Введение к работе
Актуальность проблемы. Микотоксины - низкомолекулярные вторичные метаболиты плесневых грибов, которые обладают высокой токсичностью и при попадании в продукты питания и корма могут причинять значительный вред здоровью человека и сельскохозяйственных животных. Мониторинг содержания микотоксинов на всех стадиях производства, транспортировки и хранения является необходимой и сложной задачей. Традиционные физико-химические методы анализа, хотя и обеспечивают высокую чувствительность, сопряжены с использованием дорогого стационарного оборудования и длительными процедурами пробоподготовки. В связи с этим крайне актуально создание иммунохимических методов определения микотоксинов, сочетающих экспрессность, низкую стоимость и простоту применения. Однако, так как допустимый уровень содержания этих соединений в пищевых продуктах крайне низок, известные иммунохимические методы их определения не всегда удовлетворяют практическим требованиям.
В связи с этим данное исследование направлено на разработку новых подходов с использованием конъюгатов антител и наночастиц коллоидного золота для создания двух высокочувствительных и экспрессных систем определения микотоксинов - иммунохроматографического анализа и иммуносен-сорного анализа на основе эффекта поверхностного плазмонного резонанса.
Несмотря на широкое применение конъюгатов антител с коллоидным золотом в аналитических целях, вопросы, связанные с влиянием состава конъюгатов и реакционной способности антител в них на характеристики иммуно-аналитических систем, остаются малоизученными. Проведенное в работе исследование этих взаимосвязей позволяет направленно оптимизировать тест-системы с применением коллоидного золота и расширить возможности их использования для детектирования как микотоксинов, так и других биологически активных соединений.
Используемые сокращения: антиАТ - антивидовые антитела, АФВ1 - афлатоксин В1, БСА - бычий сывороточный альбумин, ИФА - иммуноферментный анализ, ИХА -иммунохроматографический анализ, КЗ - коллоидное золото, опт.ед. - оптическая единица, ОТА - охратоксин А, отн.ед. - относительная единица, ППР - поверхностный плазмонный резонанс, ФБС - 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 М NaCI, ФБСТ - ФБС, содержащий 0,05% детергента Тритон Х-100, HEPES-B -10 мМ HEPES буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCI и 0,005% детергента Твин-20, OD - оптическая плотность, RU - резонансная единица.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействий нативных и иммобилизованных на коллоидном золоте антител с микотоксинами для разработки универсальных подходов, позволяющих снизить пределы обнаружения иммуноаналитических систем.
Достижение поставленной цели включало решение следующих задач:
изучить взаимосвязь между составом и свойствами конъюгатов антител с коллоидным золотом;
разработать и охарактеризовать методы усиления сигнала в проточных аналитических системах;
провести сравнительную оценку пределов обнаружения микотоксинов в различных форматах иммуноанализа;
апробировать разработанные тест-системы для анализа растительных проб, содержащих микотоксины.
Научная новизна. Проведено изучение и сопоставление реакционной способности свободных и конъюгированных с коллоидным золотом антител.
Получены сравнительные характеристики пределов обнаружения имму-носенсорного анализа при использовании свободных антител и разных способов введения наночастиц коллоидного золота в качестве маркера иммунных комплексов.
Предложена схема усиления регистрируемого сигнала и снижения предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе, основанная на использовании конъюгата антивидовых антител с коллоидным золотом.
Практическая значимость работы. Достигнуто десятикратное снижение пределов обнаружения микотоксинов в иммунохроматографическом и имму-носенсорном анализе благодаря применению немеченых специфических антител в сочетании с конъюгатом антивидовые антитела - коллоидное золото. Показано, что данная комплектация тест-систем позволяет существенно уменьшить расход дорогостоящих специфических антител.
Разработаны методы высокочувствительного и экспрессного определения охратоксина А и афлатоксина В1 на основе иммунохроматографии и иммуно-сенсорного анализа с регистрацией поверхностного плазмонного резонанса.
Связь работы с государственными программами. Работа поддержана ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих научных мероприятиях: V и VI международные конгрессы «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011),
международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва - Пущино, 2009), конференция «Экотоксико-логия-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Тула - Пущино, 2009), IV международный симпозиум «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2009), междисциплинарный микологический форум (Москва, 2010), международная конференция «Mycotoxin reduction -Global solutions» (Кейптаун, ЮАР, 2011), VIII всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2011» (Архангельск, 2011), международная конференция «Strategies to reduce the impact of myco-toxins in Latin America in a global context» (Мендоза, Аргентина, 2011).
Решением Ученого Совета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН в 2009 г. соискатель удостоен стипендии имени чл.-корр. РАН В.Л. Кретовича.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 10 тезисов в материалах отечественных и международных конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (4 главы) и списка литературы (255 наименований). Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок и 14 таблиц.
