Введение к работе
Актуальность проблемы. Важнейшим направлением биотехнологии является получение целевых продуктов с помощью микроорганизмов. Представляет интерес использование в качестве продуцентов хемолитотрофных бактерий, энергетическим субстратом которых служит водород. Человечество все чаще обращается к использованию Нг, как экологически чистого и возобновляемого источника энергии. Расширение масштабов использования энергии водорода открывает возможности внедрения все большего количества биотехнологий с использованием этого субстрата.
Перспективными продуцентами целевых продуктов являются бактерии Wautersia eutropha (Alcaligenes eutrophus) Z-1 и Seliberia carboxydohydrogena Z-1062, ввиду их быстрого роста на газовых субстратах, содержащих водород.
Конструктивный обмен и фиксация СОг у данных бактерий реализуются в цикле Кальвина. Их энергетическая система состоит из полной цепи переноса электронов и ферментов, окисляющих водород - гидрогеназ. Единственными общими соединениями для катаболизма и анаболизма являются НАДН и АТФ, которые образуются при окислении водорода и потребляются при фиксации СОг и на путях синтеза макромолекул.
Эффективность использования энергетического субстрата определяется уровнем сопряжения систем катаболизма и анаболизма и функциональным состоянием энергетической системы бактерий, которая является центральным звеном регуляции метаболизма. Для получения высокого выхода целевого продукта с эффективным использованием субстрата необходимо знать, как условия среды при культивировании бактерий влияют на состояние энергетической системы клеток. Воздействие на этом уровне может положительно влиять на эффективность биотехнологических процессов. Для управления режимом культивирования водородокисляющих бактерий Wautersia eutropha Z-1 и Seliberia carboxydohydrogena Z-1062 существенно знать, как меняются гидрогеназная активность и концентрации цитохромов в их клетках, а также энергетическая эффективность их роста при изменении параметров газового субстрата.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение влияния условий газового питания на активности гидрогеназ и концентрации цитохромов в клетках Wautersia eutropha Z-1 и Seliberia carboxydohydrogena Z-1062 с учетом энергетической эффективности их роста, а также оценка перспектив биотехнологического применения гидрогеназ.
Для этого было необходимо решить следующие задачи:
-
Исследовать влияние концентраций Нг, СОг и 02 в культуральной среде на уровень активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 и энергетическую эффективность роста культуры.
-
Исследовать взаимосвязь уровня активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках с другими физиолого-биохимическими
характеристиками культуры (удельной скоростью роста, эффективностью использования субстратов и конструктивным обменом бактерий).
-
Изучить динамику активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов, а также других физиолого-биохимических параметров клеток W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 в зависимости от концентрации моноксида углерода в газовом субстрате.
-
Определить условия культивирования, положительно влияющие на активность гидрогеназ в клетках данных бактерий.
-
Оценить биотехнологический потенциал препаратов гидрогеназ W.eutropha для разработки систем детекции водорода и восстановления НАД1".
Научная новизна работы. Впервые исследована динамика активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 в зависимости от условий культивирования. Установлено, что наибольшие активности гидрогеназ достигаются при лимитировании роста бактерий по энергетическому субстрату; наименьшие — при ингибировании кислородом. Максимальные концентрации цитохромов характерны для клеток, выращенных при лимитировании роста по Ог, а наименьшие - при ингибировании 02. Установлено, что повышение гидрогеназной активности и концентраций цитохромов при лимитировании роста по Нг не сопровождается снижением эффективности использования энергии водорода. Установлена специфическая СО-устойчивость W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062: под воздействием токсиканта в клетках возрастает гидрогеназная активность и концентрации цитохромов, а также укрепляется мембранный аппарат. Эти изменения сопровождаются снижением эффективности использования энергии водорода при сохранении белковой направленности конструктивного обмена бактерий.
Практическая значимость. Установлены параметры процесса культивирования, позволяющие получать партии биомассы W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 с высокой гидрогеназной активностью (до 11 и 5 U / мг белка для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ W.eutropha Z-1 и 2 U / мг белка для гидрогеназы S.carboxydohydrogena Z-1062). Определены условия, при которых в присутствии СО возможен устойчивый и продуктивный рост этих бактерий; результатами обоснована возможность их выращивания на водородсодержащих субстратах, получаемых конверсией природного газа или переработкой углей. Показана пригодность аналитической системы, содержащей НАД-зависимую гидрогеназу W.eutropha Z-1, редуктазу и люциферазу, для детекции водорода (с точностью до 0,1 нмоль в пробе). Показана пригодность иммобилизованных в альгинатный гель высокоактивных по гидрогеназам клеток W.eutropha Z-1 для использования в системах восстановления НА/Г/.
Положения, выносимые на защиту:
1. Реакция W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 на изменение условий газового питания включает изменения их гидрогеназной
активности и концентраций цитохромов, сопровождающиеся изменением энергетической эффективности роста.
-
W.eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 способны к росту на газовом субстрате, содержащем СО в концентрациях до 20% без изменения биохимической направленности синтеза за счет адаптивных изменений: повышения синтеза гидрогеназ и цитохромов, усиления мембранного аппарата. При этом удельные траты энергетического субстрата возрастают (предельное увеличение - в 1,4-1,9 раза при 20% СО).
-
Препараты НАД^-зависимой гидрогеназы и биомасса клеток W.eutropha Z-1 перспективны для создания систем регистрации водорода и восстановления НАД*.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 7 съезде Всес. микробиол. общества (Алма-Ата, 1986), 4 съезде Всес. конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Всес. конференции. "Биоконверсия-88" (Рига, 1988), Всес. конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино, 1989), Всес. конференции. "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино, 1989), 4-м Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), 5-м Международном конгрессе по экологии микроорганизмов (Киото, 1988), семинарах Института биофизики СО РАН (1986-2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 6 в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах текста, содержит 38 рисунков и 24 таблицы. Список цитируемой литературы включает 269 источников, из которых 180 иностранных.
Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н., проф. Т.Г. Воловой за неоценимую помощь в работе над диссертацией, д,х.н., проф. В.О. Попову (Институт биохимии РАН), к.б.н. ПС. Кстачевой, к.б.н. В.Н. Петушкову, к.б.н. О.А. Могильной, В.Ф. Плотникову за сотрудничество при проведении работы.
