Содержание к диссертации
Введение
2. Общая характеристика липаз (обзор литературы) 3
2.1 Структура липаз 3
2.2 Активация липаз на поверхности раздела фаз б
2.3 Физико-химические свойства липаз 15
2.4 Катализируемые липазами реакции 18
2.5 Иммобилизация в приложении к липазам 23
2.5.1 Методы иммобилизации ферментов 23
2.5.2 Факторы, влияющие на активность иммобилизованного препарата 32
2.6 Изучение липаз методом монослоев 37
3. Результаты и обсуждения 43
3.1 Получение и свойства копреципитатов липазы с гидрофобными соединениями 43
3.1.1 Получение и свойства коприципитатов липазы с гидрофобными соединениями с одинаковой длиной гидрофобного радикала 43
3.1.2 Получение и свойства коприципитатов липазы с гидрофобными соединениями с разной длиной гидрофобного радикала 53
3.2 Изучение взаимодействия липазы с гидрофобными соединениями методом монослоев 58
3.2.1 Изучение взаимодействия липазы с гидрофобными соединениями с одинаковой длиной гидрофобного радикала 58
3.2.1.1. Изучение поверхностных свойств гидрофобных соединений 58
3.2.1.2 Изучение сорбции липазы на монослои ПАВ 60
3.2.1.3 Изучение активности фермента в смешанных монослоях липаза - ПАВ 67
3.2.1.4. Изучение структуры смешанного монослоя липаза - ПАВ 69
3.2.1.5 Изучение электрических свойств смешанных монослоев липаза - ПАВ 73
3.2.2. Изучение взаимодействия липазы с соединениями с различной длиной гидрофобного радикала 74
3.2.2.1 Изучение взаимодействия липазы с N-алкилацетамидами 74
3.2.2.2 Изучение взаимодействия липазы с первичными аминами 82
3.2.3 Корреляция между поверхностными свойствами смешанных монослоев липаза - ПАВ и каталитическими свойствами преципитатов липазы с ПАВ 89
3.3 Иммобилизация липазы на твердых носителях 95
3.3.1 Физическая сорбция липазы на носитель Celite 545 95
3.3.2 Ковалентное связывание липазы с носителем Eupergit C250L 99
3.3.3 Получение препаратов иммобилизованной липазы на основе твердых композиционных сорбентов 101
4. Экспериментальная часть 108
4.1 Материалы 108
4.2 Методы исследования 109
5. Выводы 117
6. Список литературы
- Активация липаз на поверхности раздела фаз
- Получение и свойства коприципитатов липазы с гидрофобными соединениями с одинаковой длиной гидрофобного радикала
- Изучение взаимодействия липазы с гидрофобными соединениями с одинаковой длиной гидрофобного радикала
- Изучение взаимодействия липазы с соединениями с различной длиной гидрофобного радикала
Введение к работе
Иммобилизация ферментов представляет собой одно из важнейших направлений современной прикладной биохимии и биотехнологии и активно развивается уже как минимум четыре десятилетия. Тонкий органический синтез лекарственных препаратов и их компонентов, высокоселективная химическая модификация и протеолиз белков, иммуноаналитические методы и создание высокочувствительных биосенсеров - все эти области науки, техники и медицины используют иммобилизованные ферменты. Известно что в иммобилизованном состоянии ферменты часто приобретают такие важные свойства как повышенная термостабильность, устойчивость к денатурирующим агентам и возможность выделения из реакционной смеси для повторного использования. Несмотря на то, что на сегодняшний день разработано множество методов иммобилизации различных ферментов, потребность в создании стабильных высокоселективных ферментных препаратов по-прежнему возникает довольно часто и поток научных публикаций на эту тему отнюдь не иссякает.
В ряду гидролитических ферментов, используемых как катализаторы органо-химических превращений, липазы (КФ 3.1.1.3) занимают особое место ввиду возможности их использования как в реакциях гидролиза липидов и сложных эфиров, так и в реакциях энантиоселективной этерификации и переэтерификации в органических растворителях или в водно-органических системах. В настоящее время интенсивно изучаются различные методы иммобилизации липаз, такие как физическая сорбция на гидрофобных адсорбентах, включение в гидрофобные гели и обработка фермента синтетическими липидоподобными реагентами. Различные методы иммобилизации дают возможность получать катализаторы с широко варьируемыми свойствами. Применение иммобилизованных липаз в энантиоселективном синтезе органических соединений обусловлено необходимостью получения широкого спектра хиральных органических соединений с высокой степенью оптической чистоты. К таким соединениям относятся, в
частности, некоторые лекарства и их составляющие, а так же различные биохимические реагенты.
В данной работе исследована возможность получения высокоэффективных препаратов иммобилизованной липазы как путем включения фермента в копреципитаты ряда гидрофобных соединений, так и сорбцией белка на твердые носители при различных условиях, а также разработаны твердые композиционные сорбенты для получения высокоактивных и стабильных препаратов иммобилизованной липазы для катализа в водных средах и в органическом растворителе. Для понимания поведения липазы на поверхности раздела фаз вода - органический растворитель и изучения взаимодействия липазы с гидрофобными соединениями несубстратной природы был впервые использован метод монослоев.
Задачи данной работы были следующими: 1) изучение условий включения липазы из Pseudomonas fluorescens в копреципитаты ряда гидрофобных соединений; 2) изучение влияния природы гидрофобных соединений на каталитические свойства копреципитатов; 3) изучение методом монослоев взаимодействия липазы с гидрофобными соединениями на молекулярном уровне; 4) поиск корреляции между каталитическими свойствами преципитатов и характеристиками монослоев гидрофобных соединений до и после встраивания фермента; 5) разработка и получение высокоэффективных препаратов иммобилизованной липазы на основе твердых композиционных сорбентов.
В обзоре литературы изложено современное состояние исследований структуры и свойств липаз, а также содержатся сведения об иммобилизации липаз различными методами и влияния различных факторов на активность и стабильность иммобилизованных препаратов.
2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПАЗ
2.1 Структура липаз
В настоящее время выделены липазы из 34 различных источников, из которых 18 видов - из плесневых грибов и 7 - из бактерий [1].
Первичная структура белка была определена как для панкреатических липаз [2] так и липаз, выделенных из микроорганизмов [3, 4], бактерий [5, 6] и грибов [7]. Число аминокислотных остатков в липазах варьируется от 270 до 700. На Рис.2.1 представлена аминокислотная последовательность бактериальных липаз рода Pseudomonas [5].
Характерной чертой всех липаз является наличие аминокислотной последовательности His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly или Y-Gly-His-Ser-W-Gly (где W, X, Y, Z - неспецифичные аминокислотные остатки) [8]. Наличие остатка гистидина в составе активного центра липазы было доказано инактивацией фермента при фотоокислении [9] и при взаимодействии с диэтилпирокарбонатом [10] и с этоксиформиатом [11]. Присутствие остатка серина было определено по изменению активности липазы с п-нитрофенилфосфатом [12], при применении специальных ингибиторов, таких как ионы меди [13], и по реакциям взаимодействия с органофосфатами [10]. Методом «обратимого бифункционального ингибирования» борорганическими кислотами исследовали [14] топографию активного центра липаз. Было установлено, что участок гидрофобного связывания алкильной цепи субстрата непосредственно примыкает к каталитическому участку активного центра, имеет протяженность, приблизительно соответствующую длине углеводородной цепи из 8 метиленовых звеньев, и содержит изгиб на удалении 3-4 метиленовых звеньев от каталитического центра.
Рис.2.] Первичная структура бактериальных липаз (выделены участки аминокислотной последовательности каталитические триады (голубым), сходные фрагменты (черным) , а различающиеся (желтым)).
Рис.2.2 Структура липазы из Pseudomonas aeruginosa, полученная методом кристаллографии (В-складчатая структура представлена стрелками, а-спираль - спиралью и прямоугольниками, красным цветом выделен связывающий участок активного центра).
Третичная структура липазы из Rhizomucor miehei и панкреатической липазы впервые была определена в 1990 году методом кристаллографии [15,16]. С тех пор была определена структура липаз из 11 источников, причем все, кроме панкреатической, имеют микробную природу. Молекулы липаз представляют из себя эллипсоид размером 35-50 х 40-50 х 50-70 А. Анализ третичной структуры липаз показал, что в цепи содержится до 8 участков р-складчатого листа, связанных с 6 а-спиралями. Активный центр фермента формируется аминокислотной триадой Ser, Gly и His, нуклеофильный остаток Ser располагается на С-конце 65-складчатого листа в "прочном " пентапептиде GXSXG, образующим участок В-петля - ct-спираль, называемый "нуклеофильный изгиб". Нужно отметить, что аминокислотная триада, хотя и химически аналогична триаде сериновых протеиназ, но имеет значительные структурные отличия. На Рис.2.2 представлена структура липазы из Pseudomonas aeruginosa, полученная методом кристаллографии [5].
Исследования четвертичной структуры липаз показали, что в зависимости от происходения они состоят из двух [17], четырех [18] и шести [19] субъ-единиц. Некоторые липазы также ассоциированы с глюкозидами [16] и липидами [20].
Молекулярная масса известных липаз варьирует от 27кДа для липазы из Penicillium cyclopium [21] и ЗЗкДа для липазы из Pseudomonas fluorescens [22] до 500кДа для липазы из языка человека [23]
2.2 Активация липаз на поверхности раздела фаз
Впервые активация липазы на поверхности раздела фаз была описана Вилыитеттером в 1924 году при изучении гидролиза тристеарина [24]. Однако в то время считалось, что
растворимые эфиры также являются субстратами липаз. Позже Сарда и др. [25] выдвинули гипотезу, постулировавшую, что для липазы действие на поверхности раздела является не только типичным, но и составляет ее сущность. При изучении катализируемого панкреатической липазой гидролиза сложных эфиров, ограниченно растворимых в воде (триацетин, метилбутират), было обнаружено, что активность фермента по отношению к истинному раствору субстрата низка. При повышении концентрации субстрата до значений, превышающих предел растворимости, субстрат образует эмульсию, что сопровождается резким возрастанием ферментативной активности (Рис.2.3) [26]. Резкое возрастание активности липазы по отношению к трикапроину при превышении предела растворимости субстрата наблюдалось также в работе [27].
v,
у.с. 3
I
О 12
Концентрация триацетина
Рис.2.3 Зависимость скорости гидролиза триацетина под действием панкреатической липазы (1) и эстеразы из печени (2) от концентрации субстрата. За единицу концентрации субстрата принята концентрация его насыщенного раствора.
Активация липазы наблюдается не только под действием эмульсии субстрата, но и в случае, когда в реакционной смеси присутствуют инертные гидрофобные поверхности. Так Брокман и сотр. [28] обнаружили 1000-кратное возрастание скорости липолиза трипропионина (в истинном растворе) при введении в реакционную смесь силиконизированных стеклянных шариков. Увеличение активности фермента наблюдается при иммобилизации липаз на поверхность макропористого стекла различного размера [29], полиуретановых [30] и полиакролеиновых частиц [31].
Поверхность раздела фаз
Масло і Вода
Гидрофильный
хвост /
идрофоо- v, / идя головка \ /
Активный центр
Рис.2.4 Гипотетическая модель ориентации панкреатической липазы относительно поверхности раздела субстрат-вода
На Рис.2.4 представлена гипотетическая модель ориентации липазы на поверхности раздела фаз. Согласно этой модели, присоединение фермента к поверхности масляной капельки (суперсубстрату) достигается на суперсубстратном связывающем участке, гидрофобной головке. Этот участок не только связывает фермент с субстратом, но и обеспечивает точную ориентацию субстрата. Реакционный участок находится вблизи гидрофобной головки, но отделен от нее. Такое устройство обеспечивает совмещение
субстрата и активного центра, однако, липофильное фермент-субстратное связывание исключается, и при этом слева открыт доступ для воды, которая необходима для гидролиза ацилфермента. Соответствующая ориентация молекулы липазы, возможно, еще больше стабилизируется за счет полярных или заряженных аминокислотных или углеводных остатков, которые образуют гидрофильный хвост молекулы [32].
Кинетическое описание реакций, катализируемых лиолитическими ферментами, имеет ряд особенностей. Так, поскольку «естественные» субстраты этих ферментов нерастворимы в воде, понятие «концентрация субстрата» в данном случае не имеет смысла, так как действию фермента доступны лишь те молекулы субстрата, которые расположены на поверхности раздела фаз. При неизменных молекулярных концентрациях субстрата и фермента скорость реакции оказывается различной в зависимости от степени дисперсности субстрата. Более целесообразно при рассмотрении реакций липолиза выражать концентрацию субстрата в виде отношения площади поверхности раздела к объему водной фазы. В этом случае кинетика липолиза подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, причем значения ккат и Кт могут быть определены из экспериментальных данных. Однако величина Кт, которая для гомогенных фермент-субстратных систем служит мерой сродства субстрата и фермента, в данном случае не имеет однозначного физического смысла, поскольку образованию фермент-субстратного комплекса предшествует адсорбция на поверхности фаз.
Брокерхофф и Дженсен [32] предлагают рассматривать уравнение реакции липолиза в следующем виде:
ki fo к5
Е + Ss zl IE+S ] ^ ES ^$1 E+P
Ь k4 кб
где, Е, Ss и S - концентрации фермента, суперсубстрата, в который включен субстрат и
субстрата, соответственно.
Согласно этой схеме, комплекс, образующийся в результате адсорбции фермента на
поверхности субстрата, претерпевает молекулярный переход в истинный комплекс
Михаэлиса, распадающийся затем с образованием продукта и свободного фермента.
Кинетические уравнения для рассматриваемой схемы выглядят следующим образом:
= (k\k3k5[S][E0])
к2к5 + к2к4 + кЪк5 + к\(кЗ + Н + k5)[S]
кЗк5[Е0] =Ш + Ш + Ш
~ кЗ + к4 + к5 т~ к\(кЗ + к4 + к5)
Легко видеть, что Кт оказывается сложной величиной, состоящей из пяти отдельных констант, которые невозможно рассчитать, исходя только из двух экспериментально определяемых параметров V и Кт . Две из пяти констант-kl и к2 - относятся к образованию комплексов фермент-суперсубстрат (фермент-поверхность раздела), кЗ и к4 относятся к образованию истинного комплекса Михаэлиса, к5 - это ккат . Существующие методы не позволяют разграничить образование комплексов фермент-поверхность раздела фаз и фермент-субстрат.
Такая схема липолиза используется для короткоцепных субстратов, например, трипропионата [33] при невысокой концентрации субстрата, при которой кинетика липолиза имеет псевдо-первый порядок.
Верже и др. [34] предложили иную схему липолиза, исходя из модели поверхности раздела фаз, показанной на Рис.2.5.
Водная E =^=^ к еі: ^\ Липидная
Фаза kd к _ I к_Л]к1 фаза
-Поверхность раздела фаз
Рис.2.5 Предполагаемая модель действия растворимого фермента на поверхности раздела.
Не считая возможным рассматривать стадию образования истинного комплекса Михаэлиса как мономолекулярную реакцию авторы ввели «межфазную» или «двумерную» константу Михаэлиса Км*, описывающую реакцию на границе раздела и определяемую как
KM*=(kcat+k.i)/ki Равновесие между растворенным (Е) и находящимся на границе раздела фаз «проникшим» ферментом (Е*) определяется отношением константы десорбции kd к константе скорости проникновения кр, т.е. к^/кр. Уравнение Михаэлиса-Ментен для липолиза в этом случае выглядит так:
'Ттах"[5]
о =
'Юи"+[5]
"Г та::"- кса*Ео№ "Кт"=Ы Km*[S]
Km*+[S] kp Km*+[S]
В таком случае максимальная скорость липолиза лимитируется количеством субстрата, которое взаимодействует с ферментом [35].
Заметим, что вышеуказанные модели липолиза сильно упрощены и не могут точно описывать кинетику реакции. В настоящее время доказано, что реакции, катализируемые липазами, протекают по двухстадийному механизму аналогично катализу сериновымы гидролазами [36]. Такой механизм называется «пинг-понг» (Bi-Bi) и протекает в две стадии: первый этап - это формирование ацилфермента в результате нуклеофильной атаки и второй -гидролиз ацилфермента.
На Рис.2.6 представлен механизм реакции этерификации, катализируемой липазами. Механизм такого катализа связан с наличием в связывающем участке активного центра аминокислотной триады Ser, His Asp или Gly. На первом этапе в результате нуклеофильной атаки остаток серина формирует тетраэдрический промежуточный комплекс с карбонильной группой кислоты RiCOOH. Этому взаимодействию благоприятствует предшествующее образование водородной связи между Ser и His-Asp, при котором происходит уменьшение электронной плотности на гидроксильной группе Ser. На втором этапе молекула воды отделяется от промежуточного комплекса и образуется, так называемый, ацилфермент. На третьем этапе ацилфермент подвергается нуклеофильной атаке вторым компонентом реакции (спиртом R2OH) в результате чего снова образуется промежуточный комплекс. На последнем этапе высвобождается молекула эфира RiCOOR.2 [37].
Связывающий участок активного центра липаз, состоящий из аминокислотной триады, закрывается так называемой "крышкой", которая представляет из себя фрагмент амфифильной а-спирали, стабилизованный обширными гидрофобными и электростатическими взаимодействиями (Рис.2.2 выделение красным цветом). В растворе такая "крышка" находится в конформации недоступной для субстрата, при этом на поверхности раздела фаз связывающий участок активного центра изменяет свою конформацию и открывается, в результате чего субстрат достигает активного центра и
протекает ферментативная реакция. Такая активация фермента имеет место на поверхности раздела липо- и гидрофильных фаз [38].
0--Н ^ Н
І-6
-О - vh
* \
I \ * I
о н ^ н
t I
O-H ^ H
i~6 .-0- NR2
* і
Ser4 m n
Рис.2.6 Схема механизма реакции этерификации, катализируемой липазами
Кинетическая модель такой реакции, состоящей из стадий связывания глицерида, образования ацилфермента, выделения спирта, связывания воды, деацилирования фермента и выделения жирной кислоты, представлена ниже.
E+G
k-i кг
EG ^=
k-2
EG FP
к-з k4
F + P
k-4 ks
FW —
FW EQ
E + Q
EQ ^
k-6
Где G - молекула триглицерида, W - вода, E и F -нативная и ацилированная формы фермента, Q и Р -свободная жирная кислота и продукт (диглицерид или моноглицерид).
О R2
Скорость реакции в таком случае будет описана следующим образом:
eiCgCw
" Ср + eiCg + 03CgCp + OACgCw + 05CqCp
где, 9j -значение функций от констант к;.
Такая кинетическая модель была подтверждена в работах [39,40] на примере гидролиза липазами из Candida cylindracea и Aspergillus niger.
Исторически существовали две теории объяснения явления активации липаз на поверхности раздела фаз. Согласно первой теории [28, 41] активация липазы при сорбции на гидрофобной поверхности объясняется повышением локальной концентрации субстрата вблизи активного центра фермента. Однако, хотя повышение локальной концентрации и вносит определенный вклад в явление активации, рассматриваемую теорию нельзя считать исчерпывающей. Так, при любой концентрации субстрата скорость ферментативной реакции не может превышать скорости, которая достигается в случае, когда весь фермент связан в фермент-субстратный комплекс. В то же время скорости реакции, наблюдаемые при гидролизе липазой эмульгированного субстрата, во много раз превышают значение скорости, вычисленное для гидролиза того же субстрата в форме истинного раствора [26].
По второй теории, наиболее предпочтительной в последнее время высокая каталитическая активность липолитических ферментов по отношению к агрегированным субстратам объясняется существованием особым типом адсорбции фермента на поверхности раздела фаз, при которой наблюдается оптимальная ориентация активного центра липазы по отношению к субстрату [42, 43] и существенным увеличением энтропии активации по сравнению с истинным раствором [44, 45] . Процесс сближения и взаимной ориентации
фермента и субстрата в растворе термодинамически невыгоден [46], в случае же агрегированного субстрата поступательная подвижность молекул субстрата ограничена, и ориентация молекул оказывается оптимальной для протекания ферментативной реакции.
2.3 Физико-химические свойства липаз
Липазы хорошо растворимы в воде. Большинство липаз животного происхождения проявляют рН-оптимум в щелочной среде при рН 8-9, однако, в зависимости от типа субстрата или присутствия солей и эмульгаторов рН-оптимум может смещаться в кислую область. У микробных липаз наибольшая активность наблюдается при изменении рН от 5.6 до 8.5, а стабильность - в нейтральной области [47]. Влияние значения рН среды на активность липазы Pseudomonas spp. МС50 в реакции гидролиза различных субстратов представлено на рис 2.7 [48]. Оптимальная температура при катализе липазами составляет 30-40С, однако, нужно отметить, что термостабильность липаз зависит от их происхождения. Липазы из животных или растительных источников менее термостабильны, чем микробные липазы. Термостабильность липазы Pseudomonas spp. МС50 при нагревании от 100С до 150С представлена на рис 2.8 [48]. Для липазы из Pseudomonas fluoresceins оптимальная температура гидролиза составляет 50-55С [22]. Влияние температуры на активность в реакции гидролиза различных субстратов представлено на рис 2.9 [48]. Доказано, что термостабильность липаз в органическом растворителе выше чем в водной среде. Так липаза Pseudomonas sp. сохраняет 80% своей первоначальной активности после инкубации при 80С в течение 6 часов в обезвоженном циклогексане и только 20% своей активности при инкубировании при 80С в течение 20 минут в водной среде [49].
- кукурузное масло -кокосовое масло -оливковое масло -животное масло
Рис. 2.7 Влияние значения рН среды на активность липазы Pseudomonas spp. МС50 в реакции гидролиза различных субстратов [48].
время, с
Рис.2.8 Термостабильность липазы Pseudomonas spp. МС50 при нагревании [48].
— О — кукурузное масло — кокосовое масло —Д— оливковое масло —— животное масло
0 \ 1 , г , , ,
температура, С
Рис.2.9 Влияние температуры на активность в реакции гидролиза различных субстратов [48].
На активность липаз влияет присутствие в реакционной системе добавок неорганических солей и детергентов. Липаза из Pseudomonas jluorescens инактивируется на 30% при добавлении в реакционную систему ZnCb и HgCb, но активация фермента на 20% происходит при добавлении ВаСЬ и СаСЬ при проведении реакций гидролиза триглицеридов [22]. Активация липазы Pseudomonas sp. в 1.6, 1.45 и 1.3 раза в реакции гидролиза оливкового масла наблюдалась в присутствии в реакционной системе ионов Са2+, Mg2+, К+, соответственно [49]. Увеличение активности панкреатической липазы в 2 раза в реакции гидролиза триацетина наблюдали в присутствии в реакционной смеси 0.1 моль NaCl [50]. Частичную дезактивацию липазы Pseudomonas sp. в присутствии таких детергентов как Triton Х-100, Twin 20 и 80, натриевых солей олеиновой и стеариновой кислот отмечали в работе [49]. Влияние органических соединений на активность бактериальных липаз рассматривали в работе [51]. В реакции гидролиза триолеина активация липаз из Candida rugosa, Geotrichum candidum, Pseudomonas species и Rhizopus arrhizus происходила только в присутствии
гумиарабик в 2.1, 2.3, 1.15 и 4.9 раза, соответственно. Активация липазы из Rhizopus arrhizus происходила в присутствии всех добавок: БСА, желатина, гумиарабик и овальбумина.
2.4 Катализируемые липазами реакции
Липазы давно и успешно применяются в тонком органическом синтезе. Уникальная специфичность ферментов, высокая скорость реакции, возможность проведения процесса в "мягких" условиях, отсутствие побочных процессов - все эти факторы способствуют использованию ферментов как катализаторов многих органических реакций для синтеза новых соединений, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым к веществам при изготовлении лекарственных средств, в сельском хозяйстве и других областях.
В промышленных масштабах липазы используются в реакциях стерео- и региоселективного гидролиза липидов и сложных эфиров, а также для стереоселективной этерификации спиртов в безводных или почти безводных средах, равновесие в которых сдвинуто в сторону образования сложноэфирной связи [52-55].
Схема гидролиза триглицеридов представлена на Рис.2.10. Липазы, выделенные из природных источников, могут проявлять как позиционную специфичность (sn-1,3 и sn-2), так и быть позиционно неспецифичными, т.е . гидролизовать все три эфирные связи одновременно. Нужно отметить, что зп-1,3-специфичность у липаз более распространена по сраневнию с sn-2-специфичностью ввиду стерических препятствий для гидролиза. Вначале считали, что гидролиз триглицеридов в кишечнике под действием панкреатической липазы является полным, однако в 1945 году было обнаружено, что основными продуктами расщепления триглицерида являются различные глицериды, а не глицерин. Позже было установлено, что диглицериды образуются быстро, моноглицериды - более медленно, а
глицерин - очень медленно [32]. Позиционную неспецифичность проявляют липазы из Pseudomonas fluorescens [22], Chromobacterium viscosum [41], Candida cylindracea [56], Pemcillium cyclopium [57]. зп-1,3-специфичность показывают панкреатическая липаза [58], липазы из Rhizopus arrhizus, Aspergillus niger, Mucor miehei [59]. sn-2-специфичность для липаз наблюдается крайне редко и обнаруживается у липаз из Geotrichum candidum в случае уникального гидролиза олеиновой и линоленовой кислот [60].
Жирная кислота
Триглицерид Глицерин
Рис.2.10 Схема реакции гидролиза триглицеридов под действием липаз.
На скорость гидролиза триглицеридов влияет также структура жирной кислоты, а именно, длина цепи, наличие объемных заместителей и степень ненасыщенности. В работе [61] было показано, что наиболее предпочтительными субстратами для панкреатической липазы являются бутираты (С4), сходный эффект наблюдается у липазы из Mucor miehei для С4 и С6 насыщенных кислот при рН 8 [62]. Колоколообразная зависимость скорости гидролиза жиров от числа атомов углерода в остове ненасыщенных жирных кислот была определена в работе [41], для липаз из Chromobacterium viscosum и Geotrichum candidum. Центр такой зависимости находится при Cg-Сю.
Ингибирующее действие ветвления углеродной цепи на липолиз было обнаружено у эфиров изомасляной кислоты, дальнейшие исследования гидролиза моноэфиров под
действием панкреатической липазы показали, что ингибирование, которое является почти полным при наличии а-заместителя постепенно исчезает, по мере того как цепь удлиняется до шести углеродных атомов [61].
Такие жесткие требования к субстратам у липаз объясняются формой строения активного центра белка. Хотя и большое количество субстратов может связываться со связывающим участком активного места, только некоторые из них способны высвобождать энергию, необходимую для перехода липазы в наиболее активную для катализа конформацию. Короткоцепные или не содержащие двойных связей субстраты не обладают такой способностью, поэтому изменение конформации липазы не происходит, и реакция протекает очень медленно [63].
Наряду с гидролизом сложных эфиров липазы катализируют реакции энантиоселективной этерификации и переэтерификации, которые протекают в безводных или почти безводных средах. В органической химии липазы используются для катализа регио-, стерео- и химических превращений. Обычно для этих целей используются липазы из микробных источников [64].
Существует два вида энантиоселективных превращений под действием липаз: 1) реакции с хиральными субстратами, 2) разделение рацематов [65-68]. В таблице 2.1 представлены некоторые реакции, катализируемые липазами. Без преувеличения можно сказать, что благодаря энантиоселективному катализу липазами можно получить наиболее важные и труднополучаемые классы органических соединений. Обычно для этого используют бактериальные липазы рода Pseudomonas, Candida, Bacillus, Achromohater, Serratia и другие.
Основное преимущество ферментов в сравнении с обычными химическими
катализаторами - их исключительная селективность. Это обстоятельство имеет решающее
значение, когда энантиоселективность является главным требованием, обеспечивает
образование вместо рацемических смесей индивидуальных изомеров оптически активных
веществ [71].
Таблица 2.1
Примеры химических реакций, катализируемых липазами
Субстрат
Источник липаз
Продукт
Выход,
%
Энантио-
мерная
чистота, %
МеО
С02Ме
Serratia
marcescens
^4
С02Ме
>98
СН,
Pseudomonas
sp.
сн.
^о
Ме02С со2н
CO,R
Pseudomonas sp
>95
Сг(СО)3
Candida antartica
Pseudomonas sp
Сг(СО)з
>99
NH,
CO?Et
Candida
antarctica
AcNH
CO,Et
PhCH2OH
Pseudomonas
PhCH2OAc
99.2
sp.
Pseudomonas fluorescens
X.
X.
Me" "Ph
(R)
>99
Pseudomonas
kOAc
sp.
""//,/
(±)
(1R,2S)
OH OH
Pseudomonas sp.
О Ph
,.rt\H
OAc OH
(S)
Pseudomonas
sp.
»н
"OH
-..
O —Ac
Pseudomonas
sp.
Pseudomonas
[CH2]n
[CHJn
sp.
Субстратная специфичность липаз проявляется в том, что фермент благодаря хиральности своего активного центра, превращает лишь один из энантиомеров рацемической смеси. Распознавание энантиомеров в ферментативной реакции представлено на Рис. 2.11.
Rl Y Rl X
Липаза \ / , \ /
cv Cv
/ \ / \
R2 Z R2 Y
Рис. 2.11 Распознавание энантиомеров
По окончании реакции в реакционной смеси находятся два разных энантиомерных вещества, которые можно разделить общеизвестными методами. Поскольку выделяемый новый продукт составляет максимум 50% исходной рацемической смеси, то в промышленном производстве оставшийся энантиомер обычно рацемизируют и возвращают обратно в процесс [72].
2.5 Иммобилизация в приложении к липазам. Влияние иммобилизации на каталитическую активность и стабильность фермента
2.5.1 Методы иммобилизации липазы
С экономической точки зрения в промышленных масштабах желательно применение иммобилизованных ферментов, ввиду возможности повторного или непрерывного использования биокатализаторов, высокой устойчивости иммобилизованных ферментов к денатурирующим агентам, простоты выделения катализатора из реакционной системы и
продукта с высокой степенью чистоты, а так же возможности воздействовать на ход ферментативной реакции, изменяя метод иммобилизации. В связи с этим уже много лет интенсивно изучаются такие методы иммобилизации липаз как физическая сорбция на адсорбентах, включение в гидрофобные гели, ковалентное связывание с твердыми носителями. Разрабатываются и новые способы иммобилизации, такие как включение в гидрофобные копреципитаты и обработка фермента синтетическими липидоподобными реагентами. Различные методы иммобилизации липаз дают возможность получать катализаторы с широко варьируемыми свойствами [73].
Одним из наиболее распространенных методов иммобилизации ферментов является физическая сорбция на твердых носителях. Этот метод особенно перспективен для катализа реакций в среде органического растворителя ввиду нерастворимости носителя в реакционной среде. Адсорбция белков осуществляется за счет ван-дер-ваальсовых сил, гидрофобных взаимодействий, водородных связей, а также сильных ионных связей, но чаще наблюдается комбинация нескольких типов взаимодействий. В качестве носителя используют неорганические материалы (кремнеземы, оксиды алюминия, цеолиты, оксиды и гидроксиды металлов), органические полимеры (диэтиламиноэтил-целлюлоза, агароза, сефадекс) и различные синтетические полимеры (ПЭГ, полиакриламиды). Метод адсорбции очень удобен, его преимуществом является то, что, во-первых, техника получения адсорбированных на носителях белков проста, обычно достаточно смешать носитель с концентрированным раствором фермента и дать белку проникнуть в поры носителя и высушить материал (лимитирующими факторами этого процесса являются содержание фермента в растворе и емкость носителя). Во-вторых, носители для иммобилизации дешевы,
в-третьих, их возможно регенерировать, в-четвертых, фермент сохраняет высокую стабильность и активность, так как его структура после иммобилизации не изменяется.
Заметим, что фермент адсорбционно связанный с носителем должен как образовывать прочую связь с поверхностью материала, так и осуществлять превращение субстрата. Эта двойная функция многообразной структуры белковой молекулы не всегда осуществляется, так как жестко связанные белки теряют свою ферментативную активность, а слабо связанные могут десорбироваться. Поэтому к недостаткам этого метода относятся малая прочность связи белка с сорбентом, что приводит к заметной десорбции фермента при изменениях рН, ионной силы раствора, температуры и природы растворителя и возможные диффузионные затруднения, которые возникают при переносе субстрата к активному центру фермента.
Одним из наиболее распространенных адсорбентов для иммобилизации липаз является неорганический носитель цеолит (коммерческое название "Celite"). В настоящее время большое количество работ посвящено применению липаз адсорбированных на Celite для высокоэффективного катализа различных ферментативных реакций, протекающих как в водной среде, так и среде органического растворителя [74-82]. Так липаза из Pseudomonas fluorescens, иммобилизованная на Celite 545, показывает увеличение активности более чем в 7 раз в реакции этерификации 1-фенилэтанола винилацетатом в /wpem-бутилметиловом эфире по сравнению с активностью нативного фермента и в 8 раз по сравнению с активностью липазы адсорбированной на модифицированном N-октиламином силикагеле [74]. Повышение активности липазы из Pseudomonas fluorescens после иммобилизации на Celite в 22 раза в реакции этерификации 15-гидроксипентадекановой кислоты и циклопентандеканола в бензоле регистрировали в работе [77]. Применение адсорбированной на Celite панкреатической липазы для гидролиза соевого масла предложили авторы работ [78-79]. Увеличение стабильности липазы из Phizopus sp более чем в 3 раза после сорбции на Celite
фиксировали в работе [80]. Активация липазы из Pseudomonas cepacia при адсорбции на Celite в реакции этерификации олеиновой кислоты этанолом в 1.4 раза по сравнению с липазой адсорбированной на макропористом стекле (МПС) отмечалась в работе [75]. Изменение регионаправленности липазы из Rhizopus delemar после адсорбции на Celite было обнаружено в реакции гидролиза оливкового масла [81]. Иммобилизация липазы из Candida cylindracea на носитель цеолит Y описана в работе [82]. Цеолит Y был получен обработкой носителя цеолит водным раствором (NRtbSCU при 100С в течении 1 часа. Липаза, иммобилизованная на таком носителе, сохраняет 10% своей активности после 7 циклов в реакции гидролиза пальмитинового масла в микроэмульсии лектин-изоостан.
Для иммобилизации липаз методом адсорбции широко используются носители, полученные модификацией макропористого стекла (МПС). В работе [29] была изучена сорбция липазы на модифицированное различными силанами МПС, при этом наибольшую эффективность в реакции этерификации олеиновой кислоты 1-октанолом в петролеином эфире показала липаза из Rhizomucor miehe, адсорбированная на носитель с длинным алкильным радикалом (МПС обработанное октадецилметилхлорсиланом). Изучение активности липаз из Humicola lanuginose и Candida antaretica при сорбции на МПС, модифицированное дихлохметилсиланом проводили в работе [83]. Увеличение каталитической активности липазы из Candida Cylindraceae в 1.3 раза при этерификации 1-фенилэтанола гептановой кислотой в циклогексане после адсорбции на МПС, модифицированном октадецилтрихлорсиланом, и на коммерческом носителе на основе МПС - LiCrosorb RP-18 регистрировали в работе [84].
Интересные результаты по сорбции липаз на модифицированный октиламином
агарозный гель были получены авторами в работах [85-87]. Изученные липазы из 8
источников активировались в реакциях гидролиза иара-нитрофенилпропионата и
метилбутирата, причем наибольшую активность (более чем в 20 раз по сравнению с липазой,
адсорбированной на ^модифицированный агарозный гель) проявляет липазы из Humicola lanuginose. При изучении адсорбции липазы из Pseudomonas fluorescens авторы показали увеличение энантиоселективности иммобилизованного препарата и доказали преимущество адсорбции на октил-агарозный гель (увеличение активности в 1.5 раза по сравнению с нативным ферментом) по сравнению с ковалентным связыванием липазы с модифицированным глутаровым альдегидом агарозным гелем (сохранение 80% активности нативного фермента).
Адсорбцию липазы на супер тонком порошке СаСОз предложили авторы работы [88]. Липаза из Pseudomonas sp., адсорбированная на носителе СаСОз, показывает увеличение активности в 2,3 раза в реакции переэтерификации 4,7,10,13,16,19-докосангексанэтилового эфира и глицерина по сравнению с нативным ферментом. Полученный таким образом иммобилизованный препарат сохраняет 50% ферментативной активности после 5 циклов использования.
Метод иммобилизации ферментов с помощью ковалентного связывания основан на образовании химической связи между молекулами фермента и носителем (Рис.2.12). При этом важно, чтобы аминокислоты, необходимые для проявления каталитической активности ферментов, не участвовали в ковалентном связывании с носителем. Избежать этого, как правило, трудно, поэтому способ ковалентной иммобилизации обычно приводит к снижению ферментативной активности.
В настоящее время разработано большое число носителей, иммобилизация ферментов на которых происходит путем образования ковалентной связи между белком и реакционными группами носителя. К носителям, имеющим на поверхности эпоксидные группы относятся коммерческие носители Eupergit С (полученный сополимеризацией N, N'-метилен-бис-
метилакриламида, глицидилметакрилата и метакриламида) [89], VA-Epoxy-BIOSYNTH
(полученный сополимеризацией винилацетата и дивинилэтиленмочевиной) [90], Lipozyme (липаза адсорбированная на ионно-обменной смоле с одновременным химическим связыванием).
f VcH-CH2+H2N-Pr Л \_CH_CH2_NH.Pr
U Белок ^ I
Носитель Vn
Рис. 2.12 Ковалентное связывание фермента и носителя с эпоксидными группами на поверхности
Иммобилизацию липазы на носителе Eupergit С подробно изучали Вирз и др. в работе [91], доказано, что липаза иммобилизованная на таком носителе показывает высокую стабильность при энантиоселективном гидролизе эфиров, и при использовании 1 г иммобилизованного препарата возможно получать более 3 кг продукта. Предпочтение иммобилизации липаз на носителе Eupergit С перед такими коммерческими носителями как Novozyme, Lipozyme, Cephalotin и Cefotaxime в реакциях гидролиза сложных эфиров представлено в работах [91-92]. Увеличение активности липазы Pseudomonas fluorescens связанной с Eupergit С в реакции этерификации 1-фенилэтанола винилацетатом более чем в 20 и 27 раз по сравнению с липазой ковалентно связанной с аминопропилсиликагелем и с активированным глутаровым альдегидом силикогелем регистрировали в работе [74].
Карбодиимидным методом происходит ковалентное связывание липазы и при иммобилизации липазы из Pseudomonas fluorescens на полиакролеиновые микросферы [31] и при связывании липаз с модифицированными различными аминопроизводными неорганическими носителями [74,93]
Метод ковалентного связывания предъявляет очень высокие требования к структуре и свойствам носителя. С одной стороны возможна дезактивация фермента после иммобилизации, а с другой стороны, ковалентно связанный фермент не высвобождается так легко, как адсорбированный или фиксированный в структуре геля. Поэтому для избежания потери активности фермента важно, чтобы в реакцию с носителем вступали только те функциональные группы фермента, которые не играют важной роли протеканиии каталитической реакции. Авторы работы [94] описали реакции, катализируемые липазой из
Pseudomonas fluorescens в которой почти половина свободных аминогрупп белка связана с полиэтиленгликоль-трихлор-1,3,5-триазином, модифицированный таким образом фермент эффективно катализирует этерификацию и переэтерификацию и растворяется в органических растворителях: бензоле, толуоле, хлороформе, диоксане.
Получение копрецжитатов ферментов. Преципитаты ферментов можно легко получить, смешивая водный раствор фермента с органическим растворителем (например, ацетоном или этанолом), содержащим ПАВ, липиды или полимеры. Затем после удаления супернатанта препарат лиофильно сушат и используют как катализатор реакций, протекающих как в воде, так и в среде органического растворителя. Получение высокоактивных преципитатов липаз описано в работах [95-102]. В работе [95] изучена активность преципитатов липазы из Pseudomonas sp. и ПАВ различной природы в реакции этерификации лауриновой кислоты бензиловым спиртом в изо-октане. Обнаружено, что наибольшую активность имеют преципитаты липазы и неионных и амфолитных ПАВ, в то время как преципитаты липазы и анионных ПАВ не имеют ферментативной активности. Структура гидрофобной части ПАВ так же влияет на каталитические свойства преципитатов: более активны преципитаты ПАВ имеющие разветвленную структуру или двойную связь. Наиболее активным (активация более чем в 14 раз по сравнению с нативным ферментом)
является преципитат липазы и диолеилового эфира рибитола и глутаминовой кислоты (2CigA9GE), содержащий 27% липазы, причем на Імолекулу фермента приходится 170 молекул 2C]gA GE. Получение преципитатов липаз из различных источников описано в [96]: активацию более чем в 100 раз по сравнению с нативным ферментом показал преципитат липазы из Muco javanicus и 2Ci8A9GE.
О О
II II
CH3(CH2)6-CH2-CH=CH-CH2(CH2)6CH2-0-C-CHNH-C-(CHOH)4CH2OH
СНз(СН2)б-СН2-СН=СН-СН2(СН2)6СН2-0-С-(СН2)2
Рис. 2.13 Структура 2C,8A9GE
Изучение преципитации липаз с коммерческими ПАВ, такими как Span 85, Tween 85, хлоридом цетилтриметиламмония проводили в работе [97]. Преципитат липазы из Candida cylindracea и Span 85 показал увеличение активности в 72 раза в реакции этерификации гераниола и уксусной кислоты, причем с увеличением соотношения липаза: ПАВ с 0.5 до 4 увеличивалось включение фермента в преципитат и его каталитическая активность.
Авторы работы [98-99] предложили проводить поверхностную обработку липазы, смешивая водные растворы фермента и липидов. Полученный так препарат содержит 8-10 вес. % фермента и на Імолекулу фермента приходится 50-150 молекул липида. Так липаза из Pseudomonas fragi поверхность которой покрыта синтетическим липидом на основе диоктадецил-Н-О-глюко-Ь-глютамата активируется в 100 раз по сравнению с нативным ферментом в реакции этерификации 1-фенилэтанола лауриновой кислотой.
Преципитация липазы из Pseudomonas fluorescens с ПЭГ молекулярной массы 5000 была изучена в работах [100-101]. Включение липазы в преципитат ПЭГ составяет 50%,
такой препарат обладает высокой операционной стабильностью (сохраняет 71% активности в реакции лауриловой кислоты лауриловым спиртом после 3 циклов использования).
О 25 50
время, ч
Рис. 2.14 Кинетические кривые накопления продукта реакции R-фенилэтиллаурата при катализе реакции этерификации 1-фенилэтанола лауриновой кислотой препаратами липазы (І)-липаза покрытая липидом, (2)-приципитат липазы и полиэтиленгликоля, (3)-липаза на поверхности раздела вода-масло, (4)-нативная липаза
Однако, не смотря на высокую каталитическую активность преципитатов липазы, все они обладают одними недостатками, это, во-первых, дороговизна синтеза ПАВ и, во-вторых, их тяжело отделить от реакционной системы для последующего использования. Поэтому были разработаны препараты иммобилизованных ферментов полученных комбинацией адсорбции ферментов на твердые носители и преципитации [103]. Такой способ иммобилизации позволяет увеличить активность субтилизина более чем 1000 раз при сорбции на силикагеле с последующим добавлением пропанола.
2.5.2 Факторы, влияющие на активность иммобилизованного препарата.
Тип носителя. С морфологической точки зрения существует два основных класса носителей: пористые и непористые материалы. Непористые носители характеризуются низкой площадью поверхности носителя, лимитирующая количество связанного с носителем фермента, что требует увеличения количества иммобилизованного препарата. Пористые носители, особенно материалы с высокой площадью поверхности и достаточным размером пор, способны связывать значительные количества фермента, как на поверхности носителя, так и внутренней поверхности пор. При этом субстрат может глубоко проникать внутрь пор, достигая при этом активного центра фермента, а продукт легко переходит в реакционную среду. В случае непористых материалов субстрат легко связывается с активным центром фермента на поверхности материала, а продукт поступает в реакционную среду без диффузионных затруднений.
Носители можно также классифицировать по их химической природе: неорганические, органические и композиционные носители. К неорганическим носителям относятся макропористые стекла, силикагели, алюмогели, цеолиты и другие носители минерального происхождения. Последние достижения в химии полимеров позволили получать широкий ряд органических и композиционных носителей с заданными морфологическими и сорбционными свойствами, обеспечивающие наиболее эффективное связывание фермента с носителем.
Учитывая большое разнообразие носителей для иммобилизации ферментов, в настоящее время существует большое количество работ по изучению влияния свойств носителей на каталитическую активность иммобилизованного препарата. В работе [104, 105] были изучены физические характеристики таких носителей как неорганический носитель Celite, модифицированные глицерином макропористые стекла с диаметром пор 500 и 300ОА,
пористый полипропиленовый носитель с диаметром частиц 200-400 мкм, полиамидный
носитель с размером частиц от 75 до 500 мкм. В работе [29] изучали влияние диаметра пор макропористого стекла модифицированного дихлорметилсиланом на каталитическую активность липазы из Rhizomucor miehei в реакции этерификации 1-октанола олеиновой кислотой. Обнаружено, что эффективность иммобилизации липазы на таких носителях резко возрастает при увеличении диаметра пор и стабилизируется при размерах пор макропористых стекол более 100 нм. Исследование активности липазы из Rhizopus niverus при адсорбции и ковалентном связывании с носителями с различным диаметром пор проводили в работе [106]: качестве носителей использовали силикагель, модифицированный полиакриловой кислотой, и коммерческие носители на основе силикагелей. Обнаружено, что изменение размера пор носителя в большей степени происходят после ковалентного связывания фермента с носителем.
Нагрузка фермента на носитель.
Одним из важных параметров при иммобилизации ферментов является количество связанного с носителем фермента (нагрузка на носитель). Под максимальной «нагрузкой» носителя ферментом подразумевается максимальное количество фермента, которое может быть иммобилизовано на определенном количестве носителя. С одной стороны, чем выше нагрузка на носитель, тем выше скорость реакции, с другой стороны при увеличении нагрузки на поверхности носителя образуется плотный слой фермента, что приводит к уменьшению специфической активности из-за диффузионных ограничений при контакте фермента с субстратом. При низкой ферментативной нагрузке на носитель может иметь место сильное взаимодействие ферментов с поверхностью носителя вследствие инактивации молекул фермента. Таким образом, подбор оптимальной ферментативной нагрузки является важным и необходимым условием для изучения свойств иммобилизованных препаратов.
В работе [75] было изучено влияние ферментативной нагрузки липазы из Pseudomonas
cepacia, а-химотрипсина и лиазы на активность иммобилизованного препарата на основе
Celite. Обнаружено, что для представленных ферментов зависимость носит экспоненциальный характер и имеет максимальное увеличение активности при нагрузке фермента до 10мг/г Celite.
-пористый полипропиленовый носитель ЕР700
-Celite -Avicel
ферментативная нагрузка, мг фермента/г носителя
Рис 2.15. Влияние нагрузки гидроксинитриллиазы на сорбент на скорость ферментативной реакции 3-фенилпропиональдегида с гидрогенцианидом в дибутиловом эфире [108]
В работах [107-109] изучено изменение ферментативной активности и энантиоселективности ферментов после адсорбции на различные носители в зависимости от ферментативной нагрузки. Найдено, что для каждого носителя ферментативная активность иммобилизованного препарата достигает максимума и уменьшается с увеличением нагрузки на носитель (Рис.2.15-2.17). С увеличением площади поверхности носителя при низкой ферментативной нагрузке происходит инактивация фермента, а при высокой нагрузке -ферменты равномерно распределяются в тонкие слои на носителе, что приводит к уменьшению диффузионных ограничений. Таким образом, носитель с большой удельной
площадью поверхности носителя предпочтителен, так как это обеспечивает высокую степень превращения субстрата и максимальную специфическую активность катализатора.
-пористый полипропиленовый носитель ЕР700
к га
х а
| 40 о
ъ-
ферментативная нагрузка, мгфермента/гносителя
Рис. 2.16 Влияние нагрузки гидроксинитриллиазы на сорбент на энантиомерную чистоту продукта реакции 3-фенилпропиональдегида с гидрогенцианидом в дибутиловом эфире 8-2-гидрокси-4-фенилбутилнитрила [108]
ферментативная нагрузка, мг/rCelite
Рис.2.17 Зависимость ферментативной активности иммобилизованного на Celite фермента от его нагрузки на носитель для (1) - лиазы, (2)-липазы, (З)-а-химотрипсина [75].
Действие стабилизирующих агентов. Каталитическую активность могут активировать или ингибировать добавки в реакционную смесь неорганических или органических соединений. В работе [ПО] было изучено влияние добавок арабитола, сорбитола, эритритола, лактозы, декстрана, поливинилового спирта, фосфодилхлорида, бычьего сывороточного альбумина в раствор фермента перед его сорбцией на носитель Celite на активность липазы из Pseudomonas jluorescens в водной среде и в бензоле. Увеличение активности липазы в реакции лактонизации 15-гидроксипентадиеновой кислоты в бензоле наблюдали при добавлении арабитола (в 65 раз), сорбитола (в 43 раза), эритритола (в 32 раза), фосфодилхлорида (в 12 раз), лактозы (в 7 раз) и декстрана (в 2 раза). Зависимость ферментативной активности препаратов от количества вводимых добавок носит куполообразный характер и имеет максимум при добавлении сорбитола к ферменту как 180:1 моль сорбитола /моль фермента Предполагается, что вводимые спирты играют роль увлажнителя, который окружает молекулы фермента. Другими словами, положительный эффект при добавлении спиртов и фосфолипидов предполагает, что добавки сами не являются стимуляторами ферментов, но способны сохранять воду для увеличения активности фермента. Добавления сорбитола в систему липаза из Candida rugosa - Celite также увеличивает скорость реакции переэтерификации трибутирина и 2-пентана 16 раз[111]. Результаты по добавлению бычьего сывороточного альбумина, казеина, поливинилового спирта и декстрана показали, что эти полимеры ингибируют активность фермента в водной эмульсии в органическом растворителе, вероятно, подавляя флуктуации молекул ферментов необходимые для проявления активности [110].
2.6 Изучение липаз методом монослоев
В энзимологических исследованиях метод монослоев успешно применяется для изучения кинетики ферментативных реакций, протекающих на границе раздела фаз воздух-вода, и для исследования структуры белковых пленок. В работе [112] были сформулированы пять основных причин для исследования кинетики ферментативных реакций методом монослоев. Во-первых, это простота определения во время ферментативной реакции физико-химических параметров монослоя, таких как поверхностное давление, потенциал, плотность упаковки макромолекул. Во-вторых, возможность изменять свойства поверхности, зависящие от природы ПАВ, образующего монослой, а именно ориентацию и конформацию молекул, плотность упаковки молекул, поверхностный заряд и вязкость, а также возможность переноса монослоев с одной субфазы на другую. В третьих, использование баростатического контроля во время ферментативной реакции позволяет поддерживать постоянной плотность упаковки ПАВ, которая изменяется по мере накопления продукта реакции. В четвертых, монослойная техника высокочувствительная и позволяет использовать минимальное количество фермента и ПАВ, что важно при использовании редких или трудносинтезируемых ПАВ и ферментов. И в пятых, возможность изучения ферментативных реакций при использовании водонерастворимых ингибиторов и субстратоподобных ПАВ и при добавлении различных синтетических, нефизиологических детергентов.
Для изучения ферментативных реакции методом монослоев используют прибор для определения поверхностного давления, так называемые весы Ленгмюра. Весы Ленгмюра состоят из кюветы, заполненной субфазой, подвижного барьера, ограничивающего определенную площадь поверхности кюветы, и регистрирующего барьера, соединенного крутильными весами, на лимбе которых регистрируется давление, создаваемое монослоем, находящимся между подвижным и регистрирующим барьерами. Оценкой поверхностного
давления служит изменение поверхностного натяжения систем с ПАВ и без ПАВ. Для
проведения реакции фермент растворяют в водной фазе, находящейся в кювете весов Ленгмюра, а субстрат наносят на ее поверхность в количестве, соответствующем образованию монослоя. Скорость ферментативного гидролиза определяют путем регистрации изменения площади, занятой субстратом на поверхности раздела фаз при заданном поверхностном давлении с течением времени. В общем случае гидролиз ПАВ, липидов и других липидоподобных субстратов сопровождается отщеплением жирных кислот, при растворении в водной фазе которых происходит уменьшение площади монослоя субстрата.
Впервые технику монослоя для изучения механизма межфазной активации липаз применил Дервишиан [113]. В качестве субстрата липазы из Arhizus rhizopus использовался дикарпин, в этой системе между изотермами поверхностное давление - площадь на молекулу в монослое и активностью липазы при различных площадях на молекулу субстрата прослеживалась четкая корреляция. Причем в координатах скорость липолиза/площадь на молекулу субстрата - поверхностное давление зависимость носит колоколообразный характер с постоянной максимальной скоростью в области 10<7t<30 мН/м. Из этих данных следует, что каждая пара "субстрат - фермент" характеризуется оптимальным значением двумерного давления, при котором скорость липолиза достигает максимального значения.
Для объяснения эффекта зависимости скорости липолиза от поверхностного давления
существует две основных теории: "субстратная теория" и "ферментативная теория".
Согласно первой теории, увеличение активности ферментов связано с концентрацией,
гидратацией и конформацией (идеальное расположение молекул в двумерной системе)
субстратов в монослоях [114]. Так высокая концентрация субстратов в монослоях является
основным фактором видимого увеличения скорости катализа, однако, скорость реакции
уменьшается при поверхностном давлении >25 мН/м для панкреатической липазы или
фосфолипазы, когда концентрация субстрата значительно выше чем при давлении <25 мН/м.
Поэтому, было доказано, что на липолиз влияют также физические свойства субстрата и
особенно фазовое состояние субстрата на поверхности раздела фаз. В работе [115] было
показано, что максимальная активность фосфолипазы Аг на фосфолипидах с различной
длиной цепи наблюдается когда монослой находится в области между жидко-растянутым и
жидко-конденсированным состоянием.
Напротив, "ферментативная теория" межфазную активацию фермента объясняет
конформационными изменениями в молекуле фермента при адсорбции ее на поверхность
Активация липаз на поверхности раздела фаз
Впервые активация липазы на поверхности раздела фаз была описана Вилыитеттером в 1924 году при изучении гидролиза тристеарина [24]. Однако в то время считалось, что растворимые эфиры также являются субстратами липаз. Позже Сарда и др. [25] выдвинули гипотезу, постулировавшую, что для липазы действие на поверхности раздела является не только типичным, но и составляет ее сущность. При изучении катализируемого панкреатической липазой гидролиза сложных эфиров, ограниченно растворимых в воде (триацетин, метилбутират), было обнаружено, что активность фермента по отношению к истинному раствору субстрата низка. При повышении концентрации субстрата до значений, превышающих предел растворимости, субстрат образует эмульсию, что сопровождается резким возрастанием ферментативной активности (Рис.2.3) [26]. Резкое возрастание активности липазы по отношению к трикапроину при превышении предела растворимости субстрата наблюдалось также в работе [27]. Рис.2.3 Зависимость скорости гидролиза триацетина под действием панкреатической липазы (1) и эстеразы из печени (2) от концентрации субстрата. За единицу концентрации субстрата принята концентрация его насыщенного раствора.
Активация липазы наблюдается не только под действием эмульсии субстрата, но и в случае, когда в реакционной смеси присутствуют инертные гидрофобные поверхности. Так Брокман и сотр. [28] обнаружили 1000-кратное возрастание скорости липолиза трипропионина (в истинном растворе) при введении в реакционную смесь силиконизированных стеклянных шариков. Увеличение активности фермента наблюдается при иммобилизации липаз на поверхность макропористого стекла различного размера [29], полиуретановых [30] и полиакролеиновых частиц [31].
На Рис.2.4 представлена гипотетическая модель ориентации липазы на поверхности раздела фаз. Согласно этой модели, присоединение фермента к поверхности масляной капельки (суперсубстрату) достигается на суперсубстратном связывающем участке, гидрофобной головке. Этот участок не только связывает фермент с субстратом, но и обеспечивает точную ориентацию субстрата. Реакционный участок находится вблизи гидрофобной головки, но отделен от нее. Такое устройство обеспечивает совмещение субстрата и активного центра, однако, липофильное фермент-субстратное связывание исключается, и при этом слева открыт доступ для воды, которая необходима для гидролиза ацилфермента. Соответствующая ориентация молекулы липазы, возможно, еще больше стабилизируется за счет полярных или заряженных аминокислотных или углеводных остатков, которые образуют гидрофильный хвост молекулы [32].
Кинетическое описание реакций, катализируемых лиолитическими ферментами, имеет ряд особенностей. Так, поскольку «естественные» субстраты этих ферментов нерастворимы в воде, понятие «концентрация субстрата» в данном случае не имеет смысла, так как действию фермента доступны лишь те молекулы субстрата, которые расположены на поверхности раздела фаз. При неизменных молекулярных концентрациях субстрата и фермента скорость реакции оказывается различной в зависимости от степени дисперсности субстрата. Более целесообразно при рассмотрении реакций липолиза выражать концентрацию субстрата в виде отношения площади поверхности раздела к объему водной фазы. В этом случае кинетика липолиза подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, причем значения ккат и Кт могут быть определены из экспериментальных данных. Однако величина Кт, которая для гомогенных фермент-субстратных систем служит мерой сродства субстрата и фермента, в данном случае не имеет однозначного физического смысла, поскольку образованию фермент-субстратного комплекса предшествует адсорбция на поверхности фаз.
Получение и свойства коприципитатов липазы с гидрофобными соединениями с одинаковой длиной гидрофобного радикала
Было найдено, что присутствие липазы из Pseudomonas fluorescens при осаждении 1,2-гексадекандиола (HDD), соединения содержащего концевую диольную группу и длинный алифатический радикал, в водно-ацетоновой среде приводит к ее преципитации. Лиофилизованные копреципитаты липазы с HDD могут быть использованы для катализа как в водной среде так и в /ире/я-бутилметиловом эфире. В составе преципитатов липаза проявляет высокую каталитическую активность в реакции этерификации 1-(R,S)-фенилэтанола винилацетатом в /wpe/и-бутилметиловом эфире и превосходит активность исходного фермента в 6 раз. Каталитическую активность липазы и ее копреципитатов в органическом растворителе определяли в реакции этерификации рацемического 1-(R,S)-фенилэтанола винилацетатом в ги/?е/я-бутилметиловом эфире. В среде трет-бутилметилового эфира липаза катализирует ацетилирование только R-формы спирта при этом энантиомерная чистота продукта реакции составляет более 99% [70] (рис.3.1). О 9Н Ч /\ Липаза (/ \ ОН I -СН3СОН ! + ТГ - 1 + 1-(К,8)-фенилэтанол винилацетат 1-(К)-фенилэтилацетат 1-(8)-фенилэтанол Модельная реакция для определения этерификационной активности липазы
В ходе работы была разработана методика определения этерификационной активности ферментов методом высоко эффективной жидкостной хроматографии. Разделение исходных веществ 1-(11,8)-фенилэтанола, винилацетата и продукта 1-фенилэтилацетата происходит по принципу обращенно-фазовой хроматографии. В стандартных условиях обращенно-фазовой хроматографии, т.е. при элюции в изократической системе (вода - ацетонитрил 1:1) на носителе с октадецильными группами прочнее удерживается вещество, гидрофобность которого выше. Поскольку гидрофобность увеличивается в ряду 1-(Д8)-фенилэтанол, винилацетат, 1-(RS)-фенилэтилацетат, соответственно увеличивается и время удерживания этих соединений на колонке: 5.9, 6.2 и 13.5 мин, соответственно (рис. 3.2). Содержание 1-(R,S)-фенилэтилацетата в реакционной смеси определяли по площади хроматографического пика в координатах оптическая плотность - время с учетом известного молярного коэффициента поглощения єгво = 80 М"1 см"1. Сопоставление результатов по содержанию 1-(К8)-фенилэтилацетата, зарегистрированного изложенным методом и с помощью газовой хроматографии, показало, что различия не превышают 3%.
Указанный эффект активации липазы при преципитации представлял интерес как в практическом плане так и сам по себе, поскольку аналогичная активация фермента наблюдалась до сих пор только при соосаждении липазы со сложными липидоподобными соединениями [95-102].
В связи с этим было изучено соосаждение липазы с различными органическими соединениями, содержащими небольшие полярные группы и длинный углеводородный радикал. С целью оптимизации процесса соосаждения было изучено влияние его условий на включение липазы в преципитаты HDD. Копреципитаты липазы получали смешением водного раствора фермента с растворенными в ацетоне гидрофобными соединениями. Данные представленные в таблице 3.1 показывают распределение гидролитической активности между преципитатом и надосадочной жидкостью при различных условиях
Из данных таблицы следует что, во-первых, перемешивание препятствует связыванию липазы с HDD, и, во-вторых, увеличение количества HDD в преципитате улучшает эффективность иммобилизации, но при этом ферментативная активность иммобилизатов резко падает. О включении небелковых компонентов препарата липазы в состав преципитата можно судить по увеличению его веса (220 мг преципитата образуется при использовании 100 мг HDD). Максимальная активность преципитата достигается при весовом соотношении липаза : HDD равном 10:1 в условиях инкубирования в течение 24 часов при температуре 6С без перемешивания.
Получение копреципитатов липазы с другими гидрофобными веществами проводили аналогично получению копреципитата липазы с HDD. Были использованы соосадители липазы с одинаковой длиной гидрофобного радикала - Сіб, но различающиеся концевой функциональной группой: N-цетиламин (Се№їг), N-цетилацетамид (СеАА), цетиловый спирт (СеОН), а также РВМА. Максимальное включение фермента (более 99%) в копреципитаты было обнаружено при осаждении CeNH2 (табл. 3.2). Этот эффект можно объяснить вкладом электростатического взаимодействия между положительно заряженными частицами Се№І2 (рК=10.61) [137] и отрицательно заряженными молекулами липазы (pl=4.46) [138]. Эффективность включения липазы в копреципитаты убывает в ряду соосадителей CeNH2 - РВМА - HDD - СеОН - СеАА. Заметим что в случае СеОН в супернатанте обнаруживаются очень мелкие частицы копреципитата, которые не седиментируют в стандартных условиях его выделения, поэтому содержание белка в копреципитате (80%) является лишь ориентировочным. Другая закономерность наблюдается при определении каталитической активности копреципитатов в реакции гидролиза триацетина. Гидролитическая активность липазы в копреципитатах сохраняется не полностью и убывает в ряду соосадителей HDD - СеИНг - СеАА - СОН - РВМА. Только в копреципитате с HDD наблюдается некоторая активация (в 1,13 раза) липазы.
Наиболее яркие результаты были получены при определении активности вышеуказанных копреципитатов в реакции этерификации в органическом растворителе. При катализе реакции ацетилирования 1-(118)-фенилэтанола винилацетатом различными копреципитатами липазы во всех случаях наблюдалась значительная активация по сравнению с действием нативного фермента (табл.3.2, рис. 3.4). Этерификационная активность копреципитатов фермента уменьшается в ряду соосадителей СеАА - CeNtk -HDD-PBMA-CeOH.
Изучение взаимодействия липазы с гидрофобными соединениями с одинаковой длиной гидрофобного радикала
Все изученные нами гидрофобные соединения такие как СеАА, СеЫНг, HDD, СеОН способны образовывать стабильные монослои на границе фаз вода-воздух, то есть являются ПАВ. Изотермы зависимости поверхностного давление о(г площади, приходящейся на молекулу ПАВ в монослое (А), приведены на рис.3.10. Видно, что для представленных ПАВ изотермы их монослоев имеют качественно различный характер. Указанные различия связаны с взаимодействием гидрофильной части молекул с водной фазой, поскольку гидрофобные части молекул ПАВ одинаковы (-С]б). Давление коллапса для изученных ПАВ составляет около 48 мН/м для СеАА, СеОН и HDD и 37 мН/м для СеЖІ2, что свидетельствует об их относительной устойчивости на границе раздела вода-воздух [141]. При указанных давлениях коллапса, т.е. в условиях максимально плотной упаковки гидрофобной части молекул, площади приходящиеся на молекулу для монослоев СеОН, HDD, СеАА и CeNH2 составляют 0.19, 0.17, 0.16 и 0.14 нм2, соответственно. Другая последовательность значений наблюдается в области жидко-растянутого состояния монослоев: так при7г=5 мН/м площадь на молекулу уменьшается в ряду CeNH2, HDD, СеАА и СеОН, и составляет, соответственно, 0.40, 0.34, 0.28, 0.25 нм2. Увеличение площади монослоя для ПАВ свидетельствует об уменьшении степени упорядоченности молекул в монослоях, что связано с различием в полярности гидрофильных головок ПАВ. Из представленных ПАВ только монослой СеОН образует конденсированный монослой с очень малой сжимаемостью, что позволяет предположить наличие перпендикулярной ориентации молекул СеОН относительно поверхности раздела фаз при поверхностных давлениях более 10 мН/м, причем средняя площадь молекулы СеОН составляет 0.23 нм2, т.е. определяется ее углеводородной частью, сечение которой по литературным данным составляет 0.22 нм2 [142].
Для оценки взаимодействия липазы с ПАВ мы изучали сорбцию белка на монослои ПАВ из объема ванны весов Ленгмюра. В отличие от традиционных исследований монослоев липидов и ПАВ с белками [143] формирование монослоя проводили непосредственно на растворе белка, а не вносили белок в субфазу после образования монослоя ПАВ. Такая техника позволяет наблюдать равномерное распределения белка в пленке, что было доказано ранее на примере цитохрома С методом флуоресцентной микроскопии [144].
Наиболее удобным для изучения влияния концентрации белка в субфазе на изменение площади монослоя ПАВ после встраивания белка является контроль изменения площади смешанного монослоя при постоянном давлении (рис.3.11-3.14). При 10мН/м используемые нами ПАВ стабильны и сохраняют свои параметры в течение Ічаса при заданном постоянном давлении. Первоначальное резкое падение площади на молекулу во времени (менее 2 мин) связано со сжатием монослоя подвижным барьером до достижения постоянного давления 10 мН/м. Заметим, что наиболее стабильным является монослой СеОН и далее СеАА, HDD и CeNHj, для которых изменение площади монослоя после сжатия до 10 мН/м равно, соответственно, 1, 2.5, 6.2, 17% (таб.3.4). Уменьшение площади на молекулу для монослоев индивидуальных ПАВ можно объяснить процессами взаимной переориентации ЇІХ молекул, что приводит к уравновешиванию и более плотной упаковке молекул в монослое. Так монослой СеОН при заданном давлении (лг=10 мН/м) находится в конденсированном состоянии и характеризуется минимальным изменением площади монослоя, а для СеІМНг, в монослое которого в области давлений 9-12 мН/м наблюдается переход из жидко-растянутого в жидко-конденсированное состояние монослоя, при давлении 10 мН/м наблюдается значительное изменение площади.
Изучение взаимодействия липазы с соединениями с различной длиной гидрофобного радикала
Полное изменение структуры смешанного монослоя по сравнению с монослоем индивидуального ПАВ наблюдается для CeNH2 (рис.3.19). Это связано с электростатическими взаимодействиями, которые препятствуют плотной упаковке молекул в смешанном монослое, и с тем, что на монослой CeNH2 адсорбировалось наибольшее количество липазы. Смешанный монослой липаза-СеКНг является наиболее прочным и характеризуется давлением коллапса 48 мН/м, что значительно превышает давление коллапса для монослоя индивидуального Се№Ъ (35мН/м). Стабилизирующее действие липазы на монослой СеЖЬ, связанное с электростатическим притяжением между разноименно заряженными молекулами, мы отмечали, обсуждая изменение площади приходящейся на молекулу при постоянном давлении (таб.3.4). Нужно отметить, что монослой индивидуального СеІМНг при давлении около 10 мН/м переходит из жидко-конденсированного в жидко-растянутое состояние, а затем при давлении около 20 мН/м монослой переходит в высокоорганизованное конденсированное состояние. Подобные эффекты не наблюдаются у смешанного монослоя. Так до 35 мН/м, т.е. до давления коллапса монослоя индивидуального СеЫНг, смешанный монослой характеризуется жидко-конденсированным состоянием, которое, вследствие выдавливания части белковых молекул в субфазу, переходит в конденсированное. Таким образом, включение белка в монослой CeNH2 не только изменяет структуру смешанного монослоя, но и увеличивает его прочность и стабильность. Полученные данные имеют много общего с результатами, представленными в работе [145] по образованию комплексов глюкозоксидазы и липидов на границе фаз вода-воздух. В результате присоединения катионной головной группы липида к отрицательно заряженной поверхности глюкозоксидазы образовывался комплекс, состоящий из 150-250 липидных молекул на 1 молекулу глюкозоксидазы. Комплекс содержал 24% белка по весу и получался с выходом 84%, в то время как незаряженный липид образовывал комплекс с глкозоксидазой с содержанием белка 3% и выходом 30% .
Об образовании ассоциатов липаза-ПАВ мы также можем судить по изменению электрических свойств монослоя. За ориентацией молекулярных электрических диполей в монослое наблюдают по изменению поверхностного потенциала (AU). Для представленных ПАВ разность AU между потенциалом смешанного монослоя липаза-ПАВ и потенциалом монослоя индивидуального ПАВ составляет 45, 60, 70, 190 мВ для СеОН, HDD, CeNH2 и СеАА, соответственно. Как указано выше, гидрофобные части молекул ПАВ одинаковы, поэтому (AU) определяется природой взаимодействия белка с гидрофильной головкой ПАВ. Наибольшее (AU), а, следовательно, и диполь-дипольное взаимодействие, наблюдается при включении липазы в монослой СеАА, а наименьшее -СеОН. Это соответствует данным по увеличению площади на молекулу смешанного монослоя по сравнению (ДА) монослоя индивидуального ПАВ (рис.3.15).
Ранее (п.3.2.1) методом монослоев нами было изучено влияние природы гидрофильной части ПАВ на их взаимодействие с ферментом. Неменьший интерес представляет изучение этим же методом влияния длины гидрофобного радикала на взаимодействия ПАВ с липазой. Изучаемые соединения имеют одинаковые гидрофильные группы: -NH2 или -NH-C(0)-CH3, но различаются длиной гидрофобной части -Сп, -Сіб, -Сі8. Все эти соединения соосаждаются с липазой с образованием высокоактивных биокатализаторов (п.3.1.2).
На рис. 3.20 представлены изотермы зависимости поверхностного давления от площади, приходящейся на молекулу, для N-алкилацетамидов с различной длинной гидрофобного радикала. Эти соединения образуют стабильные монослои на границе фаз вода - воздух. При давлении коллапса равном 45, 48 и 52 мН/м площадь на молекулу составляет 0.93, 0.16 и 0.15 нм2, соответственно для С АА, СеААи CisAA. Различия в структуре монослоев связаны с длиной гидрофобного радикала. При наибольшей длине радикала -Ci8 монослой характеризуется высокоорганизованным конденсированным состоянием. С уменьшением длины радикала уменьшается плотность упаковки молекул в монослое и, следовательно, монослой СеАА при невысоких значениях поверхностного давления имеет жидко-растянутую структуру, которая при увеличении поверхностного давления переходит в конденсированную. Монослой с наименьшей длинной радикала -Сп во всем интервале поверхностного давления характеризуется жидко-растянутым состоянием.
Похожие диссертации на Изучение каталитических свойств липаз, иммобилизованных в гидрофобных средах
