) отвечают требованиям безопасности для пищевых продуктов по содержанию токсичных элементов, микотоксинов. При утилизации лигноцеллюлозных отходов как в лабораторных условиях, так и «под открытым небом» не происходит обсеменения БУК посто-
ронней микрофлорой вследствие высокой антимикробной активности продуцента.
Исследование процесса твердофазной ферментации высокотоксичных лигноцеллюлозных отходов целлюлозно - бумажного производства (ЦБП) позволило разработать способ их обезвреживания с использованием методов биотехнологии. Установлено, что в качестве биологического метода обезвреживания твёрдых отходов ЦБП, содержащих хлорорганические ароматические соединения, может быть рекомендован метод утилизации шлам - лигнина с использованием штамма 0663 дереворазрушающего базидиомицета С. pubescens. Метод является экологически безопасным и приводит к изменению состава промышленных отходов и 100 % - ному удалению органических веществ, приводящих к образованию диоксинов (фенолов и хлорорганических соединений).
Диссертация являлась источником тем научно-исследовательских работ, выполнявшихся в Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) ИГМУ в 1994 - 2001 гг. «Гигиеническая оценка белково - углеводных комплексов как производных вторичного растительного сырья», «Медико-биологические исследования биологически активных соединений и способы их получения с использованием методов биотехнологии» и хоздоговорной темы № 1-97 «Повышение стойкости и выхода продукции в условиях весенне-летнего периода производства хлебопекарных дрожжей», а также темы научно - исследовательской работы «Разработка научных основ практического применения в ветеринарии антибактериального и иммуностимулирующего препаратов, полученных с использованием методов биотехнологии на основе гриба Coriolus pubescens (Fr.:Shum.) Quel.», выполнявшей в Иркутском филиале Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ИФ ИЭВСиДВ) СО РАСХН в 2002 - 2005 гг. под личным руководством автора.
Практическая значимость. Практическое значение работы состоит в развитии нового комплексного направления при использовании жидкофазной и твердофазной ферментации дереворазрушающего гриба С. pubescens, результа-
ты которого могут быть использованы для практического применения в промышленности, сельском хозяйстве и медицине для решения существующих медико - экологических проблем.
В результате научных исследований разработана принципиальная схема получения антимикробных и иммуностимулирующих лекарственных средств ветеринарного и медицинского назначения, технологических ингредиентов для бродильных производств пищевой промышленности. Разработка способов получения антимикробных веществ и их внедрение позволяет расширить спектр эффективных антимикробных лекарственных средств. Оценка чувствительности in vitro антибактериальных препаратов Леван - 1 и Леван -2 показала их большую эффективность по сравнению с применяемыми антимикробными препаратами. Препарат Леван - 2 прошёл широкие производственные испытания в ОАО «Хомутовское» Иркутской области Иркутского района. Показана его высокая лечебная и профилактическая эффективность для лечения желудочно - кишечных заболеваний с синдромом диареи новорождённых телят.
Использование технологического ингредиента Леван - 1, получаемого на основе природного антимикробного вещества, на бродильных производствах позволяет не только снизить обсеменение посторонней микрофлорой на всех стадиях технологического процесса, но и сократить время брожения, повысить выход и качество продукции, исключить из технологических процессов вредные и агрессивные вещества.
Разработка технологического ингредиента Леван-1, обладающего антимикробным действием по отношению к гнилостным бактериям, позволило внедрить его на ОАО «Дрожжевой завод» (г. Иркутск). Применение ингредиента при производстве дрожжей пекарских позволяет увеличить стойкость продукции без изменения других показателей качества продукции.
Технологический ингредиент Леван-1 прошёл лабораторные, полупро-мышленнные и промышленные испытания на Тельминском спиртзаводе ОАО «Кедр». При производстве спирта замена таких вредных и агрессивных веществ, как формалин и серная кислота, технологическим ингредиентом Леван-1 приво-
дит к снижению количества несброженных углеводов, повышению выхода основного продукта - этилового спирта, сокращению содержания метанола в конечном продукте.
Лабораторные испытания технологического ингредиента проводились также в лаборатории дрожжей Ленинградского филиала ВНИИ хлебопекарной промышленности.
Акты лабораторных, полупромышленных, промышленных испытаний и акты внедрения приложены к диссертации.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на следующих конференциях: Международная конференция «Экологически чистые технологические процессы в решении проблем охраны окружающей среды» (Иркутск, 1996); IV - ый Российско - Японский международный симпозиум (Иркутск, 1996); Юбилейная научно-практическая конференция «Итоги, проблемы и перспективы», посвященная 75-летию Государственной санитарно- v эпидемиологической службы России (Иркутск, 1997); Международная конференция «Экология и развитие России: медико-экологические аспекты на примере Байкальского региона» (Иркутск, 1998); Международное совещание, посвященное памяти М. Г. Минаевой, «Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений» (Новосибирск, 1998); 1-ый съезд токсикологов России (Москва, 1998); 2-ая межрегиональная научная конференция «Человек и окружающая среда» (Рязань, 1998); VI - й Российско - Японский международный симпозиум (Хабаровск, 1998); 3-я ежегодная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы медицинского обеспечения при чрезвычайных ситуациях и катастрофах» (Иркутск, 1999); 5-ая международная научно-практическая конференция «Природные и интеллектуальные ресурсы Сибири» (Томск, 1999); Западно-Сибирский форум «Актуальные вопросы диагностики, лечения, профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (Тюмень, 2000); Международный экологический конгресс «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 2000); Международная конференция «Химическое образование и развитие общества» (Москва, 2000);
Годичная сессия ИГМУ по итогам НИР - 2000 (Теоретическая секция) (Иркутск, 2000); Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы ветеринарной медицины Восточной Сибири (Иркутск, 2002); Межрегиональная научно -практическая конференция «Биология микроорганизмов и их научно — практическое использование» (Иркутск, 2004); Научно - практическая конференция, посвященная 65 - летию СО РАСХН (Новосибирск, 2005); Заседание регионального отделения МОО «Микробиологическое общество» (2006).
Основные публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 работ, в том числе, 10 статей в научных журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, монография «Биологически активные вещества Coriolus pubescens (Shum.:Fr.) Quel, и их использование в медицине, ветеринарии, экологии и пищевой промышленности» и «Методические рекомендации по применению современных лекарственных средств для профилактики и лечения желудочно - кишечных заболеваний новорождённых телят».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Результаты изучения антимикробной активности продуцента С. pubes
cens, её природы и механизма действия, получения новых антимикробных пре
паратов как средства снижения заболеваемости.
Результаты сравнительного изучения антимикробной активности препарата Леван -1, получаемого на основе гриба С. pubescens, в отношении клинических полирезистентных штаммов бактерий, выделенных в лечебно — профилактических учреждениях г. Иркутска.
Результаты изучения твердофазной ферментации продуцента как способа утилизации и обезвреживания лигно - целлюлозных отходов производства.
Результаты разработки принципиальной технологической схемы безотходного производства продуктов биотехнологии на основе жидкофазной ферментации гриба С. pubescens.
Результаты разработки схемы выделения полисахаридов клеточной стенки гриба продуцента, изучения их химического состава и тенденций влия-
ния на функциональную активность иммунокомпетентных клеток как средства для повышения неспецифической резистентности организма к инфекциям, интоксикациям в условиях экологического неблагополучия.
Результаты исследования возможности использования антимикробного технологического ингредиента Леван - 1 на бродильных производствах пищевой промышленности как экологически безопасного способа производства хлебопекарных дрожжей и спирта.
Результаты медико - биологических исследований продуцента С. ри-bescens и антимикробного препарата Леван - 2, получаемого на его основе.
Результаты исследования возможности использования антимикробного препарата Леван - 2 для лечения и профилактики желудочно - кишечных заболеваний новорождённых телят как средства, повышающего устойчивость организма к действию неблагоприятных факторов внешней среды.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 9 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 584 источников, в том числе, 380 отечественных и 204 зарубежных. Работа изложена на 352 страницах, включая список литературы на 56 страницах, иллюстрирована 81 таблицей и 51 рисунком, содержит 18 приложений.
