Содержание к диссертации
Введение
2 Оболочечные белки вируса гепатита С и перспективы создания вакцины 12
2.1. Строение генома и организация вирусной частицы гепатита С 12
2.2.Экспериментальные модели для изучения вируса гепатита С 18
2.3.Молекулы на поверхности клетки-хозяина - предполагаемые рецепторы
для вируса гепатита С 25
2.3.1. Липопротеины низкой и очень низкой плотности и их рецепторы 25
2.3.2. SR-B1 и CD81 в качестве рецепторов для вируса гепатита С 27
2.3.3. Асиалогликопротеиновый рецептор 30
2.3.4. Лектины DC-SIGN и L-SIGN 32
2.3.5. Гликозаминогликаны 35
2.4.Структура и функции оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С .37
2.4.1. Общая характеристика структуры оболочечных белков 37
2.4.2. Вариабельность оболочечных белков 39
2.4.3. Структура и функции трансмембранных доменов оболочечных белков Е1иЕ2 43
2.4.4. Образование дисульфидных связей и фолдинг оболочечных белков Е1 иЕ2 46
2.4.5. Влияние гликозилирования оболочечных белков на их структуру и функции 48
2.4.6. ГетеродимерЕ1Е2 51
2.4.7. Образование вириона и высвобождение вирусной частицы во внеклеточное пространство 52
2.4.8. Участки оболочечных белков, ответственные за распознавание возможных рецепторов вируса гепатита С 53
2.4.9. Влияние оболочечных белков на регуляцию биосинтеза белков клетки-хозяина 55
2.5.Антигенные свойства оболочечных белков вируса гепатита С 57
2.6.Перспективы создания вакцины против вируса гепатита С 61
2.7.3аключение 65
3 Материалы и методы 66
3.1 Химические реагенты и биологические препараты 66
3.2 Растворители 68
3.3 Оборудование и программное обеспечение 68
3.4 Методы 70
3.4.1 Синтез пептидов 70
3.4.1.1 Снятие Fmoc-защиты cN-концевой аминогруппы 70
3.4.1.2 Присоединение Fmoc-защищенных аминокислот к свободным аминогруппам на иглах 71
3.4.1.3 Ацетилирование N-концевых ос-аминогрупп пептидов 72
3.4.1.4 Биотинилирование N-концевых а-аминогрупп пептидов 72
3.4.1.5 Снятие защит с боковых групп аминокислотных остатков пептида и снятие пептида в раствор пептидов с полимерного носителя 72
3.4.1.6 Восстановление сульфоксидных групп пептида 74
3.4.2 Тестирование биотинилированных пептидов на взаимодействие с гепарином 74
3.4.3 Конъюгация пептидов с белками-носителями 75
3.4.3.1 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием глутарового альдегида 75
3.4.3.2 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием N- гидроксисукцинимидного эфира 3-малеимидобензойной кислоты76
3.4.3.3 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием диметилсуберимидата 76
3.4.3.4 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием 1-этил-3'(3'-диметиламинопропил)карбодиимид 76
3.4.3.5 Качественная и количественная характеристика конъюгатов 77
3.4.4 Получение сывороток и препаратов иммуноглобулинов от иммунизированных животных 77
3.4.5 Тестирование сывороток методом иммуноферментного анализа 79
3.4.5.1 ИФА с использованием в качестве антигена на поверхности планшета синтетических пептидов или конъюгатов пептидов 79
3.4.5.2 ИФА с использованием на поверхности планшета в качестве антигена синтетических биотинилированных пептидов 81
3.4.5.3 ИФА с использованием в качестве антигена пептида, ковалентно связанного с поверхностью планшет 81
3.4.5.4 ИФА с использованием в качестве антигена на поверхности планшета оболочечного белка Е2 и гетеродимераЕ1Е2 82
3.4.5.5 Конкурентный иммуноферментный анализ 83
4 Результаты и их обсуждение 84
4.1 Составление структурно-функциональной карты оболочечных белков ВГС 84
4.2 Поиск гликозаминогликан-связывающих участков в высококонсерватив- ных фрагментах оболочечных белков ВГС 92
4.3 Изучение антигенных свойств высококонсервативных фрагментов оболо- чечных белков ВГС 98
4.3.1 Выбор высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС для изучения антигенной активности и синтез соответствующих им пептидов 98
4.3.2 Получение синтетических конструкций, включающих ВКФ для иммунизации животных 103
4.3.3 Получение антипептидных антител к фрагментам CR3, CR4, CR5 и CHR у кроликов . 109
4.3.4 Получение антипептидных антител к фрагментам CR1, CR5 и CHR у мышей 113
4.3.5 Определение специфичности антипептидных антител к препаратам оболочечных белков ВГС 119
4.4 Получение синтетических пептидных Т-В эпитопных конструкции на основе высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС. 121
4.4.1. Синтез Т-В эпитопных конструкций 121
4.4.2. Получение антител к Т-В-эпитопным конструкциям и определение их специфичности 122
4.4.3. Взаимодействие анти Т-В-эпитопных антител с препаратами оболочечных белков ВГС 128
4.5 Заключение 130
5 Выводы 133
6 Список литературы 134
7 Приложение 168
- Строение генома и организация вирусной частицы гепатита С
- Участки оболочечных белков, ответственные за распознавание возможных рецепторов вируса гепатита
- Химические реагенты и биологические препараты
- Составление структурно-функциональной карты оболочечных белков ВГС
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирус гепатита С (ВГС) является основной причиной парентерального (трансфузионного) гепатита, ранее называвшегося гепатитом ни А ни В. У большинства инфицированных (80%) гепатит С протекает в хронической форме и может вызывать цирроз и первичный рак печени. В настоящее время вакцина, предотвращающая заражение вирусом гепатита С, не разработана, а лечение а-интерфероном (в комбинации с рибавирином или без него) эффективно только лишь для ~40% больных хроническим гепатитом С и имеет в большинстве случаев серьезные побочные эффекты (Bartenschlager et al., 2000).
Оболочечные белки ВГС играют важную роль на ранних стадиях жизненного цикла вируса. Эти белки отвечают за взаимодействие с рецепторами, они участвуют в слиянии вирусной оболочки и клеточной мембраны, в сборке вирусной частицы в клетке и высвобождении из клетки. Несмотря на накопленные сведения об оболочечных белках и возможных рецепторах для ВГС, механизмы связывания вируса с поверхностью клеток, проникновения вирусной частицы в клетку-хозяина, а также сборки и высвобождения вирусной частицы из клетки все еще не установлены, точно не определены и участки оболочечных белков ВГС, ответственных за эти процессы. По этой причине изучение функциональных свойств оболочечных белков ВГС остается актуальной проблемой.
Оболочечные белки ВГС играют важную роль на ранних стадиях жизненного цикла вируса. Эти белки отвечают за взаимодействие с рецепторами и участвуют в процессах слияния вирусной оболочки и клеточной мембраны, сборки вирусной частицы в клетке и высвобождения из клетки. Несмотря на накопленные сведения о свойствах и функциях оболочечных
белков и возможных рецепторах для ВГС, механизмы связывания вируса с поверхностью клетки, проникновения вирусной частицы в клетку-хозяина, а также сборки и высвобождения вирусной частицы из клетки все еще не установлены. Имеется крайне мало информации об участках оболочечных белков ВГС, ответственных за эти процессы. По этой причине изучение структуры и функций оболочечных белков ВГС и их фрагментов остается актуальной проблемой.
Особенностью ВГС является чрезвычайно высокая вариабельность его оболочечных белков. Выделяют два гипервариабельных участка обо-лочечного белка Е2, которые являются иммунодоминантными; антитела против них способны нейтрализовать проникновение вируса в клетку. Однако эти антитела специфичны лишь к одному или нескольким квазивидам вируса и не обеспечивают защиту организма от иных генетических вариантов ВГС. Существование эпитопов вируснейтрализующих антител вне гипервариабельных участков подтверждают многочисленные экспериментальные данные (Farci et al., 1996; Shimizu et al., 1994; Mario et al., 1996; Rodda et al., 1996), однако ни в одной работе структуры таких эпитопов не были определены. По этой причине необходим поиск эпитопов оболочечных белков ВГС вне гипервариабельных участков.
Наибольший интерес представляют участки оболочечных белков, являющиеся консервативными для большинства квазивидов вируса. Такие участки могут быть ответственными за взаимодействие вируса с клеточными рецепторами и проникновение вируса внутрь клетки, и потому могут вызвать выработку вируснейтрализующих антител для различных генетических вариантов ВГС.
Таким образом, структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС является актуальной задачей. Информация о функционально значимых и антигенно
активных фрагментах оболочечных белков ВГС необходима для разработки иммуногенных конструкций, способных вызывать выработку вируснейтра-лизующих антител.
Цель работы - структурная характеристика функционально значимых участков оболочечных белков ВГС и определение антигенности высококонсервативных участков этих белков в составе искусственных конструкций.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
провести поиск и анализ описанных в литературе функционально значимых участков оболочечных белков и составить структурно-функциональную карту оболочечных белков ВГС;
выявить высококонсервативные фрагменты оболочечных белков ВГС, способные взаимодействовать с гепарином - предполагаемым рецептором ВГС;
синтезировать пептиды, соответствующие высококонсервативным участкам оболочечных белков ВГС, и получить пептидные иммуногенные конструкции;
получить антипептидные антитела и тестировать их на взаимодействие с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2.
Научная новизна. В работе впервые:
проведен поиск и анализ структурно- и функционально значимых аминокислотных остатков и целых фрагментов оболочечных белков ВГС и составлена структурно-функциональная карта оболочечных белков ВГС;
картированы сайты специфического взаимодействия с гепарином в составе четырех высококонсервативных участков оболочечного белка Е2 ВГС;
показана антигенность четырех (CR1, CR4, CR5 и CHR) высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС в составе конъюгатов с
белками-носителями и одного фрагмента (CR5), конъюгированного с полимером - полиосидонием, получены гипериммунные сыворотки, содержащие антипептидные антитела против этих фрагментов;
показана способность антипептидных антител, специфичных к фрагментам CHR и CR5, взаимодействовать с обол очечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС;
получены высокоантигенные синтетические Т-В-эпитопные пептидные конструкции, содержащие в своем составе высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2 ВГС и способные вызывать образование антител, взаимодействующих с полноразмерным оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС.
Практическая значимость исследования
Составленная структурно-функциональная карта может быть использована при изучении структурно-функциональных взаимоотношений оболочечных белков ВГС, взаимодействия оболочечных белков с молекулами поверхности клетки, эпитопном картировании, конструировании синтетических вакцинных конструкций. Карта позволяет установить функциональную значимость того или иного фрагмента или аминокислотного остатка (а.к.о.) для жизнедеятельности ВГС, его консервативность, возможные аминокислотные замены в пределах данного фрагмента (позиции), а также функции и консервативность близлежащих а.к.о. или участков оболочечных белков.
Картированные в оболочечных белках ВГС участки взаимодействия с гепарином могут быть использованы для поиска лигандов, блокирующих взаимодействие вирусной частицы ВГС с клеткой-хозяином, и разработки терапевтических средств против ВГС.
Обладающие антигенностью высококонсервативные фрагменты (ВКФ) оболочечных белков, исследованные в данной работе, могут быть
использованы в разработке синтетической пептидной конструкции для кандидатной вакцины против ВГС. Проявление антигенных свойств у фрагмента CR5 в конъюгате с полиоксидонием свидетельствует о возможности применения синтетических фрагментов оболочечного белка ВГС и полиоксидония (в качестве эффективного адъюванта) в разработке вакцины против ВГС.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих симпозиумах и конференциях: 5-ой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001), 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002), 3rd International and 28th European Peptide Symposium «Bridges Between Disciplines» (Prague, 2004), International Conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow, 2004). Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 5 апреля 2007 года.
Публикации
Материалы диссертационной работы опубликованы в 4 статьях и 6 публикациях сборников докладов научных конференций.
Структура и объем диссертации
Материалы диссертации изложены на 178 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 272 источника, приложения. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 15 рисунками.
2 Оболочечные белки вируса гепатита С и перспективы
создания вакцины
Строение генома и организация вирусной частицы гепатита С
Вирус гепатита С (ВГС) был идентифицирован только в 1988 году. Скрининг образцов крови на наличие гепатитов А и В доступными к середине 70-х годов методами анализа сывороток путем исключения указывал, что по крайней мере существует еще один не идентифицированный инфекционный агент ответственный за значительное число случаев по-сттрансфузионного гепатита. Этот инфекционный агент получил название ни-А ни-В гепатита (non-A, non-B hepatitis, NANBH). В отличие от вирусов гепатитов А и В ВГС не удавалось идентифицировать общепринятыми методами серологического анализа и методом прямой визуализации электронной микроскопией. Несмотря на то, что поиск вирусных частиц, антигенов и антител затруднялся относительно малым количеством циркулирующего вируса в крови пациентов, инфицированных NANBH, дальнейшие исследования показали, что причиной NANBH является вирус очень малого размера, имеющий оболочку и несущий генетическую информацию в форме РНК (Feitelson et al., 2002.). Только применение новых методов молекулярного клонирования позволило идентифицировать инфекционный агент NANBH. В конце 1980-х гг. Q.L. Choo с сотрудниками впервые клонировали в E.coli фрагменты вирусного генома, белковый продукт которых взаимодействовал с антителами сывороток больных NANBH (Choo et al., 1989). Вирус, определенный таким образом как основной этиологический агент ни-А ни-В гепатита, был назван вирусом гепатита С, а 1989 год стал датой его открытия. Идентификация ВГС с помощью молекулярного клонирования была первым шагом в изучении вируса. Изначально не были известны ни генетическая организация вируса, ни вирусные белки, транслируемые с генома ВГС, ни детали репликации. Несмотря на то, что вирусы гепатитов А и В (ВГА и ВГВ) так же, как и ВГС, инфицируют клетки паренхимы печени и реплицируются в них, сходства между этими вирусами не было обнаружено.
Было выявлено значительное генетическое и биологическое сходство ВГС с вирусами из семейства Flaviviridae, на основании чего ВГС был включен в это семейство в виде отдельного рода Hepacivirus (Shukla et al., 1995). В это же семейство впоследствии был включен родственный ВГС вирус гепатита G(B) приматов. В состав данного семейства входят также род Flavivirus (представители - вирусы клещевого и японского энцефалитов, лихорадок желтой, денге, Западного Нила) и Pestivirus (представители - вирусы диареи крупного рогатого скота, свиной холеры). Члены семейства Flaviviridae являются одними из самых мелких вирусов, имеющих бис-лойную липидную мембрану. Их геном представлен одной молекулой РНК положительной полярности с одной открытой рамкой трансляции (ОРТ). В процессе репликации под действием вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы с неё синтезируется РНК отрицательной полярности, которая служит шаблоном для синтеза копий РНК положительной полярности. Геномная РНК транслируется в полипротеин-предшественник, который ко- и постгрансляционно расщепляется на несколько отдельных молекул белков. Часть этих белков входит в состав образующейся вирусной частицы, а остальные участвуют в процессах репликации, формировании репликативно-го комплекса и воздействии на клетку-хозяина. Кроме одинакового процесса репликации у представителей семейства флавивирусов имеются и другие черты сходства: 1) протяженные высокоупорядоченные участки нуклеотидов в 5 -нетранслируемых районах геномов, содержащие несколько неработающих инициирующих кодонов; 2) примерно одинаковые длины полипротеинов-предшественников и профили их гидрофобности, за исключением районов, соответствующих белкам оболочки; 3) примерно одинаковая доменная структура белков репликативного комплекса, обладающих ферментативной активностью (протеаза-хеликаза и РНК-зависимая РНК-полимераза), и их локализация в похожих позициях полипротеинов вирусов (Van Doom, 1994). Наличие протяженного высокоупорядоченного нетранслируемого района на 5 -конце генома, содержащего ряд неработающих инициирующих кодонов, сходно с морфологическими особенностями 5 -конца геномов пикорнавирусов и некоторых вирусов растений, таких, как потивирусы (Bendinelli et al., 1999).
Участки оболочечных белков, ответственные за распознавание возможных рецепторов вируса гепатита
Было показано, что белки ВГС после трансляции и процессинга остаются заякоренными в мембране клетки. Накопление структурных и неструктурных белков ВГС в ЭР или ЭР-подобном компартменте, вероятно, необходимо для образования вириона. Исследование сборки вирусной частицы ВГС в данный момент невозможно из-за отсутствия адекватной модели репликации ВГС в клетке. Тем не менее, для других представителей семейства флавивирусов было показано, что вирионы образуются в ранних компартменах секреторного пути (вероятно, модифицированном ЭР) и высвобождаются из клеток путем экзоцитоза (Mackenzie et al., 2001). Группа исследователей показала возможность образования ВГС-псевдочастиц при экспрессии белков С-Е1-Е2 ВГС в составе вектора вируса лихорадки леса
Семлики в клетках млекопитающих (Blanchard et al., 2002). Разработанная модель позволила наблюдать образование ВГС-псевдочастицы на мембране ЭР методом электронной микроскопии и выяснить, что для ее образования необходима экспрессия кор-белка с сигнальной последовательностью обол очечного белка Е1, так как экспрессия одних обол очечных белков не приводила к образованию ВГС-псевдочастиц (Blanchard et al., 2002). В условиях эксперимента лишь несколько ВГС-псевдочастиц полностью высвобождались из ЭР; по-видимому, для процесса высвобождения вирусной частицы во внеклеточное пространство необходимы некоторые дополнительные факторы клетки-хозяина или вируса (Roingeard et al., 2004).
Знание участков оболочечных белков ВГС, участвующих во взаимодействии с молекулами на поверхности клетки-хозяина, позволит более эффективно разрабатывать новые средства лечения и профилактики ВГС-инфекции. Было обнаружено, что оболочечные белки разных штаммов ВГС взаимодействуют с LEL CD81 с разной эффективностью (Yagnik et al., 2000). Сравнение выравненных а.к. последовательностей оболочечного белка Е2 разных изолятов ВГС позволило предположить, что участок оболочечного белка ВГС, связывающий CD81, включает а.к.о. 474-494 и 522-551. Оба эти участка на трехмерной модели белка Е2 экспонированы на поверхности и сближены друг с другом. Также исходя из трехмерной модели было сделано предположение, что фрагмент 612-620 может участвовать во взаимодействии с CD81 (Yagnik et al., 2000). Действительно белок Е2 с точечными мутациями в области а.к.о. 613-618 не взаимодействовал с CD81 (Roccasecca et al., 2003). Кроме того, еще несколько участков, важных для взаимодействия с CD81, были идентифицированы с использова ниєм моноклональных антител. Один из участков располагается в районе позиций 412-423 (Owsianka et al., 2001), другой в районе позиций 432-447 (Owsianka et al., 2001), третий в районе 480-493 (Clayton et al., 2002; Flint et al., 2000; Owsianka et al., 2001), четвертый включает 528-535 а.к.о. (Clayton et al., 2002; Owsianka et al., 2001), а пятый - 544-551 а.к.о. (Flint et al., 2000; Owsianka et al., 2001). Недавно путем точечного мутагенеза в этих районах были выявлены а.к.о., участвующие в формировании сайта взаимодействия оболочечного белка Е2 с CD81: Trp420, Tyr527, Trp529, Gly530, Glu535 (Owsianka et al., 2006), а также Trp437, Leu438, Leu441 и Phe442 (Drummer et al., 2006).
Есть основания полагать, что рецепторы CD81 и SR-BI взаимодействуют с разными участками белка Е2 ВГС. Показано, что белок Е2 ВГС может выступать в роли линкера, связывающего друг с другом LEL CD81 и растворимую форму SR-BI (Нео et al., 2006). Мутантный белок Е2, в котором удален гипервариабельный участок 1(HVR1), взаимодействовал с CD81 с большей эффективностью, чем интактный Е2, но вовсе не взаимодействовал с SR-BI (Scarselli et al., 2002). HVR1, локализованный в N-концевой части гликопротеина Е2, по-видимому, участвует во взаимодействии белка с молекулой SR-BI и регулирует доступность сайта(ов) белка Е2, важных для взаимодействия с CD81. В таком случае речь может идти о кооперативности во взаимодействии оболочечных белков ВГС с двумя рецепторами, CD81 и SR-BI, однако это предположение не подтверждено прямыми экспериментами.
Химические реагенты и биологические препараты
Экспрессия белков ВГС в клетке приводит к возникновению так называемого эндоплазматического стресса, вызванного повышенным синтезом и накоплением неправильно свернутых белков (в частности, агрегатов белков Е1 и Е2) (Chan and Egan, 2005). В результате индуцируется экспрессия ряда факторов, участвующих в регуляции ответной реакции клеток на этот стресс. Некоторые из этих факторов (например, РНК-активируемая и инозит-зависимая протеинкиназы эндоплазматического ретикулума) вызывают торможение биосинтеза белка и увеличение цито-плазматического протеолиза, однако они же по механизму обратной связи стимулируют экспрессию факторов, оказывающих обратное действие (ша-перон ВІР - белок, связывающий тяжелые цепи иммуноглобулинов; Х-Ьох-связывающий белок). Выработка клеткой ВІР стимулируется также и бел ком Е2 ВГС (Liberman et al., 1999). Гиперпродукция первой группы факторов может приводить к апоптозу клеток, эффекту, наблюдаемому на начальной стадии заболевания гепатитом С. Продукция факторов второй группы блокирует цитопатическое действие факторов первой группы, способствует выживаемости клеток и стимулирует их пролиферацию. Предполагается, что при длительном персистировании ВГС активация оболо-чечными белками вируса факторов второй группы может явиться патогенетическим механизмом развития первичного рака печени (Chan and Egan, 2005).
Другим результатом воздействия оболочечного белка Е2 на регуляцию биосинтеза белка может быть блокирование антивирусного эффекта интерферона. а-Интерферон индуцирует синтез РНК-активируемой серин-треониновой внутриклеточной протеинкиназы PKR . Активированная PKR подвергается автофосфорилированию, а автофосфорилированная киназа фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF-2, который при этом инактивируется. Тем самым в клетке блокируется биосинтез белков, в том числе и вирусных. Данный механизм является одним из возможных механизмов антивирусного действия интерферона (Meurs et al., 1990). С-концевая часть оболочечного белка Е2 ВГС содержит последовательность 664SPLLL668, идентичную сайту автофосфорилирования PKR, а к этому уча 660 от ї"о664 стку прилегает последовательность SELS , идентичная последовательности сайта фосфорилирования eIF2, мишени PKR. Таким образом, участок 659RSELSPLLLTTT670, так называемый участок, гомологичный району фосфорилирования PKR/eIF2 (PKR/eIF2a phosphorylation homology domain, PePHD), может выступать в качестве конкурентного ингибитора фосфорилирования PKR и eIF2 или псевдосубстрата, что в любом случае будет нарушать механизм противовирусного действия интерферона.
Было установлено, что PePHD взаимодействует с PKR in vitro и ин-гибирует ее (Taylor et al., 1999). В ряде исследований выявлена корреляция между количеством мутаций в PePHD и эффективностью терапии ВГС интерфероном (Ukai et al., 2006; Gupta et al., 2006; Saito et al., 2003 Lo et al., 2001), в других работах такой корреляции не обнаружили (Gaudy et al., 2005; Hofmann et al., 2005; Yang et al., 2003; Quer et al., 2004; Sarrazin et al., 2001; Puig-Basagoiti et al., 2001). Следует, однако, учесть, что взаимодействие Е2 и PKR может быть лишь одним из возможных механизмов, при помощи которого ВГС избегает антивирусного эффекта интерферона.
Локализация оболочечных белков на поверхности вириона и участие их в процессах проникновения в клетки позволяют утверждать, что именно эти белки служат мишенью вирус-нейтрализующим антителам, и это подтверждается экспериментально (Farci et al., 1994, Choo et al., 1994, Flint and McKeating, 1999, Zibert et al., 1995, 1997, Shimizu et al., 1996). Показано, что шимпанзе, иммунизированные гетеродимером Е1-Е2, были защищены от заражения изолятом ВГС с аналогичными последовательностями этих белков, причем степень защиты коррелировала с присутствием антител, блокирующих репликацию вируса (Choo et al., 1994). Вирусные частицы, инкубированные с антителами против HVR1 Е2, теряли способность инфицировать животных (Farci et al., 1994) и клеточные культуры (Shimizu et al., 1996). Моноклональные антитела к тем участкам оболочечных белков, которые отвечают за взаимодействие с рецепторами ВГС, блокировали проникновение ВПЧ ВГС в клетки-мишени в опытах in vitro (см. разд. 1.4.8).
Составление структурно-функциональной карты оболочечных белков ВГС
Вода (для ВЭЖХ), ацетонитрил (для ВЭЖХ), изопропанол (для синтеза пептидов), N-метилпирролидон (99%) (Acros Organics, Бельгия).
НИ-диметилформамид (хч) (DMFA), метилен хлорид (хч), метанол (хч), диметиловый эфир, петролейний эфир (Т кип. 40-60С), диметилсульфоксид, уксусный ангидрид (хч), уксусная кислота (чда) (Реахим, Россия). Метанол и изопропанол очищали кипячением с активированным углем (20 г активированного угля на 1 л спирта) в течение 30 минут с последующей простой перегонкой при температуре 64-65 и 82-83С, соответственно. DMFA регенерировали азеотропной перегонкой с водой и бензолом (состав азеотропной смеси - DMFA : бензол : вода (125:15:6 об)), а затем перегонкой под вакуумом при температуре 52-53С / 20 мм рт. ст. Перед использованием DMFA выдерживали не менее трех суток над молекулярными ситами 0,4 нм (Merck, Германия) 80 г на 1л. . Хранили не более 1,5 мес. в темной бутыли при 4С (Atherton and Sheppard, 1989). Диметиловый эфир сушили над СаС12. Диметилсульфоксид регенерировали перегонкой под вакуумом водоструйного насоса.
Для приготовления буферных растворов использовали деионизованную воду, очищенную на установке Milli-Q фирмы «Millipore» (США).
Профили физико-химических и антигенных свойств оболочечного белка Е2 ВГС строили при помощи программного пакета ANTHERPROT 2000 V5.2 (http://antheprot-pbil.ibcp. fr/Documentation antheprot.htmP Т-хелперную активность анализировали с использованием обновленного программного обеспечения SYFPEITHI (http://svfpeithi.bmi-heidelberg.com/Scripts/MHCServer.dH/EpitopePrediction.htm).
Обработку данных проводили с помощью программного продукта «Microsoft Excel 2003». Для твердофазного синтеза пептидов в качестве носителя использовали насадки для игл типа DKP (емкостью 1 мкмоль) с Lys-Pro-овым спейсером для синтеза биотинилированных пептидов и насадки типа D-series Lantern Rink-amide (емкостью 8 мкмоль) фирмы "Mimotopes" (Австралия). Твердофазный синтез биотинилированных пептидов проводили в полипропиленовых планшетах с V-образным дном (Matrix, США).
Для иммуноферментного сорбционного анализа (ИФА) использовали полистирольные 96-луночные планшеты с плоским дном с высокой сорбционной емкостью фирмы «Costar» (США).
Измерения оптической плотности в лунках планшетов проводили с помощью многоканального регистрирующего спектрофотометра «Multiscan Plus» фирмы «Labsystems» (Финляндия). Промывку лунок иммунологического планшета проводили на вошере Wellwash АС фирмы «Labsystems» (Финляндия). Составление регламента синтеза и обработку результатов выполняли на IBM-совместимом компьютере Pentium III. Для внесения растворов использовали автоматические пипетки «FinnPipette» фирмы «Labsystems» (Финляндия) и «Ленпипет» фирмы «Ленпипет» (Россия). Для приготовления сывороток использовали центрифугу «Beckman TJ-6» фирмы «Beckman» (США) и микроцентрифугу фирмы «Costar» (США). Для синтеза пептидов и проведения ИФА использовали термостат с водяной рубашкой "Apparatebau Berlin С.2" фирмы "E.Schulz &Со" (Германия) и шейкер для планшетов "Titertek" фирмы "ТИеі1ек"(Великобритания). Электрофорез конъюгатов белков с пептидами в полиакриламидном геле проводили в камере «Mini-protean II» фирмы «Bio-Rad» (США). Иммунологические планшеты для повышения сорбционной способности обрабатывали облучением ультрафиолетом на горизонтальном УФ-трансиллюминаторе Т2201 фирмы «Sigma» (США).
Экстракцию пептидов после снятия с носителя производили с использованием центрифуги Eppendorf 581 OR фирмы Eppendorf (Германия), роторного испарителя Buchi Rotavapor R-114, Buchi Waterbath B-480 (Германия).
Контроль качества пептидов в процессе и по окончании синтеза проводили на масс-спектрометре Bruker Scout 384 Reflex III фирмы Bruker Daltonics (Германия).
