Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Вирусный гепатит В занимает одно из первых мест в инфекционной патологии человека, поэтому возбудитель данного заболевания - ДНК-содержащий гепатотропный вирус гепатита В является предметом пристального внимания и всестороннего изучения. В настоящее время показано, что в репликации этого вируса присутствует стадия обратной транскрипции РНК-прегенома. Обратная транскриптаза, осуществляющая этот процесс, лишена 3'-+5' корректирующей функции, что определяет вариабельность вирусного генома. В сочетании с высокой, репликативной - активностью вируса гепатита В это приводит к повышению вероятности ошибки считывания РНК-матрицы и появлению мутантных штаммов. В свою очередь, мутации вирусного генома могут изменять профиль серологических маркеров, приводить к снижению эффективности стандартных схем противовирусной терапии и т.д. Отсюда возникла необходимость в комплексной диагностике вирусного гепатита В, включающей количественную оценку вируса в крови больного и анализ мутаций вирусного генома. С этой целью сегодня применяются различные методы генодиагностики, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Наиболее распространенным методом количественной оценки вируса гепатита В является конкурентная ПЦР, основанная на коамплификации ДНК патогена и количественно охарактеризованного внутреннего стандарта. Создание подобного внутреннего стандарта составляет определенную сложность, что ограничивает - применение количественных тест-систем, основанных на методе конкурентной ПЦР, в клинической диагностике.
В ПЦР-диагностике мутаций генома вируса гепатита В приоритетным направлением является детекция клинически значимых YMDD- и ргесоге-мутаций, ассоциирующихся со снижением/отсутствием эффективности противовирусной терапии нуклеозидными аналогами или препаратами интерферона. Кроме того, ргесоге-мутация определяет отсутствие основного маркера активной репликации вируса - НВе-антигена. YMDD- и ргесоге- мутации вызваны однонуклеотидными заменами в ДНК вируса гепатита.В. Поэтому для их выявления применяются методы, предназначенные для детекции SNPs (single nucleotide polymorphisms). В большинстве случаев с этой целью используют методы секвенирования. и определения длин рестрикционных фрагментов. Но данные методики обладают рядом недостатков: они технически сложны в исполнении и с их помощью довольно трудно оценить долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Тем не
ЩЬШ/
оэ на'
менее, такая информация необходима для выработки эффективной тактики лечения больных вирусным гепатитом В.
Цель работы. Создать оптимальные диагностические тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В.
Задачи исследования.
Разработать методически простую технологию конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР на примере вируса гепатита В.
Разработать диагностическую тест-систему для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР, в которой будет использоваться полученный внутренний стандарт.
Найти оптимальный метод для выявления дикого и YMDD/precore-мутантных штаммов вируса гепатита В, позволяющий оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.
Апробировать разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В на сыворотках больных вирусным гепатитом В.
Научная новизна. Впервые предлагается универсальный и методически простой способ конструирования внутреннего стандарта для одностадийной конкурентной ПЦР. Доказывается, что метод аллель-специфической ПЦР для выявления мутаций в вирусном геноме применим в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл. Причем проведение аллель-специфической ПЦР в указанных концентрационных пределах позволяет оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.
Практическое значение работы. Предложенная технология конструирования, внутреннего стандарта упрощает разработку тест-систем для определения количества ДНК вируса гепатита В, основанных на методе конкурентной ПЦР. Применение конкурентной и аллель-специфической ПЦР для оценки количества и детекции мутаций в геноме вируса позволяет контролировать эффективность терапии больных вирусным гепатитом В и корректировать протокол лечения в случае выявления мутантных штаммов.
Основные положения, выносимые на защиту.
Разработана методически простая технология конструирования внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР, которая применена при создании тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В.
Показано, что аллель-специфическая ПЦР для выявления мутаций в геноме вируса гепатита В применима в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство» (2001 г, Москва), I Всероссийском съезде гематологов (2002 г, Москва), научно-практическом симпозиуме Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", проводимом в рамках международной научно-практической конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (2002 г, Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе получен патент на изобретение № 2194761, Государственный реестр изобретений РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 86 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 21 рисунок и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 117 наименований. Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (зав. - к.б.н. Судариков А.Б.) За помощь и поддержку в проведении работы выражаем искреннюю благодарность в.н.с. лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН к.б.н. Февралевой И.С, зав отд. патологии печени клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева д.м.н. проф. Крель П.Е., ст.н.с. ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ к.б.н. ГущинуА.В.
