Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор свойства и клиническое применение ТБГ, факторы влияющие на протекание эмбрио -и канцерогенеза
1.1. Выделение ТБГ 8
1.2. Структура ТБГ и его физико-химические свойства 10
1.3. ТБГ - подобные соединения 17
1.4. Аналоги ТБГ у животных 18
1.5. Синтез, локализация и биологические функции ТБГ 19
1.6. Роль ТБГ при физиологической беременности 24
1.7. Диагностическое значение ТБГ при невынашивании беременности 25
1.8. Функционирование системы гемостаза, аитифосфолипидный синдром 29
1.9 Роль гормонов в процессе беременности их связь с ТБГ 45
1.10. Особенности ферментативной активности лейкоцитов у женщин с привычным невынашиванием 63
1.11. Влияние ТБГ на иммунную систему беременных женщин 66
1.12. Новое направление в лечении бесплодия - экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов в полость матки 74
2. Материалы и методы исследования 79
2.1, Отбор и формирование групп 79
2.2. Методы исследования 80
3. Результаты и обсуждение 95
3.1. Микрометод ИФА ТБГ и использование его в клинической практике 95
3.2. Сравнительный анализ определения ТБГ и ХГ 105
3.3. Диагностическая ценность ТБГ при патологии трофобласта 106
3.4. ТБГ в программе экстракорпорального оплодотворения 109
3.5. Физиологическая роль ТБГ в системе гемостаза при беременности 113
3.6. Влияние аутоиммунных нарушений на показатели гемостаза и уровень ТБГ 124
3.7. Взаимосвязь гормональной активности и уровня ТБГ при физиологической беременности 133
3.8. Динамика гормональной активности при патологии беременности и их корреляционная связь с ТБГ 148
3.9. Изучение иммунологической значимости ТБГ 154
3.10. Влияние метаболических процессов на продукцию ТБГ 165
3.11. ТБГ - как индикатор эффективности лечения 169
4. Заключение 188
5. Выводы 192
6. Литература 195
7. Приложение 242
- Синтез, локализация и биологические функции ТБГ
- Особенности ферментативной активности лейкоцитов у женщин с привычным невынашиванием
- Микрометод ИФА ТБГ и использование его в клинической практике
- Влияние аутоиммунных нарушений на показатели гемостаза и уровень ТБГ
Введение к работе
Известно, что малипшзация клеток сопровождается появлением специфических веществ, отличающихся от компонентов нормальных клеток. Некоторые из этих соединений используются в практической онкологии как маркеры, т.к. они могут секретироваться из опухолевой ткани в кровоток и обнаруживаться различными иммунохимическими методами. При дальнейшем исследовании этих опухолевых маркеров выяснилось, что они во многом родственны эмбриональным, поэтому их отнесли к семейству онкофетальных антигенов (ОФА). Изучение их строения и свойств представляет значительный интерес не только для понимания молекулярных механизмов перерождения нормальной клетки в злокачественную, но и для решения практических целей. А именно - диагностики беременности и рака, дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных новообразований, наблюдением за гестациоипым процессом, течением трофических заболеваний и эффективностью лечения, а также для выявления онкозаболеваний среди больших групп населения с повышенным риском заболевания (Татаринов и др., 1987; Винницкий и др., 1990; Bohn, 1983; Косяков и др. 1985; Uhlendruck, 1986). Важность изучения ОФА определяется их гликопрртеиновой природой, так как показано, что имеются существенные различия в углеводосодержащих антигенах нормальных и неопластических клеток (Yamada et al., 1979; Feizy 1985). Вероятно, именно антигены этого вида дадут возможность понять процессы малигнизации и существенно улучшить диагностику и терапию он козаболевани и.
В настоящее время в России значительно возросла патология репродуктивной системы женщин. Процент нормальных родов снижается, что влечет за собой развитие неблагоприятных тенденций в состоянии здоровья новорожденных детей (Кулаков, 2002, 2003). В Приморском крае из всех беременных 36% страдают анемией, 35% поздними гестозами. Число нормальных родов едва достигает 17-28% (Гельцер и др., 2004) Решающая роль в комплексе мероприятий по профилактике различных заболеваний принадлежит пренатальной диагностике, предусматривающей регулярное наблюдение за женщинами в течение всей беременности и включающей обязательное определение содержания в крови беременных женщин специфических маркеров беременности.
Трофобласт - специфический бета 1 - гликопротеин (ТБГ) является одним из представителей онкофетальных антигенов. Он обнаруживается при беременности и при патологиях трофобласта злокачественного характера (Татаринов и др., 1970; Bohn, 1971; Tatarinov et al., 1974). Считается, что на протяжении нормально протекающей беременности ТБГ в достаточной степени отражает процессы становления и функционирования фетопрлацентарной системы (ФПС), что и позволяет использовать этот маркер для контроля за гестационным процессом.
В настоящее время достаточно полно описаны физико-химические и иммунохимические свойства этого гликопротеина (Bohn et al., 1976; Engval, 1980; Heinkinhemo et al., 1983; Rosen et al., 1986; Мороз, 1986; Павленко, 1989; Chan et al., 1991; Plouzcc et al., 1991; Brophy ct al.,1992; Chen et al.,1992), но биологическое значение синтеза ТБГ при беременности и в опухолях до конца не изучено. В литературе значительное внимание уделяется практическим аспектам использования ТБГ в клинической практике (Посисеева, 1986; Богданович и др., 1990; Победииский и др., 1991; Александрова и др., 1994; Шмагель, 1995). Имеются литературные данные, свидетельствующие о нарушении синтеза ТБГ при плацентарной недостаточности (Мамедалиева, 1991), гестозе (Кулаков и др., 1999), внутриутробной патологии и гипоксии плода (Ismail ct al., 1992; Qin et al., 1997; Gardner et al., 1997), у онкологических больных (Татаринов и др., 1976; Калашников и др., 1979). Практически отсутствуют работы, отражающие влияние биохимических и иммунохимических процессов на синтез ТБГ. Вместе с тем, значение этого гликопротеипа для развития гестациопного процесса ни у кого не вызывает сомнений, поэтому дальнейшее исследование роли ТБГ может существенно расширить границы его использования в диагностике и прогнозировании успешного завершения беременности.
Исходя из вышесказанного, цель настоящей работы состояла в изучении взаимосвязи биохимических и иммунохимических процессов с синтезом ТБГ при нормально протекающей и осложненной беременности, а также проведении комплексного исследования уровня секреции ТБГ в сравнении с гемостазиологическими, биохимическими, иммунологическими параметрами беременных женщин, проживающих в Приморском крае. Исследования проводились в первой половине беременности, т.к. около 80% реподуктивных потерь происходит в 1 триместре беременности (Сиделышкова, 2001).
В задачу исследований входило:
1. Провести клинические испытания разработанной тест-системы определения концентрации ТБГ (ТБГ-тест) при физиологической и осложненной беременности, а также при онкопатологии трофобласта.
2. Изучить динамику уровня ТБГ, показателей гемостаза, гормонов, метаболизма и иммунитета при физиологической беременности (ФБ) и угрозе невнашивания беременности (УНБ) первой половины гестациопного срока, а также у группы женщин, вступивших в программу ЭКО.
3. Установить закономерности успешного наступления беременности в зависимости от содержания ТБГ в бластоцистах и семенной жидкости.
4. Определить пределы физиологических колебаний биохимических, гемостазиологических, иммунных параметров крови и мочи беременных женщин. Найти корреляционную зависимость между ТБГ и биохимическими, гемостазиологическими, иммунными параметрами крови и мочи беременных женщин.
5. Изучить реактивность иммунокомпетентных клеток не беременных здоровых женщин, женщин с ФБ и УНБ.
6. Изучить влияние ТБГ, хитозана, каррагинаиа на свертывающую и антисвертывающуго системы in vitro.
7. Установить основные закономерности влияния проводимой терапии па продукцию ТБГ.
8. Провести апробацию разработанной тест-системы на основе лектинов для дифференциальной диагностики беременности и онкопатологии.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 18 рисунков и 22 таблицы; диссертационный материал изложен на 244 страницах. Список литературы содержит 432 источника.
Основные результаты исследований являются частью плановой научно-исследовательской работы, проводившейся в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (зав лаб., д.х.н, Лукьянов П.А.) и клинико-диагностической лаборатории МО ДВО РАН (зав. лаб. Рябова Н.Н.).
Синтез, локализация и биологические функции ТБГ
Активный синтез ТБГ осуществляется в синцитиотрофлбласте (Tatarinov et al., 1976; Home et al., 1976, Sasagava et al., 1987; Takayama et al., 1988). В незрелой плаценте ТБГ обнаруживается в цитоплазме цитотрофобластов и сипцитиотрофобластов хориона, в зрелой плаценте гликопротеин локализован в остаточном трофобласте фибршювых отростков, могущих содержать некротические трофобластические клетки. Кроме того, ТБГ локализован на внешней поверхности плазматических мембран микроворсинок, на апикальных плазматических мембранах внутри визикул. В клетках опухоли хориоиэпителиомы (трофобластического происхождения) присутствует мембранный и плазматический ТБГ (Tatarinov et al., 1976). Изучена локализация ТБГ в нормальних и опухолевых клетках нетрофобластического происхождения, осуществляющих эктопический синтез ТБГ. Так он обнаружен в цитоплазме и в составе поверхностных мембран гранулоцитов, моноцитов, опухолевых клеток миеломоноцитарного происхождения, в гранулах эндоплазматической сети ампиотической жидкости, в клетках цистоаденокарциномы яичника (Heikinhemo, 1987; Гудима и др., 1993). Недавние исследования показали, что ТБГ присутствует в ряде эктопических участков клеток периферической крови и костного мозга (Blomberg et al., 1998). Подробно о локализации и продукции ТБГ изложено в работе Гудима с соавт. (Гудима и др., 1993). Полученные данные свидетельствуют о существовании внутриклеточного цитоплазматического, мембранного и секреторного антигена. В зависимости от локализации ТБГ способен выполнять различные биологические функции в организме: угнетать или усиливать пролиферацию клеток (Гудима и др., 1993), участвовать в процессах межклеточного узнавания (Watanabe et а!., 1988), контролировать процесс развития и дифференцировки (Ногпе,1976), активировать или угнетать иммунологические реакции (Кривоносое и др., 1978; Головистиков и др., 1987; Сухих, 2003; Шмагель, 2003), связываться со стероидными гормонами (Bohn et al., 1973, 1991; Кривоносов и др., 1993).
Показано, что препараты ТБГ обладают фосфатазной активностью (Moras et al., 1992; Гафуров, 1999) при действии in vitro на низко- и высокомолекулярные субстраты ДНК. Эти данные, а так же сведения о значительном увеличении содержания ТБГ с развитием беременности (Посисеева, 1980; Мамедалиева и др., 1991; Побединский и др., 1991) позволяют предположить, что ТБГ может играть значительную роль как регулятор роста плацентарных клеток. Синтез ТБГ in vitro клетками трофобластического и иного происхождения может быть связан с процессами клеточной дифференцировки. Об этом могут свидетельствовать результаты изучения секреции ТБГ в процессе дифференцировки in vitro клеток цитотрофобласта в синцитиотрофобласт (Kato et al., 1989). Химические агенты, такие, как бутират натрия и ретиноевая кислота способны вызывать дифференцировочные изменения в клетках in vitro. Они могут индуцировать биосинтез ТБГ в клетках, где этот процесс ранее не наблюдался, или стимулировать биосинтез и секрецию ТБГ в клеточных системах с определенным уровнем продукции опкофетального антигена (Ileikinhemo et al., 1987; Chon et al., 1981; 1983; Asser et al., 1988). Клетки амниотической жидкости и моноциты крови (Heikinhemo et al., 1987) демонстрируют значительный уровень синтеза ТБГ именно при культивировании in vitro, a in vivo либо не синтезируют этот плацентарный белок, либо синтезируют его в малых количествах. Этот феномен также может быть связан с неиндуцировашюй дифференцировкой in vitro. N-терминальиая область всех известных, полипептидов семейства ТБГ содержит RGD-трипептид. Это позволяет секреторному ТБГ участвовать в процессах межклеточного узнавания и контролировать процессы адгезии, развития и дифференцировки (Watanage et al., 1988). Наличие RGD-пептида объективно допускает присутствие специфических рецепторов к секреторному ТБГ на клетках мишенях биологического действия ТБГ. Имеются сведения (Посисеева, 1980), что ТБГ участвует в транспорте железа. Показано (Bohn et al., 1973; Terenjev et al., 1981), что ТБГ связывает 17 - бета - эстрадиол и кортизол. Кривоносов С.К. с соавт. (Кривоносов и др., 1993) обнаружили, что ТБГ взаимодействует с циклопентапергидрофенантреновыми производными (холестерином, тестостероном, прогестероном, эстрадиолом, эстроном) и некоторыми их синтетическими аналогами (синестролом, диэтилстильбестролом). Было установлено, что наиболее высокой аффинностью характеризовалось взаимодействие ТБГ с эстрогенами. Однако биологическая роль установленного феномена осталась неясной. Есть предположение (Westergard et al., 1979; Aser et al., 1988), что ТБГ может участвовать в углеводном процессе, однако отмеченные ранее (Tatra et al., 1976) сдвиги в содержании ТБГ в крови после введения глюкозы и инсулина очень незначительны. Предполагаемое (Павленко, 1989) строение молекулы ТБГ позволяет объяснить его быстрое исчезновение из крови беременных женщин, так как достаточно одного разрыва, чтобы часть молекулы ТБГ с эпитопами, присущими только ей, превратилась в большие агрегаты и в значительной степени утратила свою активность.
Рядом авторов (Gemy et al., 1977; Гуляиский и др., 1987) показана иммуиосупрессивная активность ТБГ. Обработка лимфоцитов очищенными препаратами ТБГ подавляет пролиферативный ответ сенсибилизированных лимфоцитов в смешанной культуре (Татаринов и др., 1988). Это указывает пе только на супрессорпое действие ТБГ, по и на наличие у него сродства к клеточным рецепторам на поверхности лимфоцитов. Рецепторы к ТБГ па поверхности Т-лимфоцитов были обнаружены, в том числе и на супрессорах (Ts-лимфоцитах) (Сотникова и др., 1985, 1987). Показано (Гудима и др., 1993) избирательное влияние ТБГ на пролиферативную активность клеточных линий различного происхождения. В низких концентрациях ТБГ способен резко усиливать спонтанную пролиферацию клеток Jurkat, угнетать их Кон - А зависимую пролиферацию, ингибировать активность натуральных киллеров и незначительно снижать экспрессию поверхностного антигена Т-лимфоцитов Эффект зависит от количества клеток-мишеней и продолжительности их культивирования в присутствии ТБГ. Обусловленная ТБГ иммуиосупрессия, вероятно, может реализовываться через макрофагальное звено, что было показано в опытах in vitro.
Мышинный рекомбинантный PSG18 при добавлении к мышиным перитонеальным макрофагам вызывал экспрессию интерлейкина 10 (IL-10). Исследователи считают (Wessels et al., 2000), что способность ТБГ стимулировать продукцию 1L-10, является важным механизмом поддержания беременности. Это мнение подтверждается данными, полученными у женщин с привычным невынашиванием (Arnold et al., 1999), согласно которым синтез ТБГ и связанная с ним продукция IL-10 достоверно снижены по сравнению с соответствующими показателями при физиологическом развитии беременности. ТБГ, воздействуя на макрофаги, может принимать активное участие в перестройке иммунной системы.
Биологическая роль ТБГ в развитии злокачественного процесса подробно не изучена. Однако отмечено, что женщины, у которых при раке молочной железы иммунногистохимическим методом в ткани опухоли не обнаруживается ТБГ, имеет лучший прогноз, по сравнению с теми женщинами, у которых он был найден. Было показано, что концентрация ТБГ в низкодифференцированпых карциномах выше, чем в высокодифференцированиых (Калашников и др., 1979).
Особенности ферментативной активности лейкоцитов у женщин с привычным невынашиванием
Известно, что даже самые незначительные функциональные сдвиги в организме происходят при соответствующих измененияхметаболизма, а ранние этапы развития патологических процессов реализуются на уровне мембранных структур клеток (Саркисов, 1988; Мамедалиева и др., 1990). В патогенезе плацентарной недостаточности (ПН) важная роль принадлежит изменениям метаболизма, лежащим в основе патологии плода и новорожденного. Самой доступной информативной средой, которая выражает не только патологические отклонения, но и особенности функциональных реакций, являются лейкоциты периферической кровн, свидетельствующие о ранних сдвигах в организме (Нарциссов, 1969).
В клинической цитохимии интенсивность метаболизма лейкоцитов характеризуется, в частности, активностью сукцииатдегидрогепаз (СДГ), альфа-глицерофосфатдегидрогеназ (а-ГФДГ) и гидролаз: щелочной фосфатазы (ЩФ), кислой фосфатазы (КФ). Определение этого комплекса ферментов дает возможность охарактеризовать в лейкоците звенья, которые принимают участие в дыхании, гликолизе, в процессах метаболизма (глицерофосфатный шунт, цикл Кребса). Изменение цитохимических показателей часто опережают морфологические и биохимические сдвиги в крови, т.е. они более информативны, чем морфологический состав крови (Куликова и др., 1989). Мамедалиева с соавт. (Мамедалиева и др., 1991) исследовали ферментативную активность лейкоцитов у женщин с привычным выкидышем в анамнезе, и пришли к выводу, что у них отмечается низкий уровень ТБГ, отсутствие его роста в динамике. Это и послужило поводом для выяснения зависимости между ферментативной активностью лейкоцитов, косвенно отражающих состояние метаболических процессов в организме матери, и ТБГ, используемого для ранней диагностики формирующейся ПН.
Устойчивость ферментативного статуса лейкоцитов в первые недели беременности в зпачителыюй степени определяется ферментативной активностью до беременности (Шищенко, 1988). Имеются некоторые сведения (Куликова и др., 1989; Мамедалиева и др., 1991) о характере метаболизма лейкоцитов при нормальном менструальном цикле у здоровых женщин и женщин с привычным выкидышем. В этих работах использован количественный цитохимический анализ лимфоцитов и пейтрофилов периферической крови. Авторы (Куликова и др., 1989; Оганесян, 1989; Мамедалиева и др., 1991) изучали активность следующих ферментов: -СДГ — «маркера» активности митохондрий и показатель энергетических процессов в цикле Кребса; -ГДФГ (митохондриальная) - фермент, определяющий взаимосвязь процессов гидролиза и дыхания, а также принимающий участие в метаболизме фосфолипидов; -КФ и ЩФ, катализирующие отщепление фосфата из его эфиров и играющих значительную роль в метаболизме. СДГ играет важную роль в процессе переноса водорода при отщеплении его от углеводов при их аэробном окислении. Активность этого фермента в хориалыюм эпителии отмечена уже в ранние сроки беременности (Мамедалиева и др., 1990). К 12 неделе активность этого фермента достигает максимума и сохраняется до конца беременности. Установлена прямая корреляционная зависимость между уровнем фосфатазной активности иейтрофилов (ФАН) и уровнем 17 - оксикортикостероидов (17-ОКС) в моче. Увеличение ФАН при беременности объясняют (Оганесян, 1989) высоким уровнем эсрогенов в крови. Наряду с гормональной регуляцией ФАН, существует другой тип гуморальной регуляции, осуществляемой эндогенными продуктами распада ткани и веществами бактериального происхождения. Повышение активности ЩФ в системе нейтрофильных лейкоцитов следует рассматривать как проявление защитно-приспособительных процессов, которые имеют исключительно большое значение в развитии, течении и исходе беременности (Frei et al., 1964; ІІІубич и др., 1980). Для женщин с привычным выкидышем из группы риска по развитию фетоплацентарной недостаточности (ФПН) - характерна низкая энергетика метаболизма (Мамедалиева и др., 1991). Так как ТБГ характеризует состояние фетоплацентарной системы (ФПС), то представляет большой интерес проведение сравнительного анализа уровня ТБГ и ферментов в лейкоцитах и нейтрофилах при угрозе выкидыша. Шищенко с соавт, (Шищенко, 1988) показали, что снижение активности ферментов клеток крови у женщин с привычным выкидышем может оказаться важным фактором для ранней диагностики благополучного течения беременности или прогноза развития ФПН у этих женщин. В практическом отношении это существенно в связи с возможностью раннего, еще до наступления беременности, проведения реабилитационных мероприятий под контролем цитохимических исследований, при этом оптимальным будет планирование беременности на фойе достигнутого нормального уровня ферментативной активности лейкоцитов и иейтрофилов. Результаты исследований, проведенных Мамедалиевой с соавт. (Мамедалиева и др., 1991) по изучению динамики ТБГ у женщин с привычным выкидышем из группы высокого риска развития ФПН, показали, что регуляторное применение метаболической терапии на ранних сроках и на протяжении беременности оптимизирует белок - синтезирующую функцию плаценты. Это проявляется в достоверном повышении содержания ТБГ до показателей нормально протекающей беременности, при этом изучение динамики изменения уровня ТБГ позволяет оценивать адекватность проводимой терапии. Адекватная терапия способствует нормализации уровня ТБГ. Таким образом, определение ТБГ может быть использовано как скрининговый тест для ранней диагностики и прогнозирования формирующейся ФПН у женщин с привычным выкидышем, а также для мониторинга ФПН при помощи ранней и регулярной метаболической терапии у женщин, имеющих изменения в цитохимических показателях: СДГ, а - ГФДГ, ІЦФ и КФ.
Иммунобиологическое отношение в системе мать-плацента-плод при нормальной и патологической беременности во многом определяются особенностями гистофизиологи ческой характеристики внезародышевых органов, в частности плаценты, функция которой заключается в инициировании и обеспечении иммунологической толерантности систем материнского и плодового организма. Плацента, а именно трофобласт считается главным органом, реализующим механизм, предотвращающим отторжение плода. Вещества, синтезируемые плацентой, оказывают влияние на различные компоненты иммунокомпетентной системы матери, подавляют активность лимфопоэза и блокируют рецепторы воспринимающих клеток, способствуют развитию и дифференцировке иммунокомпетентной системы плода (Федорова и др., 1986, Ширшев, 1999; Сухих и др., 2003). Плацента оказывает иммунорегуляторное действие за счет своих специфических агентов, к числу которых относится и ТБГ. Он является мощным биологически активным агентом, тормозящим функции иммунокомпетентных тимус - зависимых клеток, стимулирует супрессорные Т-клетки (Головистиков и др,, 1985). Иммунологически активные субстанции ТБГ сорбируются мембранами клеток трофобласта, создавая в комплексе с ХГ, альфа - ФП и ПЛ зону биологической защиты фетоплацентариого комплекса от действия клеточных и гуморальных компонентов иммунной системы матери (Цирелытиков, 1979).
Микрометод ИФА ТБГ и использование его в клинической практике
Быстрая и точная диагностика беременности и онкологических заболеваний трофобласта является одной из актуальных проблем в акушерстве и гинекологии. В последние годы чаще стал использоваться иммупохимическии тест диагностики беременности, основанный на определении ТБГ в сыворотке крови.
ИФА является в настоящее время одним из наиболее популярных методов клинической диагностики. Исследования по разработке и применению ИФА для количественного определения ТБГ были начаты в ЛХНИ ТИБОХ ДВО РАН совместно с клинико-диагностической лабораторией МО ДВО РАН в 1985 году. Первая тест-система была представлена на Всесоюзном симпозиуме «Иммунобиотехнология-87» в г. Таллинне. В 1994 году был предложен микрометод ИФА для определения ТБГ в сыворотке капиллярной крови (Богданович, 1994), не уступающий по точности, специфичности и чувствительности, ранее предложенным стандартным методам ИФА (Калашников и др., 1984; Богданович и др., 1987), по позволяющий сократить расход реагентов, время проведения анализа и заменить венозную кровь капиллярной. В настоящее время метод имеет следующие характеристики: чувствительность определения - I нг/мл; область определения — 1-100 нг/мл; объем пробы для анализа -100 мкл. Оптимальная концентрация антител к ТБГ для нанесения на планшет составляет 10мкг/мл, оптимальное разведение коньюгата- 1:1000.
Надежность метода проверяли тестом на открытие. Определенные количества ТБГ добавляли к нормальной человеческой сыворотке с известным содержанием ТБГ. Процент открытия находился в пределах 94-100%, Надежность метода -удовлетворительная, т.к. коэффициент вариации не превышал 10%, Степень воспроизведения определяли для трех образцов контрольной сыворотки с высоким, средним и низким содержанием ТБГ. Коэффициент вариации во всех случаях не превышал 4,8%. Специфичность тест-системы устанавливали добавлением в стандартные калибровочные разведения ТБГ различных препаратов (лютроиин, фоллитропин, пролактин, хориогонин). Все они не влияли на уровень ТБГ. В таблице 4 приведены результаты определения ТБГ микро- и стандартным методом у женщин с ФБ и УНБ. Данные, полученные микро- и стандартным методом, отличаются незначительно, и статистически достоверны (р 0,02; р 0,05). У неберемепных женщин концентрация ТБГ не превышала 0,01 мкг/мл. Результаты двух количественных методов хорошо согласуются (табл. 4), уменьшение реагентов, сокращение времени инкубации и замена венозной крови капиллярной не ухудшило качество тест-системы. Микрометодом ИФА ТБГ обнаруживали со 2-3-й недели беременности у 55% женщин, с 3-4-й недели у 82% и с 4-5-й недели у 100%. В ранний период беременности (3-5 недель) уровень ТБГ варьировал от 0,35 мкг/мл до 4,48 мкг/мл. По мерс увеличения срока беременности содержание его в сыворотке капиллярной крови резко возрастало (табл. 5) и к 20-й неделе составляло 53,8 мкг/мл, что позволяло судить не только о наличии беременности, но и косвенно — о её сроке. Установлены показатели нормы и их границы в 95% доверительном интервале для каждой недели гестации (табл.5). Полученные данные в группе с ФБ несколько отличались от норм, предложенных другими авторами (Посисеева, 1986; Мамедалиева, 1991; Побединский; 1991; Шмагель и др., 2003). Это объяснялось использованием в ТБГ-тесте препарата ТБГ со степенью чистоты 99%. Как показано в таблице 5, с нрогрессированием беременности отмечался еженедельный динамический рост уровня ТБГ. Наиболее интенсивный еженедельный прирост его наблюдался в период до 5-6-й недели. После 16-й недели, когда практически плацента уже сформировалась, прирост ТБГ происходил уже не так энергично, по динамический рост его, тем Fie менее, продолжался. Прогрессивное повышение уровня ТБГ в ранние сроки беременности можно объяснить активной пролиферацией трофобласта и активным синтезом синцития по мере «созревания» плаценты. При нормальном или несколько повышенном содержании ТБГ беременность успешно прогрессировала и имела благоприятный прогноз для матери и плода. В тех же случаях когда уровень ТБГ в 2-3 недели беременности был «пороговый» и составлял 0,015-0,02мкг/мл, проводили повторное исследование через неделю для подтверждения отсутствия или наличия беременности (маточной, внематочной, анаэмбрионии). Время появления ТБГ и его содержание в сыворотке крови в ранние сроки беременности зависело от места прикрепления эмбриона. Имплантация эмбриона в полость матки сложный, многоступенчатый процесс, регуляция которого осуществляется при помощи большого количества гуморальных факторов вследствие разнообразных межмолекулярных и межклеточных взаимодействий. Ранее появление ТБГ в сыворотке крови и интенсивный прирост его каждую неделю свидетельствовал об успешной имплантации и становлении симбиотических взаимоотношений эмбриона и материнского организма. В группе женщин с УНБ также отмечалось увеличение уровня ТБГ, но его еженедельный прирост был значительно пиже. У женщин с положительным прогнозом уровень ТБГ был снижен на 18-48% (рис. 4, ряд 2), У женщин с неблагоприятным прогнозом не наблюдалось заметного роста концентрации ТБГ и уровень его значительно снижался (сначала на 37-48% рис. 4, ряд 3; а далее, у 54% женщин на 62-86%; рис. 4, ряд 5, 6, 7) по сравнению с нормой для данного срока. В этой группе беременность прогрессировала только у 46% женщин, замершая беременность обнаруживалась в период 8, 12, 16-й недели и в более поздние сроки на 25-30-й недели. В 86% случаев отмечалось нарушение функции трофобласта: начинающееся отслоение, дистрофические и дегенеративные изменения, подтвержденные УЗИ. При УНБ возможно как понижение (рис. 4), так и повышение ТБГ в материнской крови по сравнению с уровнем, характерным для данного срока ФБ,
Влияние аутоиммунных нарушений на показатели гемостаза и уровень ТБГ
Полученные в ходе исследования данные показывают, что при гемостазиологическом исследовании уже в 1 триместре беременности у женщин с положительной реакцией на ВА была выраженная гиперактивность тромбоцитов (агрегация 11 ±2 сек., при норме 16 + 2 сек.). К 20 неделе беременности у 18,4% женщин этой группы на фоне проводимого лечения отмечается сочетание патологической активности тромбоцитов с гипср коагуляцией, не характерной для данного срока беременности - статистически достоверно (р 0,05) укорочение АВР на 12%, АЧТВ на 6%, повышение ПИ до 96,2 + 1,14% и концентрации фибриногена до 3,58 + 0,12 г/л по сравнению с показателями при ФБ. У большинства отмечалось появление маркеров внутри сосудистого свертывания РФМК 4,8 +0,8 мг %, а также снижение активности АТ III до 79,6 + 2,3% и протеина-С до 80.2 + 6,3% по сравнению с показателями при ФБ (ПИ 93,8 + 2,8%; фибриноген 3,19 ± 0,31 г/л; РФМК 3,5 ± 0,5 мг %; АТ-Ш 95 + 2,8%; протеии-С 106,8 + 6,8%о). В то же время склонность к птокоаіуляции, на фоне проводимого лечения, была обнаружена к 20 неделе беременности у 21% беременных женщин с выявленными ранее ВА. Об этом свидетельствовали удлинение АЧТВ, АВР, уменьшение ПИ. Указанные изменения сочетались со снижением АТ-Ш до 80,2 + 1,8%», протеина-С до 81,5% + 4,3% и повышенным содержанием в крови РФМК. У остальных беременных женщин (60,5%) с ранее выявленным ВА в результате контролируемой проти вотромботической терапии удалось добиться относительной стабилизации гемостаза - нормализации ПИ до 92,1 +0,98%, фибриногена до 3,12 + 0,11 г/л, снижение агрегации тромбоцитов, РФМК и достоверное нарастание активности АТ-Ш на \5% (р 0,05), протеина-С на 28% (р 0,05). У 17 человек наблюдалась продолжительная ремиссия па ВА-отринательные тесты к 20 педеле беременности. 129 Используя наиболее распространенные тесты, мы обнаружили, что антитела к ВА в небольших концентрациях могут образовываться иод воздействием инфекционных агентов, что согласуется с данными других авторов (Агаджанова, 1999). При динамическом исследовании этих женщин отмечено, что ВА-тест у одной и той женщины может давать и слабо положительный, и отрицательный результат. После проведения лечения от обнаруженного инфекционного агента ВА-тест дважды давал отрицательный результат. Следовательно, такое антител ообразован ие не являлось аутоиммунным процессом и носило приходящий характер. В данном случае инфекционный фактор играет, скорее всего, провоцирующую роль. При истинном АФС концентрация антител высокая и тесты на ВА всегда дают положительные или слабо положительные результаты. Тем не менее, частота встречаемости выявленных инфекций в этой группе составила 58%. После проведения антибактериальной и/или антивирусной терапии у данной группы женщин не отмечалась нормализации коагуляционных тестов (отсутствия ВА) и показателей гемостаза, что подтверждало наличие АФС. На сегодняшний день доказанным является повреждающее действие вирусной инфекции на сосудистый эндотелий и, в частности, на изменение ламинарной конфигурации фосфолипидных мембран клеток па гексогональнуїо, что, возможно, запускает выработку антифосфолипидных антител (Макацария и др., 2000).
Изменения в гемостазе крови беременных женщин при АФС приводили к нарушению маточно-плацентарпого и фетоплацеитарного кровотоков (подтверждено методом доплерометрии). Вероятно, неполная инвазия трофобласта, пристеночный тромбоз, фибриноидный некроз, нарушение синтетической функции синцития приводит к резкому снижению продукции ТБГ. Особую ценность приобретает определение содержания ТБГ с 3-х недель беременности с интервалом 2 педели. Низкий уровень ТБГ зависит, видимо, от действия определенных аутоаитител к фосфолипидам (КЛ, ФХ, ФХ и ФС) на состояние гемостаза, который в свою очередь оказывает влияние па формирование плаценты и свойства сипцитиотрофобласта и трофобласта. При наличии инфекции у женщин с выявленным ВА уровень ТБГ был значительно ниже, что, по-видимому, связано с частичной гибелью трофобласта. Подтверждением нарушения формирования трофобласта являлось снижение гормоносинтетической функции (отмечено снижение белково-пептидиых и стероидных половых гормонов). Определение уровня ТБГ позволяет своевременно диагностировать незначительные изменения в синцитии и служит косвенным критерием состояния фетоплацентарпон системы, а так же возможного ухудшения в маточно-плацентарном кровотоке за счет активации тромбоцитарного звена гемостаза, усиленной адгезии тромбоцитов к эндотелию сосудов плаценты и дальнейшего дисбаланса в системе гемостаза матери, спровоцированного антителами к ВА. Результаты исследования показали, что с ранних сроков беременности у больных с АФС сначала отмечается повышение функциональной активности тромбоцитов, снижение белоковосинтезирующей функции плаценты. Далее присоединяется птеркоагуляция в плазменном звене гемостаза и появление маркеров внутрисосудистого свертывания (РФМК), а также снижение активности АТ-ІИ и протеина-С, что ведет к нарастанию нарушений в микроциркуляторном русле, дальнейшему развитию фето плацентарной недостаточности, более резкому снижению ТБГ, хронической гипоксии и гибели плода. Наличие инфекции ускоряет этот процесс. Включение в биохимический скрининг и динамическое исследование системы гемостаза, уровня ВА и ТБГ у беременных с АФС поможет повысить эффективность раннего выявления поражения плаценты, нарушений внутриутробного состояния плода, а так же прогнозировать течение беременности и оценить эффективность лечебных мероприятий. При УНБ различные клетки собственного организма и трофобласта беременных женщин могут выступать в роли аутоантигенов. В последнее время появились единичные сообщения в отечественной литературе о роли аутоантител к ХГ, как возможного фактора нарушения репродуктивной функции человека (Пономарева и др., 1995; Сидельникова и др., 1996; Кирющенков и др., 1996). В первой половине ФБ уровень ТБГ увеличивался (рис. 9) при наличии невысокого титра антител к ХГ Ig G класса - 94 + 8 ед. и Ig М класса - 130 + 16 ед., т.е. уровень антител находился в пределах отрицательных и в некоторых случаях слабоположительных значений. Отмечалось незначительное увеличение уровня антител к ХГ к 11-12-й и к 20-й неделе беременности (рис. 9), хотя другие авторы (Кирющенков и др., 1996), обнаруживали максимальное значение к 12-14-й неделе. Как видно на рис. 9, уровень антител меняется волнообразно и напоминает кривую уровня ХГ, только пики менее выражены и их подъем повторялся с задержкой на неделю по сравнению с подъемом уровня ХГ.
