Содержание к диссертации
Введение
П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Экологические и физиолого-биохимические особенности грибов-деструкторов материалов 10
2.2. Механизмы биодеградации природных и синтетических полимерных материалов микроорганизмами 13
2.3. Действие микроскопических грибов на физико-механические свойства полимеров 18
2.4. Природные полимеры на основе глюкозамина, их свойства и применение
2.4.1. Хитин и хитозан - представители природных полиме
ров 22
2.4.2. Структура и свойства хитина ихитозана 25
2.4.3. Области практического применения хитозана 29
2.4.4. Основные ферменты, участвующие в биодеструкции хитина и хитозана 31
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1.1. Объекты исследований 37
3.1.2.Основные методы исследований 39
3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.2. 1. Получение полимерных композиций на основе хитозана. По
лучение сыпучих солей хитозана 46
3.2.2. Исследование деструкции природных и синтетических полимеров стандартными культурами микромицетов 47
3.2.3. Исследование устойчивости хитозана к штаммам грибов, выделенным из воздуха 49
3.2.4. Изменение физико-механических свойств полимеров, подвергшихся деструкции микроорганизмами 51
3.2.5. Исследование возможности деструкции хитозана "дикими"штаммами микромицетов
3.2.5.1. Изменение вязкости растворов хитозана, подвергшихся деструкции 54
3.2.5.2. Изменение количества редуцирующих Сахаров в среде культивирования микромицетов 57
3.2.5.3. Исследование взаимосвязи между содержанием редуцирующих Сахаров и вязкостью растворов хитозана 59
3.2.6. Изучение влияния экологических и физиолого-биохимических факторов на процесс деструкции хитозана микроскопическими грибами
3.2.6.1. Зависимость скорости деструкции хитозана от его исходной молекулярной массы 60
3.2.6.2. Зависимость скорости деструкции хитозана от рН, природы и концентрации кислоты-растворителя 62
3.2.6.3. Влияние кислорода на деструктивные процессы хитозана 64
3.2.6.4. Влияние температуры на деструкцию хитозана 66
3.2.6.5. Зависимость деструкции от концентрации посевного мате
риала, вносимого в среду культивирования 68
3.2.6.6. Влияние некоторых примесей на деструкцию хитозана 69
3.2.6.7. Оценка хитозаназной активности 70
3.2.6.8. Выявление ингибиторов хитозаназной активности 72
3.2.6.9. Определение молекулярной массы хитозаназ мицелиальных грибов в полиакриламидном геле 75
3.2.6.10. Фосфатазная активность грибов-деструкторов хитозана 77
3.2.6.11. Исследование интенсивности дыхания грибов-деструкторов хитозана 81
3.2.7. Исследование возможности получения низкомолекулярных олигомеров хитозана с помощью "диких" штаммами микромицетов . 83
3.2.7.1. Основы выделения низкомолекулярных олигомеров хитозана 84
3.2.7.2. Определение влажности олигомеров хитозана 85
3.2.7.3. Определение плотности порошков хитозана 86
3.2.7.4. Определение вязкости 2,5% растворов олигомеров хитозана . 87
3.2.7.5. Определение рН 2,5% растворов олигомеров хитозана 88
3.2.7.6. Определение количества нерастворимых примесей олигомеров хитозана 88
3.2.7.7. Зольность олигомеров хитозана 89
3.2.7.8. Спектральный анализ олигомеров хитозана 90
3.2.7.9. Анализ молекулярной массы и полидисперсности олигомеров хитозана 93
3.2.7. Ю.Исследование поверхностно-активных свойств олигохитоза-на 95
3.2.7.11. Биоцидная активность олигомеров хитозана 102
3.2.8. Основные этапы получения олигомеров хитозана с помощью микромицетов 108
IV. ВЫВОДЫ
V. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
- Экологические и физиолого-биохимические особенности грибов-деструкторов материалов
- Исследование деструкции природных и синтетических полимеров стандартными культурами микромицетов
- Определение молекулярной массы хитозаназ мицелиальных грибов в полиакриламидном геле
Введение к работе
Биоповреждения - реакция окружающей среды на то новое, что вносит в нее человек. Во всех ситуациях, связанных с биоповреждениями, взаимодействуют, с одной стороны, организмы и окружающая среда, с другой - творение человеческих рук. Поэтому проблема биоповреждений основывается на комплексных эколого-технологических подходах, изучающих взаимодействия этих компонентов, прежде всего с точки зрения хозяйственной деятельности и существования человека.
Экологический аспект данной проблемы касается взаимоотношений человека с окружающей средой. Человек насыщает биосферу новыми для нее материалами и изделиями, одни из которых биосфера отторгает и разрушает, другие вовлекаются в искусственные и естественные биоценозы и становятся ее компонентами. Учитывая это человек меняет технологические характеристики создаваемых материалов и изделий из них. Ему выгодно, чтобы материалы и изделия служили определенный срок, и только затем разрушались под влиянием деятельности живых организмов (Ильичев, 1987).
В последнее время в различных отраслях промышленности (медицине, сельском хозяйстве, бытовой химии) широкое применение находят полимерные композиции, содержащие в своем составе природные полимеры, в частности хитин и хитозан (Чернецкий, Нифантьев, 1997). Хитозан является природным полисахаридом, полимерная цепь которого построена из Р (1—>4) связанных остатков глюкозамина. Вместе с тем, основная масса его производится путем деацетилирования хитина - второго биополимера после целлюлозы по распространенности в природе.
На протяжении многих десятилетий хитиновые панцири, как отход переработки ракообразных, засоряет побережье мирового океана, что создает серьезную экологическую проблему. При этом мировой потенциал источников достаточен для производства 150 тыс. т хитозана в год.
6 Хитозан обладает уникальными пленко-, волокно- и комплексообра-зующими свойствами, растворимостью в водных растворах ряда органических и неорганических кислот, биосовместимостью и отсутствием токсичности, что обусловливает значительно возросший в последнее время научный и практический интерес как к хитозану так и к композициям на его основе. В значительной мере этому способствовала организация в 80-х годах прошлого столетия в ряде ведущих стран мира (Японии, США, Норвегии, Италии) промышленного производства хитина и хитозана. Существенно, что при этом решается сразу две задачи: человечество получает ценнейшее сырье и снимается острая экологическая проблема.
В процессе эксплуатации материалы на основе хитозана могут подвергаться негативным воздействиям различных микроорганизмов, в том числе микроскопических грибов. Быстрый рост мицелия, мощность и лабильность ферментативных систем позволяет этим живым организмам использовать в качестве источников питания различные полимеры, как природного, так и искусственного происхождения (Лугаускас и др., 1987; Ермилова, 1991). В результате таких воздействий происходит изменение основных физико-химических характеристик материала и их деградация. С другой стороны, в ряде случаев необходимо добиться ускорения процессов биоутилизации (Lorcks, Pommeranz, 1996). Кроме того, в настоящее время существует задача получения хитозанов с заданным значением молекулярной массы, включая низкомолекулярные олигосахариды, являющиеся биологически активными веществами (Комаров и др., 2001). Олигомеры хитозана находят широкое применение в медицине в качестве носителя биологически активных соединений при получении противовирусных и противоопухолевых препаратов, а также в качестве иммуномодуляторов (Васюкова и др., 2000; Васюкова и др., 2001).
По данным литературы (Latzko, Hempel, 1995; Варламов и др., 1997; Ба-бенко и др., 1998) некоторые бактерии и грибы, являющиеся активными продуцентами хитиназ, способны осуществлять деструкцию высокомолекуляр-
ного хитозана до низкомолекулярных водорастворимых форм. Следует отметить, что олигомеры хитозана, полученные с помощью различных микроорганизмов (бактерий, актиномицетов, грибов), отличаются по своей биологической активности.
В настоящее время актуальным является поиск и разработка высокотехнологичных промышленных методов получения олигохитозанов. Известно, что факторы внешней среды (источники питания, кислород, кислотность, влажность, температура и др.) могут стимулировать или ингибировать интенсивность данного процесса. Изучение данного вопроса позволит не только расширить знания о механизмах процесса биодеструкции полимерных материалов, но и предложить промышленный метод получения олигохитозана.
Цели и задачи исследований. В настоящей работе исследовались экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса деструкции хитозана микроскопическими грибами, с целью разработки экобиотехнологических основ биоутилизации природного полимера и получения его олигомерных форм.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
выявить наиболее активных микромицетов-деструкторов хитозана и полимерных материалов на его основе;
исследовать влияние роста микромицетов - активных деструкторов хитозана на физико-механические свойства некоторых полимерных материалов;
определить оптимальные значения ряда экологических факторов для роста и осуществления процесса деструкции хитозана микромицетами;
исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - активных деструкторов хитозана;
определить физико-химические и биологические свойства олигомеров хитозана, полученных с помощью микромицетов;
разработать основы экобиотехнологического метода биоутилизации и получения олигомерных фракций хитозана.
Научная новизна работы. Впервые исследована возможность деструкции грибами гомо- и гетерополимерных пленок на основе хитозана.
Установлены активные микромицеты-деструкторы среди стандартных культур из списков ГОСТ 9.049-91 {Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Peni-cillium ochro-chloron, Penicilliumfuniculosum и Trichoderma viride).
Выделены «дикие» штаммы микроскопических грибов, идентифицированные как Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12, значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять деструкцию хитозана и материалов на его основе.
В лабораторных условиях исследовано влияние роста грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12 на физико-механические показатели полимерных материалов. Установлено, что рост грибов на полимерных пленках (поливинилхлориде, полиэтилене) приводит к ухудшению таких показателей как прочность материалов при разрыве (стр) и относительное удлинение (єр). В присутствии хитозана в питательной среде ухудшение данных показателей усиливается.
Определены оптимальные экологические условия, обеспечивающие наиболее эффективный процесс деструкции хитозана микромицетами. В частности, показано, что скорость деструкции зависит от температуры, природы и кислотности среды, аэрации, количества примесей, молекулярной массы субстрата.
Исследованы физиолого-биохимические особенности микромицетов — активных деструкторов хитозана. Выявлена высокая хитозаназная активность мицелиальных грибов - активных деструкторов хитозана, установлена их молекулярная масса и ингибиторы; определена интенсивность дыхания и фосфатазная активность данных микромицетов.
Полученные экспериментальные данные позволят в определенной мере понять механизмы биоутилизации хитозана микромицетами в природных условиях.
Впервые показана возможность получения олигомеров хитозана с помощью микроскопических грибов Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12. Исследованы основные физико-химические и биологические свойства олигомеров хитозана (плотность, вязкость, зольность, ИК-спектры, полидисперсность, поверхностно-активные свойства, биоцидная активность).
Подана заявка на патент «Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана» №2001109818/04(010276). Приоритет от 11.04.2001.
Практическая значимость работы.
С помощью микромицетов Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12 получены олигомеры хитозана и исследованы их физико-химические и биологические свойства. Олигомеры хитозана, являясь биологически активными веществами, могут найти широкое применение в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве.
Предложена схема экобиотехнологического метода деструкции хитозана с помощью микроскопических грибов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Регулирование биостойкости материалов возможно как на экологиче
ском уровне за счет изменения факторов внешней среды, влияющих на дест
руктивные процессы хитозана микромицетами, так и на физиолого-
биохимическом уровне за счет активации или ингибирования ферментных
систем микроскопических грибов, способных деструктировать хитозан и
синтетические полимеры на его основе.
Изменение вязкости раствора, содержание редуцирующих Сахаров, физико-механические свойства полимерных материалов могут являться основой контроля процесса биодеструкции хитозана и материалов на его основе, а также получения его олигомерных форм.
Молекулярная масса олигомеров, соотношение различных фракций олигомеров, их количество и свойства зависят от используемого штамма гриба-деструктора и от условий его культивирования.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Экологические и физиолого-биохимические особенности грибов-деструкторов материалов
В последние десятилетия все большую актуальность приобретает проблема повреждения микроорганизмами промышленных материалов, изделий, конструкций и сырья. Материалы и изделия, подвергающиеся биокоррозии, представляют для плесневых грибов своеобразную экологическую нишу. Состав ценоза микромицетов определяется не только природой субстрата, но и набором таких факторов, как условия хранения и производства изделий, продукции, оборудования, наличие и характер атмосферных и промышленных загрязнений, микофлора воздуха и почвы данного района. Возникновение экологических групп у грибов является следствием всего эволюционного развития этих организмов в результате многочисленных адаптации к условиям существования во многих поколениях.
Живые организмы являются функцией биосферы и связаны с ней материально и энергетически. В экологическом аспекте биоповреждения представляют собой естественный процесс, протекающий в общем круговороте веществ, который на время приостанавливает человек с помощью разных средств. В результате биоповреждений снижается ценность материалов или нарушается процесс эксплуатации, принося экономический ущерб.
В настоящее время известно, что микроскопические грибы являются наиболее активными компонентами каждого ценоза. Широкое распространение грибов в биосфере земли происходит благодаря их биологическим особенностям:
1) наличию мицелиальной структуры таллома, обеспечивающей высокую степень контакта со средой;
2) значительной скорости роста и размножения; 3) высокой активности метаболизма, проявляющейся в широком интервале действия различных экологических факторов;
4) большой генетической и биохимической изменчивости, позволяющей грибам быстро адаптироваться к изменяющимся условиям среды обитания;
5) способности быстро реагировать на действие неблагоприятных факторов среды переходом к анабиозу и также быстро переходить к активной жизнедеятельности в благоприятных условиях.
Грибы встречаются при высоких (Билай, 1979) и низких температурах (Коваль, Михтенштейн, 1981), во льдах Арктики и высоких слоях атмосферы (Kusher, 1980; Абызов, Белякова, 1982). Например, конидии Aspergillus fumigatus не погибают при колебаниях температуры от -32С до +80С, а грибы Aspergillus penicilloides и Aspergillus glaucus var. tonophilus способны расти на твердых субстратах за счет атмосферного увлажнения.
В результате изучения толерантных и осмофильных свойств мезофиль-ных, факультативно-термофильных и термофильных микромицетов из различных таксономических групп (Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Humicola, Thermomyces) обнаружены штаммы, обладающие высокой инвертазной активностью, способные расти и развиваться на средах, содержащих 20, 30, 40 и более % сахарозы (Кириллова, 1997).
Авторами Savitha J., Subramanian C.V. (1995) изучена способность роста Aspergillus flavipes на среде с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода.
Грибы, относящиеся к p.p. Absidia, Cunninghamella, Mucor, Rhizopus, Zygorhynchys, Acremonium, Aspergillus, Paecilimyces, Penicillium, Scopylariopsis, Trichoderma, Verticillium, Cladosporium, Curvulapia, Stachybotrys, Chaetomium были выделены из почвы, загрязненной А13+ в концентрациях 76,5-740 мкг/кг, а также Pb, Си, Cd, As (Simonovicova et al., 1995).
Park-Jong-Chul et al. (1996) проведена количественная оценка адаптации Aspergillus niger к кислым условиям. Рост гиф ингибировался в кислой среде (рН 2,4). Гифы возобновляли рост через 30 минут при постоянной экспозиции при рН 2,4 и 2,2, но рост не возобновлялся при рН 2,0. Рост гиф сохранялся даже при более низких рН, если понижение рН среды происходило постепенно до рН 1,4. Эта адаптация гиф происходила в течение 20 минут экспонирования в кислой среде, но утрачивалась в течение последующего 30-60 минутного отмывания в среде с рН 5,1.
Обнаружено, что штамм Streptomyces rochei 303 способен активно расти на почве, зараженной пентахлорфенолом (Заботина и др., 1997).
Р.И. Мироновой с сотрудниками (1997) были исследованы 7 штаммов природных микромицетов, относящихся к родам Aspergillus и Penicillium, на способность осуществлять очистку воды от плавающей нефти. Изученные штаммы сочетают в себе свойства биодеструкторов и биосорбентов нефти и нефтепродуктов. Штаммы Aspergillus sp. 1Н и Penicillium sp. Б 2/2 способны удалять нефтяные пятна с поверхности морской и пресной воды в стационарных условиях в колбах при концентрации нефти 1% с эффективностью от 60 до 98% в течение 14-21 суток.
Важной особенностью плесневых грибов является гетерогенность вида, т.е. наличие внутри вида штаммов, различающихся по морфологическим, физиологическим, экологическим и другим признакам. Исследователями Т.П. Сизовой и Е.Н. Бабьевой (1981) показано, что у штаммов P. nigricans из южных районов земного шара оптимальная температура роста была 25С, а у северных штаммов того же вида - 18С. Бразильский штамм лучше всего рос при 37С.
Грибы - очень вариабельная и подвижная в экологическом отношении группа организмов. Один из механизмов изменчивости грибов - гетерокари-оз. В зависимости от условий среды число ядер того или иного типа может варьировать в гетерокариотическом мицелии, обеспечивая этим приспособленность гриба к возникающим условиям. Это свойство грибов имеет особое значение в связи с непрерывным созданием новых материалов и возникновением новых искусственно создаваемых биотопов (Ильичев, 1987). У некоторых представителей родов Aspergillus, Penicillium, Chaetomium при развитии на полимерных материалах отмечено укрупнение отдельных элементов конидиального аппарата (конидиеносцы, метулы, конидии, сумки). Эти особенности микромицетов можно рассматривать как ответную реакцию на неспецифический субстрат и учитывать при идентификации грибов, развивающихся на материалах синтетического происхождения (Каневская, 1984).
Об изменении формы плодовых органов, о появлении на поверхности мицелия грибов, поражающих синтетические полимеры, своеобразных новообразований, говорится и в работе Лугаускаса (Лугаускас и др., 1983), который считает, что последние сохраняют потенциальную возможность гриба существовать и размножаться в новых необычных условиях.
Исследование деструкции природных и синтетических полимеров стандартными культурами микромицетов
Хитозан может использоваться при создании различных сополимерных композиций, для придания им специфических свойств. Регулирование биостойкости данных композиций возможно за счет активации или ингибирова-ния ферментных систем микроорганизмов, способных деструктировать хитозан и синтетические полимеры, входящие в состав многокомпонентных материалов. В связи с этим, одной из важнейших задач является подбор эффективных штаммов микроорганизмов-деструкторов. На первом этапе работы мы пытались выбрать активный гриб-деструктор хитозана, а также полимерных материалов на его основе, среди штаммов микромицетов, используемых в ГОСТе 9.049-91. В качестве тест-организмов использовались штаммы 14 видов микроскопических грибов, известные как активные деструкторы различных материалов. Оценка грибостойкости велась по шестибальной шкале (0-5 баллов). Материал считается грибостойким, если он получает оценку по данному методу 0-2 балла. Результаты представлены в таблице 3.1.
Анализ данных показал, что наиболее устойчивыми к действию микроскопических грибов являются порошок хитозана и ПВПД - грибостойкость данных материалов никогда не превышала 3 баллов (невооруженными глазом рост грибов едва заметен, но отчетливо виден под микроскопом). Гомо-полимерные пленки хитозана полученные поливом в СН3СООН и НС1 достаточно хорошо разрушались плесневыми грибами. Грибостойкость данных пленок составила 4 балла (рост грибов отчетливо виден невооруженным глазом и покрывает менее 25% поверхности образца). Гетерополимерные композиции на основе механических смесей ХТЗ+ПВПД и ХТЗ+ПВС являлись также негрибостойкими, особенно это относится к композиции ХТЗ+ПВС, где грибостойкость для некоторых культур равнялась 4 баллам. Оценка грибостойкости ПВС в данном эксперименте нами не проводилась, так как ранее проведенные нами эксперименты показывают, что данное соединение является негрибостойким по отношению к большинству ГОСТовских грибов имеет оценку грибостойкости 4 балла.
Активными деструкторами гомополимерных пленок (рост грибов хорошо виден невооруженным глазом, отмечается спороношение) являются грибы Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Penicillium ochro-chloron, Penicillium funiculosum. Наиболее активными деструкторами гетерополимерных пленок являются: Aspergillus niger и Trichoderma viride. Необходимо отметить, что указанные выше штаммы микромицетов способны интенсивно утилизировать большинство природных материалов.
Следует отметить, что для решения вопросов, связанных с проблемой биоутилизации грибами хитозана степень использования материалов в качестве питательного субстрата оцененная в 4 балла является недостаточной. В связи с этим нами был осуществлен поиск природных штаммов микромицетов - активных деструкторов хитозана.
Из воздуха нами были выделены «дикие» штаммы микромицетов, относящиеся к классу Hyphomycetes, порядку Moniliales, семейству Moniliaceae, идентифицированные как Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12, вызывающие деструкцию хитозана.
Для штамма Paecilomyces sp. НУ-10 характерным является довольно медленный рост на агаризованном сусле, на 10-й день диаметр колоний достигает 10-18 мм. Вначале колонии белые, однако, быстро приобретают серо-розовую окраску, иногда с зеленым оттенком с обратной стороны. Состоят из базального войлока и хлопьевидного опушенного верхнего слоя, обычно интенсивно спорулируют, создается вид, что колония мучнистая. Конидиенос-цы прямые, поднимающиеся от краев гиф 1 00-І-150 х 1,5-ь2,5 мкм. Конидии в цепочках, одноклеточные, эллиптические, не окрашенные в зеленые оттенки.
Для второго штамма Penicillium sp. НУ-12 характерен довольно быстрый рост колоний на среде Чапека, на 10-й день роста достигая 4-4,5 см в диаметре. Колонии радиально-бороздчатые, часто с зернистой поверхностью, обильно спороносящие, молодые - сизо-голубоватые до голубовато-серо-зеленых, при старении обычно тускло-серые. Обратная сторона вначале светлоокрашенная, при старении отчасти становится пурпурных оттенков. Кони-диеносцы отходят от субстрата 20ОМ00 х 3-кЗ,5 мкм.
Данные «дикие» штаммы, наряду с ГОСТовскими штаммами Aspergillus niger и Trichoderma viride (активными деструкторами гетерополимерных пленок на основе хитозана), использовались для определения грибостойкости порошка хитозана и ХТЗ-ПВПД-пленок, полученных методом привитой со-полимеризации. Результаты представлены в таблице 3.2.
Определение молекулярной массы хитозаназ мицелиальных грибов в полиакриламидном геле
Микроорганизмы, способные использовать полисахариды высокой молекулярной массы в качестве ростовых субстратов, синтезируют ферменты с различным механизмом действия по отношению к этим полимерам. Эти микроорганизмы синтезируют, как правило, несколько таких ферментов, образующих комплекс, специфичный к конкретному полисахариду, в том числе и к хитозану. В этом смысле не является исключением и изучаемая нами культура гриба Paecilomyces sp. НУ-10, обратившая на себя внимание высоким выходом хитозаназной активности. В связи с этим, в данном разделе мы пытались охарактеризовать хитозаназный комплекс, присутствующий в культу-ральной жидкости (КЖ) гриба Paecilomyces sp. НУ-10, а в частности, опре делить его молекулярную массу. Для этого применяли метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (Маурер, 1971).
Для проведения диск-электрофореза использовался прибор Венгерской фирмы «Reanal».
В качестве маркеров использовались белки известной молекулярной массы: альбумин Мг=67000; карбоксиангидраза Мг=29000; цитохром С Мг= 12400; Protein Мг=6500; общая концентрация 10 мг/мл.
Схема проведения опыта была следующей. Культуру гриба Paecilomyces sp. НУ-10 выращивали на полной питательной среде Чапека-Докса (содержащей глюкозу) с добавлением хитозана. Культуру гриба выращивали 10 суток. Мицелий отделяли фильтрованием и центрифугированием. Белки, содержащиеся в супернатанте концентрировали в 10 раз при помощи сефадекса G-10. После чего проводили анализ белкового состава супернатанта КЖ методом электрофореза в 15% ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na. Результаты представлены на рис. 3.8, табл. 3.11. Protein 0,93 3,812 6500
Известно, что если в питательной среде содержится более одного источника углерода, то в первую очередь микроорганизмы используют наиболее доступный субстрат. В нашем случае таким субстратом для Paecilomyces sp. НУ-10 будет глюкоза. Исходя из этого можно предположить, что в первую очередь будут синтезироваться ферменты расщепляющие глюкозу, а уже потом хитозан.
Схема электрофореграмм КЖ Paecilomyces sp. НУ-10 на среде, содержащей: а) глюкоза+хитозан, б) хитозан, в) глюкоза; г) стандартные белки.
Данные электрофореза в ПААГ (рис. 3.8, а) показали, что в случае культивирования Paecilomyces sp. НУ-10 на среде, содержащей глюкозу и хитозан, в фильтрате преобладают две белковые зоны с молекулярной массой 25-24и10-12кДа.
В случае культивирования штамма гриба Paecilomyces sp. НУ-10 на среде, содержащей только один из этих источников углерода (хитозан или глюкозу), на электрофореграммах обнаруживались только по одной белковой зоне (рис. 3.8, б, в). Причем белковый комплекс с молекулярной массой 10-12 кДа обладает хитозаназной активностью, что подтверждается его способностью расщеплять хитозан с образованием редуцирующих Сахаров.
Полученные нами результаты, позволяют сделать вывод о том, что в культуральной жидкости гриба Paecilomyces sp. НУ-10 присутствует как минимум один комплекс ферментов, гидролизующих хитозан. Данная белковая фракция является индуцибельным ферментом, так как обнаруживается в супернатанте КЖ, только при росте культуры на среде с хитозаном и имеет молекулярную массу 10-12 кДа.
При изучении физиолого-биохимических особенностей грибов-деструкторов различных природных и синтетических материалов, в том числе и хитозана, очень важной характеристикой является интенсивность энергетических процессов.
Кроме того, известно, что главная роль в процессах биодеструкции отводится не эндо-, а экзоферментам грибов (Анисимов и др., 1980).
Известно, что экзофосфатазам микроскопических грибов принадлежит важная роль в энергетическом обмене, что связано с множественностью функций данных энзимов.
Первая функция - дефосфорилирование моноэфиров ортофосфорной кислоты. Ей приписывается роль контроля уровня неорганического фосфата и поддержание равновесия системы АТФ-АДФ. Вторая - протеинфосфатаз-ная функция - расщепление фосфобелков, возникающих в процессе метаболизма. Третья функция - транспортная - обеспечение клетки фосфатом (Пол-торак и др., 1991).
Предполагают, что значительная роль в развитии адаптивных процессов у микроскопических грибов при различного рода стрессовых воздействиях принадлежит фосфатазам - ферментам с высокой полифункциональностью, участвующим в деградации экзогенных фосфатов и в обеспечении грибной клетки фосфатом и энергией (Selvan, 1980).
В связи с этим, представляло интерес изучение свойств экзофосфатаз штаммов грибов - активных деструкторов хитозана.
В качестве исследуемых штаммов были взяты «дикие» штаммы микро-мицетов Paecilomyces sp. НУ-10 и Penicillium sp. НУ-12, и ГОСТовские штаммы Aspergillus niger и Trichoderma viride (активные деструкторы гетеро-полимерных пленок на основе хитозана).
Для изучения фосфатазной активности грибов, исследуемые штаммы выращивали в течение 10 суток как на питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода глюкозу, так и на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода — хитозан. После чего мицелий гриба отделяли фильтрованием и определяли активность экзофосфатаз в среде культивирования.
